Summary
Viral-abgeleitete Peptide gekoppelt an Antikörper-Konjugate (ACs) ist ein Ansatz, der Schwung durch das Potenzial der molekularen Nutzlasten mit erhöhten Tumor Zelle Ansammlung zu liefern. Gängige Methoden zur Bewertung Peptid Konjugation, AC und Nutzlast intrazelluläre Akkumulation und Tumor gezielt nutzen, unterstützt dieses Protokoll Forscher während der wichtigen ersten Entwicklungsphasen.
Abstract
Antikörper-Konjugate (ACs) modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide sind eine potentiell mächtige Klasse von Tumor Zelle Zusteller für molekulare Nutzlasten verwendet in der Krebsbehandlung und Bildgebung durch erhöhten zellulären Akkumulation über aktuelle ACs. Während des frühen AC in Vitro sind Entwicklung, Fluoreszenztechniken und Radioimmunoassays ausreichend zur Bestimmung intrazelluläre Lokalisation, Anhäufung Effizienz und Ziel Zelle Spezifität. Derzeit gibt es keinen Konsens über standardisierte Verfahren zur Herstellung von Zellen für die Bewertung der AC intrazelluläre Akkumulation und Lokalisierung. Die ersten Tests der ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide ist kritisch, vor allem, wenn mehrere Kandidaten gebaut wurden. Bestimmung von intrazellulären Akkumulation durch Fluoreszenz Hintergrundsignal von ACs an der Zelloberfläche betroffen Sie sein können und erschweren Sie die Interpretation der Akkumulation. Für Radioimmunoassays in der Regel behandelte Zellen fraktioniert und die Radioaktivität in andere Zelle Fächer gemessen. Jedoch Zelle Lysis variiert von Zelle zu Zelle und oft Kern- und zytoplasmatischen Kompartimente sind nicht ausreichend isoliert. Dies kann irreführende Daten über Nutzlast Lieferung Eigenschaften führen. Die intravenöse Injektion des radioaktiven Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs im Tumor mit Mäusen gefolgt von Radionuklid Bildgebung ist eine leistungsfähige Methode für die Bestimmung der Tumoreigenschaften targeting und Nutzlast Lieferung während der in-Vivo -Phase des Entwicklung. Aber dies ist eine relativ neue Zuführung und einige Gruppen haben Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs auf diese Weise ausgewertet. Wir beschreiben die Verarbeitung der behandelten Zellen genauer bewerten Virus abgeleitet Peptid-modifizierte AC Akkumulation bei der konfokalen Mikroskopie und Radioimmunoassays Verwendung. Eine Methode zur trypsinizing Zellen, Zellenoberfläche entfernen gebunden insbesondere ACs. Wir bieten auch eine Methode zur Verbesserung der zellulären Fraktionierung. Dieses Protokoll sieht schließlich eine in-Vivo -Methode mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) für die Bewertung der ersten Tumor gezielt Eigenschaften in Tumor-tragenden Mäusen. Wir verwenden das Radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) als ein Beispiel Nutzlast in diesem Protokoll.
Introduction
Antikörper-Konjugate (ACs) sind Biopharmazeutika, die in eine transformative Klasse von wirksamen Medikamenten zur Verbesserung der Krebs-Behandlungen sowie zur Erkennung von Tumoren fällig sind. Bestehend aus ein monoklonaler Antikörper (mAb) konjugiert, molekulare Nutzlasten wie Radioisotope, kleine Moleküle und biologische Toxine, ACs sind in der Lage, diese Nutzlasten an Krebszellen mit exquisiten Ziel Antigen Affinität und Spezifität zu liefern. Damit ACs haben das Potenzial, deutlich reduzieren unspezifische Toxizität und Nutzlast Aktivität bei der Tumor-Website zu erhöhen. Therapeutisch, wurden ACs Transport von zytotoxischen kleinen Molekülen (gemeinhin als Antikörper-Wirkstoff-Konjugate) zugelassen für die Behandlung von Patienten mit Brustkrebs und Hodgkin Lymphom, die konventionelle Behandlungen 1, gescheitert 2. ACs Transport von Radioisotopen (allgemein als Radioimmunoconjugates bezeichnet) sind darüber hinaus auch in der Entwicklung. Eine AC Transport von Radioisotopen für die Bildgebung ist zur Identifizierung von Prostatakrebs Metastasen 3zugelassen. Mit vielen mehr therapeutische ACs Zulassung 4beantragt ist Optimismus für die Zukunft des ACs zu Krebs Pflege 5hoch.
Dennoch, bei der Chemotherapeutika oder Radioisotope ACs haben Schwierigkeiten, die effektiv sammeln diese Nutzlasten in Zielzellen. Dieser Aspekt trägt wesentlich in vielen Fällen in der Unfähigkeit des ACs zu lang andauernde krankheitsfreien Überlebens oder kontrastreiche Tumor imaging- 6,7. In der Regel sobald ACs binden ihre Ziel-Antigen sind sie durch einen Prozeß bekannt als Rezeptor-vermittelte Endozytose internalisiert. ACs sind dann in Endosomen gefangen und verschleppt, Lysosomen für Abbau und Nutzlast release 8. Die intrazelluläre Menschenhandel Prozess stellt Herausforderungen an ACs eine hohe Nutzlast Spezifität und Wirksamkeit gegen Krebszellen zu erreichen. Zum Beispiel viele Antigene wie Her2 (Ziel für therapeutische AC Trastuzumab-Emtansin) kann bis zu 85 % der gebundenen Antikörper in den ersten 30 min 9recyceln. Darüber hinaus nach Verschlechterung auftritt, können freigegebene Chemotherapeutika und Radioisotopen aktiv durch erhöhte Expression/Aktivität der Membran verbundenen Transport Proteine 10,11oder exportiert werden. Lysosomen Abbau hemmt auch die Lieferung der neuartige biologische Nutzlasten wie therapeutischer Enzyme und Oligonukleotide, die sein können deaktiviert 12,13. Im Wesentlichen ist die Krebszelle sehr effektiv bei der Aufhebung der notwendigen intrazellulären Akkumulation von Nutzlasten von ACs geliefert.
Dieses Protokoll beschreibt die Umsetzung des Konzepts der ACs-gekoppelt an Virus-abgeleitete Peptide, speziell für Endosom Verlockende Falle zu entkommen und Lokalisierung in den Zellkern. Mit solcher Raffinesse, Host Zellsysteme zu manipulieren ist es nicht verwunderlich, dass die Entwicklung des Virus abgeleitet Proteine und Peptide als potenzielle Biopharmazeutika lange tief in therapeutische Forschung 14 verwurzelt hat. Seit Millionen von Jahren haben Viren entwickelt, um eine außergewöhnliche Sammlung von Proteinen in der Lage, normale physiologische Säugerzelle Systeme nutzen, um effektiv Wirtszellen geben erwerben. Für Viren, die über Rezeptor-vermittelte Endozytose internalisiert werden, stehen sie auch vor der Herausforderung mit Flucht vor Menschenhandel zu den Lysosomen wo kann der Ansturm der eine lokalisierte Konzentration von Proteasen problematisch für das Überleben sein. Eine gut charakterisierten virale abgeleitet Peptid genutzt bei der Medikamentenabgabe zu entkommen Endosom Einklemmung ist das Humane Immundefizienz-Virus Transaktivator Transkription (Tat) Protein 15. Tat ist in der Lage, Endosom Einklemmung durch Sensierung niedrigen pH-Wert an welcher Stelle auftreten, Protein-Konformationsänderungen förderliches Tat sich einfügen und stören die Endosomal Membrane 16zu entkommen. Dies führt zu Tat-Nutzlast Konjugate Zytoplasma zugreifen. Das zweite virale Manipulation Element im Zusammenhang mit diesem Protokoll ist der Ansatz verwendet, um therapeutische Gene und Drogen zum Kern 17liefern. Viren haben entwickelt, um Host Cell Maschinen für voran durch die Kernpore Komplex (NPC) auf der Durchreise vorbei die Kernmembran erfolgreich zu manipulieren. Zelluläre Makromoleküle enthalten (oder binden an Proteine, die enthalten) nukleare Lokalisierung Signale (NLSs) notwendig für die Bindung zu nuklearen transportieren Proteine (z. B. Karyopherins α und β), die die erforderlichen Bewegungen durch den NPC zu bieten. Viren haben Proteine um NLS-Sequenzen enthalten, die ihnen die Fähigkeit, Host Zelle Transportproteine für pendelt in der Kern- 18Nutzen bieten entwickelt.
Zahlreiche ACs haben zuvor mit Tat und NLS-abgeleitete Peptide funktionalisiert und getestet für ihre Fähigkeit, Krebszellen zu sammeln und gezielt Tumoren 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (Tabelle 1). Studien, die Bereitstellung von zytotoxischen Nutzlasten haben gezeigt, dass ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide sind zellulären Akkumulation, Zytotoxizität und Tumor töten über unveränderte ACs 22,26deutlich erhöhen. Ein gemeinsames Merkmal für diese neuartige Klasse von AC ist konstruktionsbedingt. Peptide enthalten in der Regel ein terminal Cystein bietet eine kostenlose Sulfhydryl-Gruppe. MAbs wird zuerst mit einem Noncleavable bifunktionelle Vernetzer mit N- Hydroxysuccinimide (NHS) und Maleimide Gruppen an den entgegengesetzten Enden reagiert. Die NHS-Ester reagieren mit primären Aminen auf die mAb, Amid-Bindungen zu bilden. Reagierte mAb mit frei Maleimide Gruppen wird dann mit den Sulfhydryl-Gruppen auf die Peptide bilden eine Thioester-Bindung und damit verknüpfen das Peptid und mAb reagiert. Obwohl Homobifunctional Vernetzer verwendet 28gewesen, Heterobifunctional Vernetzer werden häufiger verwendet, in den Bau des Virus abgeleitet Peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Dieses Protokoll verwendet speziell der Vernetzer Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC) für seine Benutzerfreundlichkeit und da es in der zugelassenen Antikörper-Wirkstoff-Konjugat Trastuzumab-Emtansin und in vielen verwendet wird Virus-abgeleitete Peptid-ACs 8,22,23,26,31,32. Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist die primäre Methode zur Bestimmung zunächst Konjugation Effizienz und für semi-Quantifizierung der Anzahl der Peptide pro mAb. Konfokale Mikroskopie mit einer Fluoreszent-markierten Sekundärantikörper spezifisch für die mAb ist in der Regel die Methode zur Bewertung der zunächst intrazelluläre Verteilung Eigenschaften des Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs. Radioisotope sind bisher, die primäre Nutzlasten von Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs geliefert. Radioisotope sind vorteilhaft, weil die Radioaktivität in den Zellen leicht durch Gamma zählen quantifiziert ist. Darüber hinaus bieten die ACs, die Maus-Modellen der menschlichen Krebserkrankungen übersetzt werden Forscher mit der Fähigkeit zur Bewertung Tumor gezielt mit molekularen Bildgebungsverfahren wie single Photonenemission Computertomographie und Positronen-Emissions-Tomographie (PET) berechnet 23 , 32 , 33. die Konstruktion und Validierung Testmethoden, die hauptsächlich von Forschern bietet im Allgemeinen eine sehr gute Bewertung des ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide während der ersten Entwicklungsphase effektiv eingeben und liefern die Nutzlast in Zielzellen und Ziel Tumoren.
Tat - und NLS-modifizierte ACs haben beleuchtete Schlüsselbereichen Nutzlast Lieferung innerhalb Krebszellen und Tumoren weiter zu verbessern. In Bezug auf ACs NLS geändert kann die Effizienz in der intrazellulären Akkumulation bescheidene 23,31,34. Ineffiziente intrazelluläre Ansammlung verursacht durch fortgesetzte Endosomal Einklemmung. Ausrichtung in Vivo Tumor kann auch mit beiden Tat und NLS-modifizierte ACs vermindert werden. Die aktiven Sequenzen von Tat und NLS enthalten mehrere positiv geladene Rückstände. Wenn mAbs angeschlossen, kann die insgesamt kationische Ladung deutlich erhöhte 35sein. Als Folge haben der Tat - und NLS-modifizierte ACs erhöhte Aufnahme in gesundes Gewebe und schnelle Blut Abstand erhöht.
Unsere Gruppe entwickelt eine zusammengesetzte Verbindung bestehend aus Cholsäure verbunden mit NLS (ChAcNLS; ( Abbildung 1). ChAcNLS-modifizierte ACs sind in der Lage zu erhöhen intrazelluläre Akkumulation von gelieferten Radioisotopen und Tumor targeting im Vergleich zu NLS modifiziert und traditionellen ACs 33,34. Der Mechanismus hinter Cholsäure ist inspiriert von der Fähigkeit des ausgewählten nonenveloped Viren, die auf Membranfusion Cholsäure Endosom Flucht durch die Bildung von Ceramid auslösen nutzen nicht verlassen kann. Z. B. Rekruten porcinen enterischen Viren Cholsäure, die Sphingomyelinase, aktiviert die katalysiert die Hydrolyse von Sphingomyelin in Ceramid 36,37,38. Dies destabilisiert Endosomal Membrane und Virus Flucht ermöglicht. Cholsäure ist also ein anderes Virus abgeleitete Komponente, die NLS ergänzt.
Als dieses Feld bewegt sich vorwärts und zukünftige treten Weiterentwicklungen in Nutzlast Lieferung von ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide, es ist ein guter Zeitpunkt, um visuelle Vorführungen ihrer biochemische und funktionelle Eigenschaften während der Anfangsphase der Entwicklung bieten. Hier beschreiben wir unsere Protokoll für die ursprüngliche Bewertung des Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs für die effiziente und doch einfache Bestimmung der intrazellulären Akkumulation und Tumor gezielt während der frühen Phase der Entwicklung. Wir verwenden die im Handel erhältlichen mAbs 7 3 und A14 als Beispiel Modellsysteme. Verfahren 1 beschreibt die Verwendung von SDS-PAGE als eine Methode, die für "Go/No go" Entscheidungen konstruierten ACs ermöglicht. Verfahren 2 beschreibt eine Methode, mit Trypsinization für verbesserte Visualisierung von AC intrazelluläre Verteilung und Akkumulation. Verfahren 3 beschreibt ein Verfahren zur verbesserten intrazellulären Fraktionierung, nukleare Lokalisation genau zu bestimmen. In diesem Verfahren nutzen wir die Nutzlast 64Cu (t1/2 = 12,7 h) weil es anfällig für zelluläre Ausfluss ist und ein Positronen-Emitter- 10 ist. So beschreibt Verfahren 4 in Vivo Tumor targeting Charakterisierung von PET imaging zu visualisieren Tumor Aufnahme relativ zum Hintergrund (d.h. Energiesubventionen gesundes Gewebe) und bestimmen, ob das Beispiel AC gezielt und effektiv kann Ziel Tumoren. Diese Methoden sind ausreichend für die Ermittler, die Entwicklung von ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide, Kandidaten für die Weiterentwicklung zu identifizieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die in Vivo Tierversuche beschrieben wurden nach einem genehmigten Prüfplan und nach den ethischen Richtlinien des Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke Ethikkommission für Tierversuche durchgeführt.
(1) Antikörper Peptid Konjugation
Hinweis: ChAcNLS können zu jeder kommerziellen Peptid Hersteller und Universität angeschlossenen Peptid-Synthese-Service-Plattform synthetisiert werden. Die Synthese von ChAcNLS finden Sie im Referenz- 34. Für Verfahren 1 und 2 verwenden der mAb 7 3, die spezifisch für die Leukämie-Antigen IL-3Rα 39.
- Bereiten Sie in einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch eine 10 mg/mL (~ 1 mg insgesamt Antikörper) Lösung von 7 3 in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7.6.
- Auflösen von Sulfo-SMCC in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5-10 mM. Vortexen die Lösung funktioniert gründlich am besten, um vollständige Auflösung zu erreichen.
- Fügen Sie in das Röhrchen mit 7 3 die gelösten Sulfo-SMCC-Lösung (in der Regel zwischen 5-20 μl je nach das molare Verhältnis von Sulfo-SMCC-zu - 7 3 gewünscht). Sulfo-SMCC-bis - 7 3 Verhältnisse von 10, 25 und 50-1-Tests empfohlen. Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h.
-
Reinigen Sie und konzentrieren Sie die Maleimide derivatisiert 7 3 mittels Ultrafiltration Gerät und Puffer Austausch mit PBS-Puffer, pH 7,0. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für ca. 5 min. verwerfen Durchströmung und füllen sich mit PBS, pH 7,0 und Zentrifuge wieder.
- Führen Sie diese 7 - 8 Mal den Puffer komplett auszutauschen. Wiederherstellen der konzentrierten 7 3 Protein indem man die Filtereinrichtung kopfüber in einen sauberen Microcentrifuge Schlauch. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g. Wiederherstellungs-Volume sollte etwa 0,3 mL
- In der Röhre, mit den Maleimide aktiviert 7 3 2-fold Molaren Überschuss an ChAcNLS im Vergleich zu den Sulfo-SMCC - 7 Verhältnis: 3 verwendet, die im vorherigen Schritt hinzufügen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Wenn ein 10-zu-1 Sulfo-SMCC - 7 Verhältnis: 3 verwendet wurde, dann z. B. ein 20: 1-ChAcNLS - 7 Verhältnis: 3. Gesamtvolumen sollte nicht wesentlich verändert werden.
Hinweis: Obwohl ChAcNLS keine Niederschläge während der Konjugation Prozess verursacht, ist dies eine Möglichkeit, die mit anderen Peptiden auftreten könnten. Beobachten Sie das Rohr während der Reaktion auf Anzeichen von Niederschlägen, die am ehesten wird verursacht, wenn Peptide hydrophob sind. In diesen Fällen kann es sich lohnen das Peptid von Interesse um Konstruktionsänderungen zu erhöhten Hydrophilie Neubetrachtung. - Die 7G 3-ChAcNLS mit einer Ultrafiltration Gerät auf gewünschte Konzentration und Puffer Austausch in PBS pH-Wert 7,4 (siehe Punkt 1.4) zu konzentrieren. Die Recovery-Ausbeute an Gesamt-Protein sollte ≥ 75 % des Ausgangsmaterials ab.
- Führen Sie die SDS-PAGE um die konstruierte 7G 3-ChAcNLS-Kandidaten mit einem 12 % Polyacrylamid-Gel (bietet ausreichende Trennung von der ChAcNLS konjugiert schwere und leichte Ketten aus nonconjugated Ketten) zu bewerten. Mix 10 μg des 7G 3-ChAcNLS in SEITENLADEN Puffer mit 2 μL β-Mercaptoethanol und laden Sie in Brunnen.
- Richten Sie die entsprechende Spannung (120 V für 1 h für einen 12 %-Gel) und führen Sie die Elektrophorese. Die Elektrophorese zu stoppen, wenn Coomassie Farbstoff vorne das Ende des Gels erreicht.
Hinweis: Lassen Sie nicht das Gel weglaufen Coomassie Farbstoff vorne. - Elektrophorese-Apparatur Gel entfernen und Spülen mit entfärben Lösung mit 10 % V/V Eisessig und 20 % V/V Methanol.
- Nehmen Sie ein Foto des Gels und mit einem Lineal und Messen der Abstand (cm) migriert für die Standards und 7 3 Konjugate. Berechnen Sie die Aufbewahrung Faktor (Rf) Wert, entspricht der Abstand geteilt durch die Gel-Länge (aus dem Protein vor Migration Coomassie geladen ist) migriert. Das Molekulargewicht (MW) im Protokoll gegen die Rf-Werte aus jedes Protein standard des Grundstückes und extrapolieren, die Größe der 7 3 konjugiert.
- Berechnen Sie die Anzahl der Peptide pro Antikörper durch Division der Differenz in MW 7 3 konjugiert und unveränderten 7 3 von 1768.5 g/Mol (MW ChAcNLS).
- Nehmen Sie digitale Bilder des Gels Coomassie gefärbt und durchführen Sie Densitometrie Analysen. An dieser Stelle kann Auswahl eines Lead-Kandidaten am AC mit der maximalen Anzahl von ChAcNLS Molekülen beruhen, die keine signifikante aggregierte Arten enthält.
(2) konfokalen Mikroskopie für intrazelluläre Akkumulation Bewertung
Hinweis: Es ist wichtig, die Zelle Selektivität der intrazellulären Akkumulation von Peptid-modifizierte mAbs vor der Entwicklung von Rezepturen mit einer Nutzlast von Interesse zu testen. Da Tat auch gezeigt hat, eine Neigung für unspezifische Zelle eindringen zu haben, lohnt es sich, erste Analyse intrazelluläre Akkumulation und Zelle Selektivität vor Unternehmen kostspielige Entwicklungsschritte mit teuren Nutzlasten. Aus diesem Grund sollten Verfahren 1 Isotype spezifische irrelevant Steuerung mAbs auch ändern. Für den Rest des Protokolls arbeiten wir mit ACs mit 10 ChAcNLS Moleküle pro Antikörper geändert. Eine schematische Darstellung, einschließlich der wichtigsten Schritte für Verfahren 2 und 3 wird in Abbildung 2beschrieben.
Achtung: Dieser Schritt des Protokolls umfasst die Bearbeitung und Manipulation von Paraformaldehyd. Befolgen Sie Anweisungen des Herstellers beim Umgang mit.
- TF-1a Zielzellen mit 200 nM 7G 3-ChAcNLS einschließlich geändert Kontrolle mAbs zu behandeln. Inkubieren Sie 5 x 106 Antigen-positiven Zellen mit der Konjugate für 1 h bei 37 ° c
- Nach 1 h überstand entfernen und waschen mit 1 mL 3 X in eiskaltem PBS. Frische Medien hinzufügen und eine weitere Stunde bei 37 ° c inkubieren
-
Nach einer zusätzlichen Stunde überstand zu entfernen und 3 X in 1 mL eiskaltem PBS waschen. Fügen Sie 0,5 mL PBS mit 0,25 % Trypsin und Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA hinzu) bei 37 ° C für 3 bis zu 30 min.
Hinweis: Während der erste Pilotversuche empfiehlt es nicht trypsinize Zellen, um die Unterschiede in AC intrazelluläre Akkumulation bestimmen. Dieses Protokoll fördert den Einsatz von Trypsin und wir zeigen, wie diese Bewertung der intrazellulären Akkumulation Effizienz der verschiedenen AC-Kandidaten verbessert.- Testen Sie die verschiedenen Zeiten für die Inkubation indem Sie visuell auf alle Zellen, die losgelöst. Außerdem brüten Sie Zelle Aliquote mit Lebensfähigkeit Färbung Lösungen und durchführen Sie durchflusszytometrischen Analyse als zuvor beschriebenen 40.
- Trypsin mit 1,5 mL der Zellkultur RPMI 1640 media/10% fetalen Rinderserum zu neutralisieren. Zellen bei 500 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand zu entfernen, und 3 X in 0,5 mL eiskaltem PBS waschen.
- Fix-Zellen in 0,5 mL PBS mit 1 % Paraformaldehyd und 1 % Saccharose auf Eis für 30 min. Waschen Zellen 3 X 0,5 mL eiskaltem PBS und Zentrifuge bei 250 X g für 5 min. Permeabilize Zellen in 0,5 mL PBS mit 0,15 % Triton x-100 für 5 min auf Eis. Zellen in eiskaltem PBS waschen und Zentrifugation zu wiederholen.
-
Sperren von Zellen in 0,1 mL PBS mit 2 μg/mL (oder dem Hersteller empfohlenen Konzentration) von einer Anti-Murine (Isotype spezifische) Fc sekundäre polyklonalen Antikörper konjugiert, AlexaFluor 647 für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Zentrifugieren Sie bei 250 X g für 5 min und waschen Zellen 3 X 0,5 mL eiskaltem PBS. Zellen in 0,5 mL PBS auszusetzen.
PAUSE: Zellen können im Kühlschrank gelagert werden.
Hinweis: Es ist wichtig, einen sekundären Antikörper auswählen, der erkennt die richtige Isotype MAB von Interesse. AF647 ist wegen seiner Fern-Infrarot-Emission ausgewählt, die nicht stören Propidium Jodid (PI) Färbung des Kerns.
- Zentrifugieren Sie bei 250 X g für 5 min und waschen Zellen 3 X 0,5 mL eiskaltem PBS. Zellen in 0,5 mL PBS auszusetzen.
- PI zu einer Konzentration von 10 μg/mL auf den Container mit Zellen hinzufügen. Als nächstes montieren Sie 1 x 10-5 -Zellen auf Glas-Objektträger mit Montage Medien und Abdeckung mit einem Glas Deckgläschen.
- Zellen mit einem Plan Apo 60 X Öl Immersion Ziel NA 1,42 auf eine invertierte Laserscanning confocal Mikroskop zu untersuchen. PI-Fluoreszenz mit 488 nm Argonlaser und die spektrale Scan Prisma set für 600-650 nm zu erkennen. Verwenden Sie für AF647 Fluoreszenz 633 nm-Helium-Neon-Laser und die spektrale Scan Prisma für 650-700 nm eingestellt. Sammeln Sie nacheinander Fluoreszenz Emissionen von PI und AF647.
Hinweis: Verwenden Sie die gleiche Einstellung in die Bewertung und den Vergleich der Zellen. Allerdings musst du die Einstellungen für trypsiniert Zellen im Vergleich zu nicht-trypsiniert Zellen anpassen. - Verwenden Sie Mikroskop-Software, um Bilder zu erwerben. Sammeln Sie Bilder mit horizontalen optischen Schnittserien von 1.024 x 1.024 Pixel mit 2 X Line durchschnittlich in 0,5 μm regelmäßigen Abständen über die gesamte Zelle Dicke genommen. Präsentieren Sie die Bilder so gestapelte Z-Projektionen von vier aufeinander folgenden Scheiben auf die maximale Fluoreszenzintensität.
- Zellen mit Mikroskop-Software analysieren. Notieren Sie die zellulären Verteilungsmuster der Konjugate. Konkret zu bewerten ob intrazellulären Fluoreszenz im Zytoplasma gruppiert ist und in der Nähe der Zelle Oberfläche oder diffuse und homogen. Auch Bewertung der relativen Fluoreszenzintensität pro Zelle.
(3) radioaktiv AC Bau und zelluläre Fraktionierung für die Bewertung von 64 Cu intrazellulären Transporteffizienz
Achtung: Schritte 3 und 4 umfassen die Handhabung und Bearbeitung von Radioaktivität. Bevor Sie diese Schritte durchführen, sollte Forscher Sicherheitstraining und Protokolle, die von ihrer Heimathochschule Strahlung Sicherheitsbehörde genehmigt genehmigt haben.
Hinweis: Für Verfahren 3 und 4 verwenden wir die mAb A14, die ist spezifisch für das invasive Blase Krebs Antigen IL-5Rα41. Darüber hinaus sind alle Experimente Zeit aufgrund der kurzen Halbwertszeit von 64Cu empfindlich. Im Allgemeinen ist es am besten, nicht zu warten, vergangene Woche in-vitro- Experimente durchführen und nicht länger als 72 h für in Vivo Studien.
- Aussetzen Sie 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic Säure (NOTA-NHS) eine 1,7 mL-Tube in DMSO zu einer Konzentration von 10 mM.
- Reagieren Sie 50-fold Molaren Überschuss an NOTA-NHS mit A14 (2 mg Ausgangsmaterial) in 0,1 M Natriumbicarbonat bei pH 8.6 für 1 h bei Raumtemperatur in einem Volumen ≤ 0,5 mL (das Endvolumen NOTA-NHS sollte nicht mehr als 2 % V/V des Gesamtvolumens).
- Reinigen und Buffer-Tausch NOTA-A14 verwenden eine Ultrafiltration Gerät mit PBS-Puffer, pH 7.6 (siehe Punkt 1.4).
- Führen Sie für die spätere Befestigung des ChAcNLS die Schritte 1,2-1,6.
- Reagieren Sie NOTA-A14-ChAcNLS (250 μg Chargen) mit 100 Megabecquerel (MBq) von 64CuCl2 in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH-Wert 5,5 für 1 h bei 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu wird auf die TR-PET-Zyklotron um die CIMS 42produziert.
- 64Cu-A14-ChAcNLS in PBS pH 7.4 mit einem Ultrafiltration Gerät, um die gewünschte Konzentration zu konzentrieren (siehe Punkt 1.4).
-
Bestimmen Sie die radiolabeling Effizienz von 64Cu-A14-ChAcNLS durch sofortige Dünnschichtchromatographie (ITLC) Chromatographie mit Streifen und 0,1 M, pH 5,5 Natriumcitrat (ITLC Laufmittel) als Lösungsmittel. ITLC Streifen 0,5 μL aliquoten von der Reaktionslösung zuweisen. Führen Sie eine Autoradiograph des Streifens und erhalten Sie ein digitales Bild zu.
- Durchführen Sie Densitometrie erhalten den Anteil der gebundenen und freien 64Cu. Wenn freie 64Cu-Gehalt > 5 %, zum vorherigen Schritt zurückkehren Sie und führen Sie zusätzliche Reinigung.
- Darüber hinaus führen Sie SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung um Aggregationen zu bewerten. Führen Sie eine zweite SDS-PAGE gefolgt von einer Autoradiograph des Gels um festzustellen, ob es radioaktiven aggregierte Arten.
-
Affinität, die verbindliche Qualität Kontrollpunkt: inkubieren 64Cu-A14 Konjugate bei steigenden Konzentrationen (0-100 nM) in zweifacher Ausfertigung mit 1 x 106 Zellen pro mL. Um unspezifische Bindung zu schätzen, mischen Sie doppelte Proben von 64Cu-A14-Konjugate mit Zellen in Anwesenheit von 100-fold Molaren Überschuss an unbeschrifteten A14.
- Waschen Sie nach 1 h Inkubation auf Eis Zellen zu und zählen Sie insgesamt gebundenen Antikörper und total unspezifisch gebundene Antikörper Proben in einem Gamma-Zähler. Anzeigen Sie spezifische Bindung (insgesamt gebundenen Antikörper - unspezifische gebunden Antikörper) gegen reaktive freie 64Cu-A14 (nM) verwendet in der Probe im Diagramm. Bestimmen Sie die Dissoziationskonstante (Kd) durch nicht-lineare Regression mit Grafik-Software.
- Für 64Cu zellulären Akkumulation Studien: Behandlung von Zellen mit 100 nM 64Cu-Label A14 Konjugate für 1 h, 6 h und 24 h bei 37 ° C wie oben beschrieben33. Sind zusätzliche Parameter wie die Behandlung im Beisein von unveränderten A14 zu Block IL-5Rα und bei 4 ° C, Rezeptor-vermittelte Verinnerlichung zu blockieren.
- Zum definierten Zeitpunkt Punkte, wie im zuvor beschriebenen Schritt 2.3 - 2.3.2, hinzufügen 0,5 mL PBS mit 0,25 % Trypsin und EDTA bei 37 ° C gefolgt von der Neutralisation und waschen.
- Inkubieren Sie Zellen in Plasmamembran Lyse Puffer mit 1 % NP-40, 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 Puffer auf Eis für 10 min Zentrifugieren der Plasmamembran lysiert Zellen 90 X g für 5 min.
- Überstand und in frische Röhre. Zytoplasmatischen Bruchteil. Waschen Kerne 3 X in eiskaltem PBS und der zytoplasmatischen Bruchteil Wäschen hinzufügen.
- Sicherstellen Sie, dass die Ampullen mit der nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionen verschlossen sind. Dann legen Sie sie in eine Gamma-Korrektur gegen kalibriert für 64Cu um rohe zählt in MBq zu konvertieren.
-
Entscheiden über die Qualität der Kerne Isolation durch Western-Blot Analyse für Lamin a/c, eine eingeschränkte nuklearen Protein und Rab7, ein reichlich zytoplasmatischen Proteine auf ganze Zelle lysate, nukleare und zytoplasmatischen Brüche.
- Behandlung 5 x 106 Zellen mit 500 μL des Radio-Immunopräzipitation Testpuffer (RIPA) und der Plasmamembran Lyse Puffer im Schritt 3,12 mit 1 %, 2 % und 4 % NP-40. Darüber hinaus behandeln Sie die isolierte Kerne in 500 μl Puffer RIPA, isolierte nuklearen Proteine zu erhalten.
- Überstürzen Sie sich isolierte nukleare, cytoplasmatische und ganze Zellproteinen mit 4 x das Probenvolumen von kaltem Aceton für 60 min bei-20 ° C. Bei 13.000 x g für 10 min Zentrifugieren Sie und dekantieren Sie überstand man aufpassen, nicht das Protein Pellet zu verdrängen. Fügen Sie 100 μl PBS Proteine auflösen.
- Laden Sie 10 µg Protein in jede Vertiefung eine 10 % SDS-PAGE Gel. Durchführen Sie Elektrophorese, wie beschrieben in 1.7-1.9. Führen Sie Western-Blot Übertragung wie zuvor beschrieben in beyerdynamic 43.
- Identifizieren Sie die Leiter, die einen MW von ~ 40 kDa Marker, die am besten entsprechen. Halbieren Sie die Membran an diese Markierung. Sondieren Sie den Fleck mit der höheren MW-Proteinen mit Lamin A/C-spezifische Antikörper. Prüfen Sie die Membran mit den unteren MW-Proteinen mit der Rab 7-spezifische Antikörper. Western-Blot ist eine bekannte Technik und nicht in diesem Protokoll beschrieben.
4. PET-Bildgebung Bewertung Tumor Targeting
Hinweis: Die Techniken der Implantation von Tumorzellen bei Mäusen heterotopisch Xenotransplantate generieren sind bekannt und die meisten Labors haben eigene Protokolle für ihren Tumor-System zugeschnitten. So fällt dies nicht in das Protokoll. Xenograft-Modell wird nonobese Diabetiker/schweren kombinierten immungeschwächte (NOD/SCID) Mäuse mit IL-5Rα-positiven invasive Blase Tumoren HT-1376 und HT-B9. IL-5Rα-positiven invasive Blase Tumorzellen umfassen > 66 % der gesamten Zellen in die Xenograft. Im Gegensatz dazu waren nur ~ 11 % der HT-B9 IL-5Rα-positiven Zellen in entwickelten Xenotransplantate41ff. Somit ist dieses Modell ein hervorragendes Beispiel für die Bewertung der AC Tumor gezielt in zwei Tumoren, die absehbare Patienten Tumor Heterogenität darstellen.
- In Gruppen mit ≥ injizieren 4 (NOD/SCID) Mäuse, Sie 20-30 µg (6-9 MBq) von 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS und 64Cu-A14 in die Rute Vene.
- Am selben Tag legen Sie eine zylindrische Phantom (24,8 mL) enthält 5 MBq von 64Cu, injizierte Dosis pro Gramm Gewebe (%ID/g) der radioaktiven zählt pro Sekunde umzusetzen.
- Warten Sie 48 h und dann betäuben Sie Mäuse zu, indem man sie in eine Kammer der Induktion mit 1,5 L/min Sauerstoff-Flow mit 2 % Isofluran. Wenden Sie sterile ophthalmologischen Salbe auf Maus Augen an, nach Induktion und vor der Platzierung in PET-Scanner.
- Übertragen Sie die Maus schnell zu einem PET-Scanner Tisch in Bauchlage mit einem Prüfkopf für Isoflurane kopfüber. Position der Atmung und rektale Sonden und Überwachungsrate Temperatur und Atmung zu gewährleisten, dass die physiologische Bedingungen während des Experiments wie bisher beibehalten werden beschrieben 44.
- Starten Sie die PET-Datenerfassung mit einer regelmäßigen Stichproben-Modus-Einstellung und ein Energie-Fenster von 250-650 keV. In der Regel genügt ein 45-minütige statische Scan per Mausklick ausreichend koinzidente Ereignisse für Rekonstruktion und Herstellung von qualitativ hochwertigen PET-Bildern zur Verfügung zu stellen.
- Entfernen Sie nach dem Scan 64Cu-AC Maus vom Scanner zu und legen Sie sie zurück in den Käfig. Die Maus, um ausreichend zu erholen, vor der Rückkehr in die Tierhaltung ermöglichen.
- Rekonstruierten Bilder mit 20 Iterationen eines dreidimensionalen maximale Wahrscheinlichkeit Erwartung Maximization-Algorithmus zu erhalten.
-
Durchführen Sie Region of Interest (ROI) Analyse der Tumor und visuell auswertbare Organe mit der Amid-Software.
- Ziehen Sie ROIs um quantitative %ID/g Daten manuell mithilfe der 3D Hilfsmittel "Freihand" Einstellung zu und abzugrenzen Sie sorgfältig, die Tumoren oder die angrenzenden Oberschenkelmuskel. Die Grafen pro Pixel im ROI werden in %ID/g aus vorherigen Schritt 4.2 konvertiert werden.
- Vergleichen Sie 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS Bilder für Tumor Kontrast und quantitative ROI % ID/g und Tumor-Hintergrund-Verhältnis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Für Verfahren 1 modifiziert der Bau von 7 3 mit ChAcNLS mit Sulfo-SMCC wie ein Vernetzer sehr zuverlässig ist. In der Regel, wenn ein 12 %-Gel verladen und von SDS-PAGE analysiert, dadurch unterscheidbar schrittweise Erhöhung der MW proportional zur steigenden Sulfo-SMCC-bis - 7 3 Verhältnisse verwendet und ermöglicht für die schweren und leichten Ketten für ChAcNLS individuell beurteilt werden Konjugation (Abbildung 3). 7G 3 reagiert auf 10, 20, 25 und 50-zu-1-Sulfo-SMCC-bis - 7 3-Verhältnisse gefolgt von HF-Messung und MW Hochrechnung Ergebnisse in 3, 7, 10 und 20 ChAcNLS-Moleküle pro 7 3. Densitometrie werden die prozentuale Monomer-Arten > 90 % für 7 3 modifiziert mit 3-10 ChAcNLS. Für 7G-3-ChAcNLS-20 ist die aggregierte Art 45 %. Dies zeigt, dass SDS-PAGE ist einfach, aber effektiv für die Auswahl einer 7 G 3-ChAcNLS Konjugat für weitere Entwicklung. Obwohl leicht verschmieren mit Antikörper-Ketten durch Antikörper Glykosylierung auftreten kann stört dies nicht mit der Identifizierung von aggregierten Arten.
Für Schritt 2 zeigt die repräsentativen Daten Unterschiede zwischen der Verwendung von Trypsin und keine Trypsin bei Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs für die Effizienz der intrazellulären Akkumulation der Bewertung. In diesem Beispiel kann die Fähigkeit des 7 G 3-ChAcNLS, erhöhen Sie ihre intrazelluläre Akkumulation in Zellen behandelt mit und ohne Trypsin (Abbildung 4) ausgewertet werden. Allerdings ist die Bedeutung der Trypsinization zeigt sich bei der Interpretation der Anhäufung von Konjugaten zum Vergleich zum AC Effizienz und Selektivität zu bestimmen. Trypsinization ermöglicht die intrazelluläre Fluoreszenz Grundniveau hergestellt werden, als mit unveränderten 7 3 beobachtet. Ein detail kann 7 3 auf das Zytoplasma in kleine Herde beschränkt. Im Gegensatz dazu beschränkt sich Zellen, die nicht trypsiniert sind, die 7 G 3-spezifische Fluoreszenz an der Zelloberfläche durch die Überexpression von IL-3Rα auf der Zelloberfläche. Dies erschwert die intrazellulären Anhäufung und Verteilung zu untersuchen, denn die Fluoreszenz an der Zelloberfläche dominiert und blockiert somit die intrazelluläre Fluoreszenz von visualisiert werden. Trypsinizing Zellen ist auch wichtig, bei der Bewertung der Spezifität als Beweis mit IgG-ChAcNLS. Wir können sehen, dass es einige nicht-spezifische Fluoreszenz von der Zelloberfläche aber wäre nicht in der Lage, bestimmen den Grad der intrazellulären Akkumulation durch das Peptid verursacht, wenn die Zellen nicht trypsiniert waren. Zu guter Letzt ohne Trypsinization könnte man falsch interpretieren, dass eine neu entwickelte AC nicht in Zielzellen zu sammeln. Wie mit 7 G 3-NLS gesehen, trypsinized Zellen, die nicht die Mehrheit der Fluoreszenz ist wieder von der Zelloberfläche. Nach Trypsinization kann man beobachten, dass 7G 3-NLS ansammeln, wenn auch begrenzt, in den Zielzellen.
Verfahren 3 zeigt die repräsentativen Daten Qualitätskontrolle für Bau, Affinität und in-vitro- Nutzlast Transporteffizienz und Spezifität für den Radioisotopen 64Cu mit A14-ChAcNLS. Densitometrie an radiologischen Bilder aus einer 12 % Polyacrylamid-Gel enthält 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, oder 64Cu-A14-ChAcNLS zeigen, dass die radioaktiven Konjugate 100 % Monomer Arten (Abbildung 5A). 64 Cu-A14-ChAcNLS zeigt nanomolaren Affinität für IL-5Rα. A14-ChAcNLS als Funktion der Erhöhung der Konzentrationen von 64Cu-A14-ChAcNLS offenbart spezifische Bindung näherte sich Sättigung bei Konzentrationen von 3-5 nM HT-1376 und HT-B9 Zellen (Abb. 5 b). Der Kd für 64Cu-A14-ChAcNLS auf HT-1376 und HT-B9 Zellen betrug 6,4 ± 1,7 nM bzw. 3,1 ± 0,8 nM. ChAcNLS Konjugation verringert die Affinität der A14 ca. 2,5-fache für IL-5Rα auf HT-1376 und HT-B9-Zellen. Gamma zählen enthüllt, die der Anstieg der Radioaktivität in den Zellkern und Zytoplasma von 64Cu-A14-ChAcNLS ausgeliefert ist spezifisch und nimmt im Laufe der Zeit (Abbildung 6). Gamma zählen in der Regel etwa zeigt > 6-fold Erhöhung der nuklearen und intrazelluläre Akkumulation in Zellen mit 64Cu-A14-ChAcNLS im Vergleich zur Behandlung mit 64Cu-A14-ChAcNLS in Anwesenheit von Überschuss behandelt unveränderte A14 oder wenn Behandlungsstudien bei 4 ° C (Abb. 6A) durchgeführt werden. Außerdem gibt es eine ≥ 3-Fach Erhöhung der nuklearen und intrazelluläre Akkumulation von 64Cu bezogen auf Zellen behandelt mit 64Cu-A14 und 64Cu-IgG-ChAcNLS zu allen Zeitpunkten getestet (Abbildung 6 b).
Abbildung 7 zeigt die Bedeutung des Protokolls Zelle Fraktionierung. HT-1376 und HT-B9 Zellen inkubiert mit Plasmamembran Lyse Puffer mit 1 %, 2 % oder 4 % NP-40. Isolierte Kerne enthalten sollten ausschließlich Lamin a/c. zytoplasmatischen Fraktionen sollten entsprechend exklusiv für Rab7. Als Kontrolle sollte ganze Zellen lysiert mit RIPA Puffer positiv für Lamin a/c in diesen beiden Bereichen besteht. Dieses Protokoll zeigt, dass bei der Bewertung der nuklearen Anteil der lysierten HT-1376 Zellen gibt es keine Rab7 vorhanden. Darüber hinaus gibt es keine Lamin Klimaanlage in den zytoplasmatischen Bruch vorhanden. Allerdings gibt es eine reduzierte Menge an Rab7 im Zytoplasma von Zellen lysiert mit 4 % genommen NP-40 (Abb. 7A). Dies deutet höchstwahrscheinlich, dass 4 % NP-40 Lyse Puffer die Kernmembran neben der Plasmamembran stören wird. Dies führt bei der Vermischung von nuklearen Proteine mit zytoplasmatischen Proteinen und somit verdünnt die Konzentration der Rab 7. Dies erklärt den reduzierten Betrag von Rab 7 vorhanden. HT-B9-Zellen sind noch empfindlicher als HT-1376 Zellen. Behandlung mit Plasmamembran Lyse Puffer mit 4 % NP-40, Lamin a/c ist deutlich zu sehen in den zytoplasmatischen Bruch (Abb. 7 b). Gibt es eine entsprechende Herabsetzung der Lamin a/c in der nuklearen Bruchteil. HT-B9-Zellen sind auch empfindlich auf 2 % NP-40 Lyse Puffer, wie die Menge an Rab7 in den zytoplasmatischen Bruchteil im Vergleich zu 1 % gemildert ist NP-40. Daher sollte eine zelluläre Fraktionierung mit bestimmten Zellen von Interesse optimieren, so dass quantitative Ergebnisse der Nutzlast Akkumulation in den Zellkern und intrazellulären Raum richtig sind. Dies ist wichtig für die Beurteilung der Effizienz der nuklearen Lokalisierung eines Romans AC.
Verfahren 4 ermöglicht PET-Bildgebung bei 48 h nach der Injektion von 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS oder 64Cu-A14-ChAcNLS bei Mäusen mit HT-1376 und HT-B9 heterotopisch Xenotransplantate auf gegenüberliegenden Hinterbeine zur Visualisierung des Tumors Ausrichtung auf Eigenschaften (Abbildung 8). Wie in unserem Beispiel zeigt visuelle Inspektion der PET-Bildern die HT-1376 und HT-B9 Tumor targeting Funktionen von 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14 und 64Cu-A14-NLS (Abb. 8A). Jedoch in Fällen, wo Sichtprüfung schwierig als mit der HT-B9-Tumoren, ROI-Analyse lässt sich bestimmen, Tumor-Muskel-Verhältnis (Abbildung 8 b).
Abbildung 1: ChAcNLS-modifizierte mAbs. NLS-Rückstände aus dem SV-40 große T-Antigen (KKKRKV) sind eingeklemmt zwischen Abstandhalter Rückstände durch eine N-terminalen Cystein begrenzt. Cholsäure (grüne Halterung) ist mit Cystein als zuvor beschriebenen 34gekoppelt. Nach Bau und Reinigung des ChAcNLS, die Sulfhydryl-Gruppe von Cystein dient zur Konjugation über Sulfo-SMCC (rote Klammer; gezeigt bereits an der mAb). Hinweis: mAb (150 kDa) und ChAcNLS (1,8 kDa) sind nicht maßstabsgetreu. Angepasst und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Paquette, verbessert M. Et Al. NLS-Cholsäure Säure Konjugation an IL-5Rαspecific Antikörper zellulären Akkumulation und in-vivo Tumor-targeting Eigenschaften in einer Blase Krebs Modell. Bioconjugate Chemie. doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
-
Abbildung 2: AC Zelle Behandlungsansatz und Weiterverarbeitung zur Analyse von konfokalen Mikroskopie und zur Analyse der Zelle Fraktionierung Qualität schematische. Rote Pfeile entsprechen wesentliche Schritte 2.2, 2.3, 3.15 und 3.15.4.. Angepasst und nachgedruckt mit Erlaubnis von Beaudoin, S. Et Al. ChAcNLS, Roman Änderung Antikörper-Konjugate Ziel bei schönem zellspezifische Endosomal entgehen, Lokalisierung auf dem Kern und verbessert insgesamt intrazelluläre Akkumulation. Molekulare Pharmazie. 13 (6), 1915 – 1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Abbildung 3: Analyse der ChAcNLS veränderten mAbs. Eine reduzierende SDS-PAGE zeigt die laufende Leiter (L) mit entsprechenden Molekulargewichten Kilodalton (kDa) und unveränderten 7 3 schwere und leichte Kette als Referenzen. Die folgenden Bahnen sind die Migration Bands der schweren und leichten Ketten von 7 3 modifiziert mit 3, 7, 10 und 20 ChAcNLS.
Abbildung 4: Analyse der mAb intrazelluläre Verteilung und Akkumulation. Konfokale Mikroskopie Bilder illustrieren die intrazelluläre 7 3 Verteilung und relative Fluoreszenz Akkumulation in IL-3Rα-positiven Leukämie-Zellen behandelt mit 7 3 7 G 3-ChAcNLS, IgG und IgG-ChAcNLS. Zellen sind trypsiniert oder nicht trypsiniert vor der Fixierung. Kerne sind mit Propidium Jodid (PI, rot), anti-murine-Fc-AF647 Farbstoff (mAb; grün) gefärbt, und PI/mAb zusammengeführt. Waage ist 50 μm. Innerhalb der Trypsin und keine Trypsin-Gruppen erworben wurden Bilder mit identischen Einstellungen zwischen verschiedenen ACs gezeigt. Die Trypsin-Teil der Abbildung 4 ist Refefence 34 mit Erlaubnis angepasst. Angepasst und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Beaudoin, S. Et al. ChAcNLS, eine neuartige Änderung Antikörper-Konjugate bei schönem Ziel zellspezifische Endosomal entweichen, Lokalisierung in den Kern und verbesserte Total intrazelluläre Akkumulation. Molekulare Pharmazie. 13 (6), 1915 – 1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Abbildung 5: 64Cu-A14-ChAcNLS Reinheit und Affinität. (A) die radiochemische Reinheit von 64Cu-Label A14 A14-NLS, A14-ChAcNLS wurden durch SDS-PAGE gefolgt von Autoradiographie überprüft. (B) spezifische Bindung Kurven für 64Cu-A14 und 64Cu-A14-ChAcNLS auf HT-1376 und HT-B9-Zellen. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung des Experiments in Wiederholung durchgeführt. Angepasst und Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Paquette, M. Et Al. NLS-Cholsäure Säure Konjugation an IL-5Rα-spezifische Antikörper verbessert die zellulären Akkumulation und in-vivo Tumor-targeting Eigenschaften in einer Blase Krebs Modell. Bioconjugate Chemie. doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Abbildung 6: 64Cu Kern- und intrazelluläre Akkumulation. Repräsentatives Beispiel für Zelltherapie durchgeführt in dreifacher Ausfertigung (Fehlerbalken bezeichnen Standardabweichung), Spezifität (A) und (B) Ansammlung Verbesserungder 64Cu-A14-ChAcNLS zu demonstrieren. Die %-Ansammlung wird in den Zellkern (linken Panels) und total intrazellulären Raum (richtigen Platten) bezogen auf die Gesamtmenge der Radioaktivität verwendet während der Behandlung von IL-5Rα-positiven invasive Blase Krebszellen vorgestellt. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung des Experiments in Wiederholung durchgeführt. * p ≤0.05 angibt.
Abbildung 7: Analyse der Zelle Fraktionierung Verfahren. Western-Blot von Atomwaffen (A) und (B) Cytoplasmic Fraktionen für Lamin a/c (obere Flecken, rote Pfeile) und Rab 7 (unten Flecken, schwarze Pfeile) Behandlung von HT-1376 und HT-B9-Zellen in Plasmamembran Lyse Puffer mit 1 %, 2 % oder 4 entnommen NP-40 %. Ganze Zellen lysiert mit RIPA Puffer diente als Positivkontrolle für Lamin a/c und Rab7 in diesen beiden Bereichen besteht. Laufenden Normen (L) sind nur im oberen Flecken dargestellt. Drei Pfeile erscheinen für Lamin a/c aufgrund seiner mehrere Isoformen. Angepasst und abgedruckt mit Genehmigung von Paquette, M. Et al. NLS-Cholsäure Säure Konjugation an IL-5Rα-spezifische Antikörper verbessert die zellulären Akkumulation und in-vivo Tumor-targeting Eigenschaften in einer Blase Krebs Modell. Bioconjugate Chemie. doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Abbildung 8: In Vivo Analyse der Tumor-Targeting von PET-Bildgebung und ROI-Analyse. (A) PET-Bildern auf 48 h nach der Injektion von NOD/SCID-Mäusen mit HT-1376 (rote Pfeile) und HT-B9 (blaue Pfeile) Tumoren mit 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS und 64Cu-A14-ChAcNLS intravenös injiziert. Grüner Pfeil ist Leber Aufnahme. Muskel-ROI-Zeichnung mit Magenta Kreis angezeigt. (B) ROI HT-1376 und HT-B9 Tumor-Muskel-Verhältnis des ACs in 48 h nach der Injektion. Fehlerbalken zeigen Standardabweichung des Experiments in n = 10 ROIs per Mausklick (n = 5). * zeigt p 0,05.
| Tat |
| CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20 |
| CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30 |
| CGISYGRKKRRQRRR 29 |
| GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25 |
| TRQARRNRRRRWRERQRGC 26 |
| NLS |
| CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27 |
| Cholsäure-CGYGPKKKRKVGG 34 |
Tabelle 1: Liste von Tat und SV-40 große T-Antigen abgeleitete Peptide in AC Änderungen verwendet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hauptziele der systemischen Lieferung von Anti-Krebs-Wirkstoffe sind Ansammlung am Tumor Standort und Aufnahme innerhalb von Krebszellen zu erhöhen und unerwünschte Nebenwirkungen bei gesunden Gewebe zu verringern. AC gezielte Bereitstellung von molekularen Nutzlasten für Tumorzellen ist ein sehr vielversprechender Ansatz zur Behandlung und Tumoren zu erkennen. Jedoch die mangelnde Wirksamkeit durch Endosom Einklemmung und down Stream lysosomalen Abbau bleibt eine wichtige Herausforderung. Während dieses Protokoll das ChAcNLS Peptid als Vorbild für den Bau der nächsten Generation ACs nutzt, sind die beschriebenen Verfahren anpassungsfähig an jedes Peptid-modifizierte AC entwickelt mit dem Ziel der Erhöhung der intrazellulären gelieferten Nutzlast um gezielt Krebszellen.
Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind: 1) erkennen und begrenzen hohe MW aggregieren Arten; (2) die Trypsinization der Zellen vor der Analyse für die Bestimmung der intrazellulären Akkumulation; (3) durchführen Qualitätssicherung der zellulären Fraktionierung Verfahren; und 4) Durchführung von PET imaging um zu Tumor gezielt in Vivozu bewerten.
Es ist wichtig, dass die Konjugation des Virus-abgeleitete Peptide, mAbs nicht zu hohen MW aggregierten Arten führt, die am ehesten durch intramolekulare Vernetzung zwischen mAbs verursacht wird. Dies ist die erste Sorge und bevor voran weiter behandelt werden sollte. Voran mit Peptid-modifizierte ACs, die unerwünschte Aggregate enthalten könnte Ergebnisse geben, die falsche Beweise auf Aspekte wie die intrazellulären und in Vivo Nutzlast Lieferung Profile bieten. Reaktive Maleimides auf mAbs ist wahrscheinlich verantwortlich für die kovalente Aggregation. Eine Lösung besteht darin die Sulfo-SMCC-mAb-Verhältnis zu reduzieren. Eine weitere Alternative ist die Verwendung von N-Acetyl-Derivate von Aminosäuren wie Cys, Lys, His, Ser und Thr während Peptid Konjugation, die Maleimide aktiviert mAb- 45. Die nukleophilen Seitenketten sind in der Lage zu reagieren mit Maleimide glyko-des SMCC und Intra-Antikörper Vernetzung zu verringern. Trennung von Größe Ausgrenzung Chromatographie nach Konjugation ist alternativ einsetzbar, Monomer Arten 45zu isolieren. Standortspezifische Konjugation des Peptids an den Antikörper kann auch durchgeführt werden. Zum Beispiel können Antikörper Kohlenhydrate für Konjugation, Peptide, die gezeigt hat, effizient produzieren Monomer Arten 24geändert werden.
SDS-PAGE mit 12 % Polyacrylamid-Gel ist eine günstige und effektive Methode, um eine breite Perspektive unterschiedlicher Größe AC Arten zu gewinnen. Wenn eine Erhöhung in % Polyacrylamid verwendet wird, werden Trennung von schweren Ketten und intramolekulare Arten schwer zu unterscheiden. Umgekehrt, wenn eine reduzierte % Polyacrylamid verwendet wird, dürften die Lichterketten das Gel weglaufen. Gradient Gele mit 4-20 % Polyacrylamid auch bieten gute Retention für die schweren und leichten Ketten auf einem einzigen Gel verschiebt. Unter den verschiedenen analytischen Techniken zur molekularbiologischen Analyse zur Verfügung sind Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und Kapillar-Elektrophorese-SDS SDS-PAGE zur Trennung und Charakterisierung von ACs 46überlegen. SDS-PAGE ist jedoch eine frühzeitige und kostengünstige Methode für den ersten Bau dieser neuartige Wirkstoffe zu analysieren und dann entscheiden, auf die folgende Vorgehensweise.
Die Inkubation der Zellen in Lösung mit 0,25 % Trypsin (Schritt 2.3), wodurch eine maximale Anzahl der Zelloberfläche Proteine und gebundenen ACs ist wichtig, denn es verbesserte Visualisierung und relative Anstieg der intrazellulären Akkumulation zwischen ermöglicht Referenz-Antikörper. Die Kameraparameter sollen Bilder mit maximale Fluoreszenzintensität zu erfassen. Dies ist aufgrund von Zelle zu Zelle in Höhe von AC, das akkumuliert wird. Ermöglicht die Aufnahme von Bildern mit maximaler Intensität für Zellen mit weniger AC Akkumulation auch ausgewertet werden. Krebs-Antigene sind jedoch in der Regel sehr auf Tumorzellen geäußert. Wenn die Zellen nicht für die Verdauung von Trypsin ausgesetzt waren, würde die Fluoreszenz ausgehend von ACs an der Zelloberfläche das Bild dominieren. Darüber hinaus könnte ohne Trypsinization Entwicklung mit ACs mit subtilen aber bedeutende intrazelluläre Ansammlung Eigenschaften beschränken.
Sicherstellung hoher Qualität zellulären Fraktionierung ist wichtig, genau die Anhäufung von 64Cu im Zellkern gegen das Zytoplasma zu bewerten. Die Fähigkeit von ChAcNLS, intrazelluläre Akkumulation von AC und Nutzlast zu erhöhen ist durch die aktive Lokalisierung auf der Kern- 34. Als zukünftige Virus-Peptide entwickelt, können diese Peptide in den Zellkern als Bestandteil ihrer Mechanismus zur intrazellulären Nutzlast Effizienzsteigerung auch lokalisieren. Daher ist es wichtig, dass zelluläre Fraktionierung von hoher Qualität, genau diesen Prozess detailliert sein. Dieses Protokoll betont, wie wichtig die Kerne für zytoplasmatischen Marker und auch der zytoplasmatischen Bruchteil für nukleare Marker zu bewerten. Zum Beispiel Hu Et Al., entwickelt eine AC mit einem Peptid Tat geändert und nuklearen Anreicherung von Radioisotopen Nutzlast 24erkundet. Western-Blot Analyse für Calpain, eine reichlich zytoplasmatischen Proteinen, war in der nuklearen Bruch. Das war höchstwahrscheinlich, weil kommerzielle nuklearen Isolierung Kits verwendet wurden. Dieses Protokoll nachgewiesen, dass HT-1376 und HT-B9 Zellen benötigte unterschiedliche Konzentrationen der NP-40 um angereicherten Kernen mit intakten Membranen zu isolieren. Wenn HT-B9 Zellen mit Puffer lysiert wurden war mit 4 % NP-40, Lamin a/c in der zytoplasmatischen Bruchteil angibt, die Behandlung gestört Kernmembran und erlaubt für Lamin a/c ins Zytoplasma. Wenn die nuklearen und zytoplasmatischen Brüche nicht sorgfältig isoliert sind, könnte es schwierig, den Beitrag der nuklearen Lokalisierung total intrazelluläre Akkumulation zu identifizieren sein. Es gibt Berichte über biologische und künstlich-abgeleitete Peptide, die gezielt andere intrazelluläre Fächer wie das endoplasmatische Retikulum, Golgi-Apparat und Mitochondrien 47,48,49. Die Isolation der intrazellulären Kompartimenten gewinnt somit zunehmend an Bedeutung.
Dieses Protokoll endet mit seiner Beschreibung der 64Cu-A14-ChAcNLS Ausrichtung der HT-1376 und HT-B9 Tumoren. Aus der Sichtprüfung der PET-Bildern in Abbildung 8zeigt sich durch die erhöhte Tumor PET signal im Vergleich zu den angrenzenden reduziert umgebenden Hintergrund 64Cu-A14-ChAcNLS hat hervorragende Ausrichtung der HT-1376 und HT-B9 Tumoren (Abbildung 8A ). ROI-Analyse zeigt auch seine Fähigkeit, Tumor gezielt zu bewerten. In unserem Beispiel verwenden wir ROI-Tumor-Muskel-Verhältnis um Tumor gezielt zu quantifizieren und zu demonstrieren, dass 64Cu-A14-ChAcNLS ist die überlegene AC (Abbildung 8 b). PET-Bildgebung ermöglicht auch für die Bewertung von AC Sequestrierung in gesunde Organe. Die Leber ist das wichtigste Organ, das Antikörper metabolisiert. Abbildung 8A zeigt, dass die Aufnahme in der Leber in Mäuse injiziert mit 64Cu-A14-ChAcNLS und 64Cu-A14 vergleichbar ist. In dieser frühen Entwicklungsphase schlägt diese Daten ChAcNLS keine unerwünschten Sequestrierung verursacht. 64 Cu hat eine Halbwertszeit von 12,7 h, das ist nicht ideal für ACs, die Halbwertszeiten von mehreren Tagen haben. Wie zuvor beschrieben in das visuelle Protokoll von Zeglis und Lewis ist der Einsatz von langlebiger Radioisotope Zirkonium-89 (89Zr) eine Nutzlast deren physikalischer Halbwertszeit ist ideal für mAbs und durch PET 50abgebildet werden kann. So ist für die Bewertung der Tumor Lieferung über mehrere Tage, 89Zr eine bevorzugte Wahl. Dies ist besonders wichtig, wenn Therapie ein Ziel, ist wo hohe Tumor Aufnahme ist günstig und nimmt im Laufe der Zeit mit Antikörpern 7. Bioverteilung sollte auch durchgeführt werden, um einzelne Orgel Aufnahme erkunden die Ausrichtung zu bestimmen oder Sequestrierung Eigenschaften der neu entwickelten ACs. Darüber hinaus können Mäuse mit unveränderten spezifischer Antikörper an Block-Rezeptoren auf Tumorzellen gezielt Spezifität auszuwertende predosed werden. Dennoch, 64Cu mit PET-Bildgebung und ROI-Analyse ausreichend liefern eine erste Einschätzung des Tumors Lieferung Eigenschaften des entwickelten ACs präsentiert in diesem Protokoll.
ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide haben bisher beschränkt sich auf die Lieferung von Radioisotopen. Dies ist teilweise historisch bedingt und auch weil Radioisotope leicht bei in Vitro und in Vivo Tests quantifiziert sind und mit nicht-invasiven Ganzkörper-bildgebender Verfahren visualisiert werden können. Natürlich, wie dieses Feld, den Transport und die Lieferung von Nutzlasten als Radioisotope, wie z. B. Chemotherapeutika, Enzyme und Oligonukleotide erweitert, Änderungen, die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken müssen entwickelt werden. Beispielsweise werden neuartige Methoden zur Bewertung der intrazellulären Akkumulation von alternativen Nutzlasten müssen entwickelt werden. Darüber hinaus werden Änderungen für in Vivo Evaluation Biene notwendig, da diese Nutzlasten können nicht leicht abgebildet und daher wird es schwierig, Bioverteilung, Spezifität und Tumor-Aufnahme-Leistungsfähigkeit zu beurteilen sein. Aus diesen Gründen sollte Radionuklid Nutzlasten als Surrogat Nutzlasten für die zukünftige Entwicklung mit alternativen Ladungen bleiben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Cancer Research Society (Kanada) und die CIMS finanziert. Die Autoren danken Dr. Samia Ait-Mohand und Jean-Francois Beaudoin um Unterstützung zu erhalten. Dr. Angel Lopez (University of South Australia) für mAb A14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
References
- Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
- Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
- Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
- Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
- Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
- Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
- Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
- Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
- Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
- Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
- Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
- Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
- Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
- Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
- Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
- Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
- Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
- Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
- Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
- Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
- Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
- Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
- Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
- Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
- Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
- Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
- Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
- Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
- Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
- Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
- Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
- Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
- Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
- Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
- Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
- Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
- Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
- Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
- Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
- Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
- Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
