Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

Published: March 8, 2018 doi: 10.3791/55440
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Nuclear Medicine and Radiobiology, Université de Sherbrooke, 2Sherbrooke Molecular Imaging Center (CIMS), Université de Sherbrooke, 3Sherbrooke Institute of Pharmacology

Summary

פפטידים ויראלי-derived מצמידים נוגדן-conjugates (ACs) היא גישה צובר תאוצה בשל הפוטנציאל להעברת מטענים מולקולרית עם הצטברות תאי הגידול מוגברת. ניצול שיטות נפוצות כדי להעריך את ההטיה פפטיד, AC הצטברות תאיים המטען ואת הגידול מיקוד, פרוטוקול זה מסייע החוקרים במהלך שלבי הפיתוח מפתח.

Abstract

נוגדנים-conjugates (ACs) שונה עם פפטידים נגזר וירוס הם מחלקה פוטנציאל רב עוצמה של הגידול תא משלוח סוכני מטענים מולקולרית המשמשים לטיפול בסרטן והדמיה עקב הצטברות הסלולר מוגברת מעל ACs הנוכחי. במהלך המוקדמות AC במבחנה פיתוח, טכניקות פלורסצנטיות, radioimmunoassays מספיקים לקביעת לוקליזציה תאיים, הצטברות יעילות וספציפיות של תא המטרה. כיום, יש הסכמה כללית על שיטות מתוקננת להכנת תאים להערכת הצטברות תאיים AC ולוקליזציה. בדיקה ראשונית של ACs ששינה עם פפטידים נגזר וירוס הוא קריטי במיוחד אם נבנו כמה מועמדים. קביעת הצטברות תאיים על-ידי קרינה פלואורסצנטית עשויה להיות מושפעת האיתות רקע ACs על פני התא ומסבכים את הפרשנות של הצטברות. עבור radioimmunoassays, תאים בדרך כלל מטופלים הם fractionated ומדד הרדיואקטיביות בתאים תאים שונים. עם זאת, פירוק התא משתנה מתא לתא, לעיתים קרובות גרעינית, cytoplasmic תאים אינן מבודדות בצורה הולמת. זה יכול לייצר מטעה נתונים על מאפייני משלוח המטען. תוך ורידיות radiolabeled נגזר וירוס מהונדס פפטיד ACs בבית הגידול הנושאת עכברים ואחריו רדיונוקלידים הדמיה היא שיטה חזקה לקביעת המאפיינים משלוח פילוח של המטען הגידול בשלב ויוו פיתוח. אולם, זה קידום יחסית לאחרונה, כמה קבוצות העריכו נגזר וירוס מהונדס פפטיד ACs באופן זה. אנו מתארים את העיבוד של תאים שטופלו להעריך בצורה מדויקת יותר נגזר וירוס מהונדס פפטיד AC הצטברות בעת שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית ו- radioimmunoassays. באופן ספציפי, שיטת trypsinizing תאים להסיר את תא השטח מאוגד ACs. כמו כן, אנו מספקים שיטה לשיפור fractionation הסלולר. לבסוף, פרוטוקול זה מספק ויוו שיטה באמצעות טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) להערכת הגידול הראשוני פילוח נכסים נושאות עכברים. אנו משתמשים radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) כמו תוכן דוגמה פרוטוקול זה.

Introduction

נוגדנים-conjugates (ACs) הם ביופרמצבטיקה זה אתה הופך מחלקה טרנספורמטיבי של תרופות יעילות לשיפור טיפולים בסרטן, לגילוי גידולים. מורכב נוגדן חד שבטי (mAb) מצומדת כדי מטענים מולקולרי כגון רדיואיזוטופים, מולקולות קטנות רעלנים ביולוגיים, ACs מסוגלים להעביר מטענים אלו תאים סרטניים עם זיקה אנטיגן מטרה מעולה וספציפיות. לפיכך ACs יש פוטנציאל להפחית רעילות ספציפי ולהגדיל המטען פעילות באתר הגידול באופן משמעותי. מבחינה רפואית ACs בהעברת מולקולות קטנות ציטוטוקסיות (המכונה כמו נוגדנים תרופתיים conjugates) אושרו לטיפול בחולים עם סרטן השד והודג'קין לימפומת שנכשלו טיפולים קונבנציונליים 1, 2. בנוסף, ACs בהעברת רדיואיזוטופים (המכונים בדרך כלל radioimmunoconjugates) הם גם בפיתוח. AC הובלת רדיואיזוטופ עבור הדמיה אושרה לזיהוי סרטן הערמונית גרורות 3. עם ACs יותר טיפולית רבים נאספו עבור אישור 4, אופטימיות היא גבוהה לעתיד של ACs כדי לשפר את הטיפול בסרטן 5.

עם זאת, בעת מסירת chemotherapeutics או רדיואיזוטופים, ACs יש קושי ביעילות צבירת אלה מטענים בתוך התאים היעד. היבט זה תורם משמעותית במקרים רבים בחוסר היכולת של ACs לספק לאורך זמן הישרדות ללא מחלה או גידול חדות גבוהה הדמיה 6,7. באופן כללי, לאחר ACs לאגד אנטיגן היעד שלהם הם הם הפנימו באמצעות תהליך המכונה אנדוציטוזה קולטן בתיווך. ACs ואז הם לכודים בתוך endosomes, הנסחר כדי lysosomes על השפלה ולשחרר תוכן של 8. תהליך סחר תאיים מציב אתגרים עבור ACs להשיג ירידה לפרטים המטען גבוהה בעלת יעילות כנגד לחסל תאי סרטן. לדוגמה, רבים אנטיגנים כגון Her2 (יעד עבור טיפולי AC הרצפטין-emtansine) ממחזרים עד 85% נוגדנים מאוגדים ב 30 דקות הראשון 9. יתר על כן, ברגע השפלה מתרחשת, chemotherapeutics המשוחררים, רדיואיזוטופים ניתן באופן פעיל לייצא ביטוי מוגבר ו/או פעילות של קרום הקשורים תחבורה חלבונים 10,11. ליזוזום השפלה פוגעת גם המסירה של הרומן מטענים ביולוגיים כמו אנזימים טיפולית, oligonucleotides כי ניתן לבטל את הפעלתם 12,13. בעיקרו של דבר, התא סרטן הוא יעיל ב abrogating הצטברות תאיים הדרושים של מטענים מועברים על ידי ACs.

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליישם את הרעיון של ACs-מצמידים פפטידים נגזר וירוס, במיוחד עבור בריחה אנדוזום מלכוד, לוקליזציה אל גרעין התא. עם תחכום כזה כדי לתפעל את מערכות התא המארח, זה לא מפתיע כי הפיתוח של חלבונים נגזר וירוס ושל פפטידים כמו ביופרמצבטיקה פוטנציאליים יש זמן כבר טבוע מחקר טיפולית 14. במשך מיליוני שנים וירוסים התפתחו לרכוש אוסף יוצא דופן של חלבונים מסוגלים לנצל ביעילות מערכות פיזיולוגיות נורמלית בתרבית של תאים על מנת להזין את התאים המארחים. עבור וירוסים הם הפנימו דרך קולטן בתיווך אנדוציטוזה, הם מאותגרים גם עם בריחה סחר ליזוזום שבו המתקפה של ריכוז המותאמות לשפות אחרות של פרוטאזות יכול להיות בעייתי להישרדות. פפטיד ויראלי-derived טוב מאופיין מנוצל משלוח סמים בריחה אנדוזום מלכודת היא transactivator וירוס הכשל החיסוני האנושי של חלבון שעתוק (תאת) 15. Tat היא הצליחה לברוח אנדוזום מלכודת על ידי חישה pH נמוך בנקודה מתרחשים שינויים הסתגלותי חלבון Tat המאפשר כדי להכניס את עצמו לתוך ולשבש את הממברנה endosomal 16. התוצאה טאט-המטען conjugates יוכלו לגשת הציטופלסמה. הרכיב השני מניפולציה ויראלי הקשורים פרוטוקול זה הוא לגישת להעביר גנים טיפוליים וסמים גרעין ה- 17. וירוסים התפתחו לתמרן בהצלחה מכונות התא המארח מתקדם מעבר קרום גרעיני על ידי עובר דרך גרעיני הנקבובית מורכבים (NPC). מקרומולקולות הסלולר מכילים (או לאגד חלבונים המכילים) אותות לוקליזציה גרעיניים (NLSs) הכרחי עבור איגוד גרעינית כדי להעביר חלבונים (למשל karyopherins α וβ), המספקות את התנועות הנדרש דרך NPC. וירוסים פיתחו חלבונים כדי להכיל רצפים של NLS המספקים להם את היכולת לנצל חלבונים תחבורה התא המארח במחיר לתוך גרעין 18.

ACs רבים יש בעבר היה functionalized עם פפטידים Tat, NLS-נגזר ונבדק על היכולת שלהם להצטבר בתוך תאים סרטניים ועל מיקוד גידולים 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (טבלה 1). העברת מטענים ציטוטוקסיות מחקרים הראו כי ACs ששינה עם פפטידים נגזר וירוס מסוגלים להגביר משמעותית את הצטברות תאי cytotoxicity, הגידול הרג מעל ACs יאומתו 22,26. תכונה נפוצה עבור מחלקה זו הרומן של AC היא הבנייה שלהם. בדרך כלל, פפטידים מכילים של ציסטאין מסוף לספק קבוצה sulfhydryl חינם. MAbs הם הגיבו קודם עם crosslinker bifunctional noncleavable, המכיל N- hydroxysuccinimide (NHS) וקבוצות maleimide בקצוות מנוגדים. האסטרים NHS להגיב עם ראשי אמינים על mAb כדי ליצור חוב אמיד. MAb יפעלו ויגיבו עם קבוצות maleimide חינם ואז הגיבו עם קבוצות sulfhydryl על פפטידים ליצירת קשר thioester, ובכך מקשר בין פפטיד mAb. למרות homobifunctional crosslinkers היו בשימוש 28, heterobifunctional crosslinker הם יותר נפוץ בבנייה של וירוס-derived פפטיד-ACs 22,23,26, 31,32. פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי את sulfosuccinimidyl crosslinker 4-(N-maleimidomethyl) ציקלוהקסאן-1-carboxylate (sulfo-SMCC) עבור קלות שימוש, מאחר שהוא משמש את נוגדן תרופתיים שאושרו תרכיב הרצפטין-emtansine, ברבים וירוס-derived פפטיד-ACs 8,22,23,26,31,32. נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) היא השיטה העיקרית לקביעת בתחילה יעילות ההטיה ועבור למחצה quantifying המספר של פפטידים לכל mAb. מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות שכותרתו fluorescently משני נוגדן ספציפי mAb היא בדרך כלל שיטת להערכת בתחילה מאפייני ההפצה תאיים של וירוס-derived ACs פפטיד-השתנה. עד כה, רדיואיזוטופים הם ראשי שתוכן המנות שנמסרו על-ידי וירוס, נגזר ACs פפטיד-השתנה. פילטרציה-מיכשור וציוד הם יתרון כי הרדיואקטיביות בתאי הוא לכמת בקלות על ידי ספירת גמא. בנוסף, ACs זה מתורגם העכבר מודלים של סרטן אנושיים מספקים החוקרים את היכולת להעריך את הגידול מיקוד באמצעות שיטות הדמיה מולקולרית כמו פליטת פוטון בודד שחושב טומוגרפיה ו טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) 23 , 32 , 33. באופן כללי, הבנייה ובדיקת בדיקות בשיטות בשימוש בעיקר על ידי חוקרים לספק הערכה טובה מאוד של ACs ששינה עם פפטידים נגזר וירוס בשלב הפיתוח ביעילות להזין ולספק מנת תוכן בתוך התאים היעד וכדי היעד גידולים.

Tat - ו NLS-השתנה ACs יש מואר אזורי המפתח לשיפור נוסף המטען בתוך תאי סרטן, גידולים. ביחס NLS-השתנה ACs, היעילות הצטברות תאיים יכול להיות צנוע 23,31,34. הצטברות תאיים לא יעיל נגרם מלכוד endosomal המשך. In vivo מיקוד הגידול יכול גם להיות פחתה עם שני Tat, NLS-מהונדס ACs. רצפי פעיל בלשכת המידע לתיירים, NLS להכיל מספר שאריות טעון חיובית. כאשר מחובר mAbs, החיוב הכולל cationic יכול להיות מוגבר באופן משמעותי 35. כתוצאה מכך, תאת, NLS-מהונדס ACs מוגברת ספיגת ברקמות בריאות, גדל סיווג דם מהירה.

הקבוצה שלנו פיתח תרכובת composite המורכב חומצה כולית מקושר NLS (ChAcNLS; איור 1). ChAcNLS-השתנה ACs מסוגלים להגביר הצטברות תאיים של רדיואיזוטופים ונמסרו ולשפר את הגידול מיקוד בהשוואה NLS-השתנה ומסורתיים ACs 33,34. המנגנון מאחורי חומצה כולית בהשראת היכולת של וירוסים nonenveloped בחר לא יכול להסתמך על קרום פיוז'ן לנצל חומצה כולית לעורר אנדוזום לברוח דרך היווצרות ceramide. לדוגמה, וירוס המעית חזירי מגייס חומצה כולית שמפעיל sphingomyelinase, אשר ה מזרז הידרוליזה של ספינגומיילין לתוך ceramide 36,37,38. זה שיערער ממברנה endosomal ומאפשר וירוס בריחה. לפיכך, חומצה כולית היא רכיב נגזר וירוס נוסף המהווה השלמה של NLS.

כפי שדה זה נע קדימה ובעתיד הפיתוחים להתרחש המטען על ידי ACs ששינה עם וירוס-derived פפטידים, זו תקופה המתאים לספק הפגנות חזותי של המאפיינים שלהם הביוכימי ופונקציונליים במהלך הפיתוח. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו על הערכה ראשונית של וירוס-derived ACs פפטיד-השתנה לקביעת אך פשוט יעיל הצטברות תאיים והיעדים הגידול במהלך שלב התפתחות מוקדמת. אנו משתמשים mAbs זמינים מסחרית 7G 3 ו A14 כמערכות מודל לדוגמה. הליך 1 מתאר את השימוש מרחביות-דף כמו שיטה המאפשרת להחלטות 'ללכת קדימה/לא' עבור ACs נבנה. הליך 2 מתאר שיטה באמצעות trypsinization המאפשר ויזואליזציה משופרת של הפצה תאיים AC, הצטברות. הליך 3 מתאר שיטה משופרת תאיים fractionation לקבוע במדויק לוקליזציה גרעינית. בהליך זה אנו מנצלים את המטען 64Cu (t1/2 = 12.7 h) כי זה פגיעה בזרימת הסלולר והוא פולט פוזיטרון 10. כך, הליך 4 מתאר ויוו הגידול מיקוד אפיון על ידי חיית המחמד הדמיה להמחיש ספיגת גידול ביחס רקע (דהיינו nontarget בריא רקמות) ולקבוע הדוגמה AC יכולים במיוחד וביעילות גידולים היעד. שיטות אלה מספיקים לחוקרים בפיתוח ACs ששינה עם פפטידים נגזר וירוס לזהות את המועמדים לקידום בהמשך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אין ויוו בעלי חיים הניסויים המתוארים בוצעו על פי פרוטוקול שאושר, תחת ההנחיות האתית של ועדת האתיקה מרכז Hospitalier Universitaire דה שרברוק לניסויים בבעלי חיים.

1. נוגדנים פפטיד ההטיה

הערה: ChAcNLS יכול להיות מסונתז כל יצרן פפטיד מסחרי או פפטיד האוניברסיטאי סינתזה שירות פלטפורמה. הסינתזה של ChAcNLS ניתן למצוא התייחסות 34. לקבלת הליכים 1 ו- 2 השתמש mAb 7G 3, אשר הוא ספציפי אנטיגן לוקמיה IL-3Rα 39.

  1. צינור microcentrifuge 1.7 mL, הכן 10 מ"ג/מ"ל (נוגדן סה כ ~ 1 מ"ג) הפתרון של 7G 3 בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.6.
  2. להמיס sulfo-SMCC ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-ריכוז של 5-10 מ מ. Vortexing הפתרון ביסודיות פועלת באופן הטוב ביותר על מנת להשיג התפרקות מוחלטת.
  3. הוסף הצינור המכיל 7G 3 הפתרון מומס sulfo-SMCC (בדרך כלל בין 5-20 μL בהתאם היחס טוחנת של sulfo-SMCC-כדי - 7G 3 הרצוי). מומלץ בדיקת sulfo-SMCC-כדי - 7G 3 יחס של 10 - 25-, 50 ל-1. דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
  4. לטהר ולרכז את 3 7G maleimide derivatized באמצעות חילופי התקן ומאגר אולטראפילטרציה ב- PBS, pH 7.0. צנטריפוגה ב 8000 g x עבור 5 דק להשליך לזרום ולמלא עם PBS, pH 7.0 צנטריפוגה שוב.
    1. ביצוע זה 7 - 8 פעמים להחליף לחלוטין את המאגר. חלבון לשחזר 3 7G מרוכז על-ידי הצבת המכשיר מסנן הפוך צינור נקי microcentrifuge. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב- 1000 g x. שחזור נפח צריך להיות כ 0.3 מ"ל
  5. בצינור המכיל את 3 7G maleimide מופעל, להוסיף 2-fold טוחנת עודף של ChAcNLS ביחס היחס sulfo-SMCC-כדי - 7G 3 בשימוש בשלב הקודם, דגירה בין לילה ב 4 º C. לדוגמה, אם יחס sulfo-SMCC-כדי - 7G 3 10 ל-1 שימש, השתמש יחס ChAcNLS עד 7G 3 20 ל-1. הנפח הכולל באופן משמעותי לשנותן.
    הערה: למרות ChAcNLS אינו גורם משקעים במהלך תהליך ההטיה זה אפשרות יכול להתרחש עם פפטידים אחרים. לבחון את הצינור במהלך התגובה סימנים של משקעים, אשר ככל הנראה נגרמת כאשר פפטידים הידרופובי. במקרים אלה ייתכן ששווה לבקר שוב את פפטיד עניין על מנת לעצב שינויים כדי לספק hydrophilicity מוגברת.
  6. לרכז את ג'י 7 3-ChAcNLS שימוש בהתקן אולטראפילטרציה ל- exchange ריכוז ומאגר הרצוי ב- PBS pH 7.4 (ראה שלב 1.4). התשואה שחזור של חלבון הכולל צריך להיות ≥ 75% חומר המוצא המקורי.
  7. לבצע מרחביות-דף להערכת המועמדים 3-ChAcNLS ג'י 7 נבנה באמצעות ג'ל לזיהוי 12% (מספק מספיק הפרדת ChAcNLS מצומדת כבד והדליקו רשתות של רשתות nonconjugated). מיקס 10 μg של ג'י 7 3-ChAcNLS בדף טעינת מאגר המכיל 2 μL β-mercaptoethanol וטען לבאר.
  8. הגדר את המתח המתאים (120 V עבור 1h לציון 12% ג'ל) ולהפעיל את אלקטרופורזה. לעצור את אלקטרופורזה כאשר החזית לצבוע Coomassie מגיע לתחתית של הג'ל.
    הערה: אל תתנו החזית לצבוע Coomassie ברח הג'ל.
  9. הסר ג'ל אלקטרופורזה המנגנון ולשטוף עם destaining המכילה 10% v/v של חומצה אצטית ו-20% מתנול וי/v.
  10. לקחת תמונה של הג'ל ונדד עם סרגל ולמדוד המרחק (בס מ) את הסטנדרטים, 7G 3 conjugates. לחשב את ערך השמירה פקטור (Rf), אשר הוא המרחק היגרו מחולקת לפי אורך ג'ל (מאיפה חלבון טעון לחזית ההעברה Coomassie). להתוות את המשקל המולקולרי (MW) יומן נגד הערכים Rf של כל חלבון סטנדרטית, לשער את הגודל של 7G 3 conjugates.
  11. לחשב המספר של פפטידים לכל נוגדן על-ידי חלוקת ההבדל ב- MW 7G 3 conjugates ולא יבוצעו בהם שינויים 7G 3 מאת 1768.5 g/mol (MW של ChAcNLS).
  12. תמונות דיגיטליות של הג'ל שהוכתמו Coomassie ולבצע ניתוח densitometry. בשלב זה, הבחירה של מועמד מוביל יכול להיות מבוסס על ה-AC עם מספר מרבי של מולקולות ChAcNLS שאינו מכיל מינים צבירה משמעותית.

2. מיקרוסקופיה קונפוקלית להערכה הצטברות תאיים

הערה: חשוב לבחון את מידת הבררנות תא של תאיים הצטברות mAbs פפטיד-השתנה לפני פיתוח פורמולציות עם תוכן מנה של עניין. כי Tat גם הוכח יש נטייה חדירה לתא ספציפי, זה שווה הראשון וניתוח תאיים הצטברות ותא סלקטיביות לפני שיחתמו שלבי פיתוח יקר עם מטענים יקר. מסיבה זו, נוהל 1 צריך גם לשנות isotype פקד מסוים לא רלוונטי mAbs. למשך שארית הפרוטוקול נעבוד עם ACs ששינה עם 10 מולקולות ChAcNLS לכל נוגדן. שרטוט כולל שלבי מפתח עבור שגרות 2 ו- 3 מתוארת באיור2.

התראה: שלב זה של הפרוטוקול כרוך את הטיפול מניפולציה של paraformaldehyde. אנא עקוב אחר ההוראות היצרן בעת הטיפול.

  1. פנקו התאים היעד TF-1a עם 200 ננומטר של 3 ג' 7-כולל ChAcNLS ששינה שליטה mAbs. דגירה 5 x 106 תאים אנטיגן-חיובית עם conjugates עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר 1 h, להסיר את תגובת שיקוע, לשטוף עם 1 מ"ל 3 x ב- PBS קר כקרח. הוסף מדיה טריים, תקופת דגירה של שעה נוספת ב 37 º C.
  3. לאחר שעה נוספת, להסיר את תגובת שיקוע ולשטוף 3 x ב- PBS קר כקרח 1 מ"ל. להוסיף 0.5 מ של PBS המכיל טריפסין 0.25% וחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 עד 30 דקות.
    הערה: במהלך הפיילוט הראשוני בדיקות מומלץ לא trypsinize התאים על מנת לקבוע את ההבדלים הצטברות תאיים AC. פרוטוקול זה מקדם את השימוש של טריפסין, נדגים איך זה משפר את הערכת יעילות תאיים הצטברות של מועמדים AC שונה.
    1. לבדוק את זמני שונים עבור דגירה על-ידי בדיקה חזותית של כל התאים מנותקת. בנוסף, דגירה תא aliquots עם הכדאיות מכתים פתרונות ולבצע ניתוח תזרים cytometric כפי שתואר לעיל 40.
    2. לנטרל טריפסין 1.5 מ של תרבית תאים RPMI 1640 media/10% שור סרום עוברית. צנטריפוגה תאים ב 500 x g למשך 5 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, לשטוף 3 x ב- PBS קר כקרח 0.5 mL.
  4. תיקון התאים ב- PBS 0.5 mL המכיל 1% paraformaldehyde ו- 1% סוכרוז בקרח במשך 30 דקות לשטוף תאים 3 x ב- 0.5 מ"ל PBS קר כקרח, צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דק Permeabilize תאים ב- 0.5 מ"ל PBS הכולל. 0.15% טריטון X-100 למשך 5 דקות על קרח. לשטוף את התאים ב- PBS קר כקרח וחזור צנטריפוגה.
  5. להשעות את התאים ב- PBS 0.1 מ"ל המכיל 2 μg/mL (או היצרן על-ידי ריכוז) של אנטי-murine (isotype ספציפי) fc של נוגדן polyclonal משני מצומדת כדי AlexaFluor 647 לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
    1. צנטריפוגה ב 250 g x עבור 5 דקות ושטוף תאים 3 x ב- PBS קר כקרח 0.5 mL. להשעות התאים ב- 0.5 מ"ל PBS.
      השהיה: תאים ניתן לאחסן במקרר.
      הערה: זה חיוני כדי לבחור נוגדנים משניים מזהה את isotype הנכון של mAb עניין. AF647 נבחרה בגלל פליטת אינפרה אדום רחוק שלה, אשר לא מפריע propidium יודיד (PI) צביעת של הגרעין.
  6. להוסיף PI ריכוז μg/mL 10 אל המיכל עם תאים. בשלב הבא, הר עונה 1 פרק 10 תאים5 על גבי זכוכית שקופיות באמצעות מדיה הרכבה ולכסות עם coverslip זכוכית.
  7. לבדוק תאים עם תוכנית Apo 60 X שמן טבילה יעד נה 1.42 על לייזר הפוכה מיקרוסקופ קונפוקלי סורק. לזהות קרינה פלואורסצנטית PI באמצעות לייזר ארגון 488 ננומטר ו את המנסרה סריקה ספקטרלי להגדיר עבור 600-650 ננומטר. זריחה AF647 לשימוש לייזר הליום-ניאון nm 633, את המנסרה סריקה ספקטרלי להגדיר עבור 650-700 nm. לאסוף פליטת קרינה פלואורסצנטית PI ל- AF647 ברצף.
    הערה: השתמש באותה ההגדרה ברחבי הערכה והשוואה בין התאים. עם זאת, יהיה עליך לכוונן הגדרות עבור תאים trypsinized לעומת תאים שאינם trypsinized.
  8. השתמש בתוכנה מיקרוסקופ כדי לרכוש תמונות. איסוף תמונות בעזרת טורי אופקי אופטי מקטעים של 1,024 x 1,024 פיקסלים עם 2 X קו בממוצע שצולמו במרווחים μm 0.5 עד עובי התא כולו. להציג התמונות מוערמות כמו z-תחזיות מתוך ארבע פרוסות רצופים עוצמת קרינה פלואורסצנטית המרבי.
  9. לנתח תאים עם מיקרוסקופ תוכנה. לתעד את התבנית הסלולר הפצה של conjugates. באופן ספציפי, להעריך אם תאיים פלורסצנטיות בציטופלסמה מקובצים, ליד התא משטח או מפוזר ולא הומוגנית. גם להעריך את עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי בכל תא.

3. radiolabeled Fractionation הסלולר על ההערכה של 64 משלוח תאיים Cu יעילות ובניה AC

התראה: הליכים 3 ו- 4 כוללים טיפול מניפולציה לרדיואקטיביות. לפני ביצוע שלבים אלה, חוקרים צריכים אישרו הדרכות בנושאי בטיחות ופרוטוקולים שאושרו מ הרשות לבטיחות קרינה של המוסד בבית שלהם.

הערה: ההליכים 3 ו 4 נשתמש mAb A14, אשר הוא ספציפי אנטיגן סרטן שלפוחית השתן פולשנית IL-5Rα41. בנוסף, כל ניסויים הן זמן רגיש בשל זמן מחצית החיים הקצר של 64Cu. באופן כללי, זה הכי טוב כדי לא לחכות השבוע 1 ביצוע ניסויים במבחנה , לא יותר מ- 72 h ללימודי אין ויוו .

  1. צינור 1.7 mL להשעות חומצה 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic (NOTA-NHS) ב דימתיל סולפוקסיד כדי ריכוז של 10 מ מ.
  2. 50-fold שן טוחנת עודף של NOTA-NHS עם A14 (2 mg החל חומר) במצבים של 0.1 M סודיום ביקרבונט ב- pH 8.6 לשעה בטמפרטורת החדר ב- ≤ נפח 0.5 mL (האחסון NOTA-NHS הסופי לא יעלה על 2% v/v של הנפח הכולל).
  3. לטהר ו NOTA מאגר exchange-שימוש בהתקן אולטראפילטרציה ב- PBS, pH 7.6 (ראה שלב 1.4) A14.
  4. עבור מצורף עוקבות של ChAcNLS, בצע את שלבים 1.2-1.6.
  5. להגיב NOTA-A14-ChAcNLS (250 μg אצוות) עם 100 מגה בקרל (MBq) של 64CuCl2 ב 0.1 M סודיום ביקרבונט, pH 5.5 h 1-37 מעלות צלזיוס ≤ 0.1 מ"ל. 64 Cu מופק על ציקלוטרון TR-PET-CIMS 42.
  6. להתרכז 64Cu-A14-ChAcNLS ב- PBS pH 7.4 שימוש בהתקן אולטראפילטרציה לריכוז הרצוי (ראה שלב 1.4).
  7. לקבוע את היעילות radiolabeling של 64Cu-A14-ChAcNLS על ידי שכבת דק מיידית כרומטוגרפיה (ITLC) באמצעות כרומטוגרפיה רצועות ו- 0.1 M, pH 5.5 סודיום ציטרט (ITLC eluent) בתור ממיס. החל aliquot 0.5 μL של הפתרון התגובה לרצועת ITLC. ביצוע של autoradiograph על רצועת ולקבל תמונה דיגיטלית.
    1. לבצע densitometry כדי להשיג את הפרופורציה של מאוגד ואת חינם 64Cu. אם חינם 64Cu תוכן > 5%, לחזור לשלב הקודם ולבצע טיהור נוסף.
    2. בנוסף, לבצע מרחביות-דף עם Coomassie מכתים כדי להעריך את הסיכומים. לבצע השני מרחביות-עמוד ולאחריו autoradiograph של הג'ל כדי לקבוע אם ישנם מינים צבירה radiolabeled.
  8. זיקה מחייבת איכות צ'ק פוינט: דגירה 64Cu-A14 conjugates-ריכוז (0-100 ננומטר) בכפילות עם עונה 1 פרק 106 תאי היעד לכל mL. להערכת איגוד לא ספציפית, מערבבים כפולים דוגמאות conjugates 64Cu-A14 עם תאים בנוכחות עודף טוחנת 100-fold של A14 ללא תווית.
    1. לאחר דגירה 1 h על קרח, לשטוף את התאים ולספור נוגדן מאוגד הכולל דוגמאות ודוגמאות הכולל נוגדן ספציפי מאוגדים ב מונה גמא. גרף איגוד ספציפי (נוגדן מאוגד סה כלא ספציפית מאוגד נוגדנים) נגד תגובתי חינם 64Cu-A14 (ננומטר) בשימוש וזמינותו. לקבוע את קבוע דיסוציאציה (Kd) על ידי רגרסיה לא ליניארית באמצעות תוכנה graphing.
  9. ללימודי לצבירה התאית Cu 64: יטפל בתאים עם 100 ננומטר של 64A14 התווית על-ידי Cu conjugates עבור h 1, 6-אייץ ', ותיאר 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס כאמור33. לכלול פרמטרים נוספים כגון טיפול בנוכחות A14 יאומתו לאתרים בלוק IL-5Rα ו- 4 ° C כדי לחסום את קולטן בתיווך הפנמה.
  10. בזמן מוגדר נקודות, כשלב שתואר ב- 2.3 - 2.3.2, להוסיף 0.5 מ של טריפסין 0.25% המכיל PBS, EDTA ב 37 ° C ואחריו ניטרול, כביסה.
  11. דגירה תאים קרום פלזמה פירוק מאגר המכיל 1% NP-40, 10 מ מ טריס pH 7.5, 10 מ"מ NaCl, 3 מ"מ MgCl מאגר2 על קרח במשך 10 דקות Centrifuge התאים קרום פלזמה-lysed-90 g x עבור 5 דקות.
  12. להסיר את תגובת שיקוע ולמקם בצינור טריים. זה מייצג cytoplasmic שבר. לשטוף את הגרעינים 3 x ב- PBS קר כקרח ולהוסיף שוטף השבר cytoplasmic.
  13. ודא מבחנות שמכילות את השברים גרעינית, cytoplasmic חתומות. ואז למקם אותם בגמא מונה מכויל עבור 64Cu כדי להמיר ספירות raw MBq.
  14. לקבוע את טיב בידוד גרעינים על ידי ביצוע ניתוח תספיג ג / עדנה לדאני ורד, חלבון גרעינית מוגבלת של Rab7, חלבון cytoplasmic שפע על כל תא lysate, הגרעיניים, ושל cytoplasmic שברים.
    1. פינוק 5 x 106 תאים עם 500 μL של רדיו-immunoprecipitation assay (ריפה) מאגר, המאגר פירוק קרום פלזמה ב צעד 3.12 המכיל 1%, 2% ו 4% NP-40. יתר על כן, לפנק את הגרעינים מבודד μL 500 ריפה המאגר כדי לקבל חלבונים גרעיניים מבודד.
    2. לזרז חלבונים תא מבודד גרעינית, cytoplasmic, כל שימוש 4 x נפח דגימה של אצטון קר עבור 60 דקות ב-20 ° C. צנטריפוגה ב 13,000 g x 10 דקות, decant תגובת שיקוע נזהר שלא לסלק בגדר חלבון. להוסיף 100 μL ל- PBS לפירוק חלבונים.
    3. לטעון μg 10 החלבון לתוך כל טוב של ג'ל מרחביות-דף 10%. לבצע אלקטרופורזה כמתואר ב- 1.7-1.9. לבצע העברה המערבי כתם כפי שתואר קודם לכן ב- refeference 43.
    4. לזהות את הסולם סמנים הכי מתאימות MW של ~ 40 kDa. לחצי הקרום-סמן זה. לחקור את האבן החשופה המכיל את החלבונים MW גבוה עם נוגדנים Lamin A/C-ספציפיות. בדיקה הקרום עם החלבונים MW התחתון עם נוגדנים ספציפיים 7 ראב. תספיג חלבון היא טכניקה ידועה ותיאר לא ב פרוטוקול זה.

4. מחמד הערכה הדמיה של הגידול מיקוד

הערה: הטכניקות של השתלת תאים סרטניים בעכברים כדי להפיק הטרוטופיות xenografts ידועים היטב ויש רוב מעבדות פרוטוקולים ללא צורך במיקור חוץ, שנתפרו במיוחד עבור מערכת הגידול שלהם. לכן, זה אינו מכוסה בפרוטוקול. המודל xenograft יהיה nonobese סוכרת/חמור משולב immunodeficient (הנהון/SCID) עכברים הנושאת גידולים בשלפוחית השתן פולשנית IL-5Rα-חיוביות HT-1376 ו- HT-B9. תאים סרטניים IL-5Rα-חיוביות פולשנית שלפוחית השתן מהווים > 66% של תאים הכולל xenograft. לעומת זאת, רק ~ 11% של תאים IL-5Rα-חיוביות HT-B9 נכללו xenografts המפותחות41. לכן מודל זה מספק דוגמה מצוינת להערכת AC הגידול פילוח שני גידולים המייצגים הגידול הנראה לעין החולה הטרוגניות.

  1. קבוצות המכילות ≥ עכברים (הנהון/SCID) 4, להזריק μg 20-30 (6-9 MBq) של 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS 64Cu-A14 לווריד הזנב.
  2. באותו היום במקום פנטום גלילי (24.8 מ"ל) המכיל 5 MBq של 64Cu להמיר את ספירת רדיואקטיבי לשניה במינון מוזרק לגרם של רקמות (%ID/g).
  3. המתן 48 שעות ולאחר מכן עזים ומתנגד עכברים על-ידי הצבתם תא אינדוקציה עם 1.5 ליטר/דקה של זרימת חמצן עם 2% איזופלוריין. להחיל משחה אופטלמולוגיות סטרילי לעיניים העכבר לאחר הגיוס ולפני השמה לתוך סורק PET.
  4. במהירות העברת העכבר לטבלה סורק PET במצב שכיבה בדיוק עם קונוס האף עבור איזופלוריין. מיקום הנשימה ואת הגששים רקטלי הטמפרטורה בצג וקצב נשימה כדי להבטיח כי בתנאים פיזיולוגיים נשמרים במהלך הניסוי כאמור תיאר 44.
  5. התחל רכישת נתונים מחמד באמצעות הגדרת מצב דגימה רגיל וחלון אנרגיה של 250-650 קוו. בדרך כלל, סריקה סטטי של 45 דקות לכל העכבר מספיקה לספק מספיק אירועים וצירוף עבור שחזור וייצור של חיית המחמד תמונות באיכות גבוהה.
  6. לאחר הסריקה 64Cu-AC, להסיר את העכבר הסורק ולמקם אותו חזרה לכלוב. לאפשר העכבר כדי לשחזר מספיק לפני שחזר המתקן בעלי חיים.
  7. להשיג תמונות שוחזר באמצעות 20 חזרות של אלגוריתם למיקסום הציפיות הסבירות המרבית תלת מימדי.
  8. לבצע באזור של הריבית (ROI) ניתוח של הגידול ואיברים למהירים באופן חזותי באמצעות התוכנה אמיד.
    1. לצייר ROIs להשיג נתונים כמותיים %ID/g על ידי באופן ידני באמצעות הגדרת הכלי ביד חופשית תלת-ממד, בזהירות ניסחו הגידולים או לשריר הירך הסמוך. הסעיפים לפיקסל ברועי יומר %ID/g מהשלב הקודם 4.2.
  9. השווה 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS תמונות חדות הגידול, רועי כמותיים % מזהה/g ואת הגידול-על-רקע יחסי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נוהל 1, הקמת 7G 3 ששינה עם ChAcNLS באמצעות sulfo-SMCC כמו crosslinker הוא מאוד אמין. בדרך כלל, כאשר מעמיסים אותו על 12% ג'ל נותחו על ידי עמודים מרחביות, התוצאה ניתן להבחנה stepwise העלאות MW פרופורציונאלית לגדילת sulfo-SMCC-כדי - 7G 3 יחסי המשמש ומאפשר השלשלאות קל להעריך בנפרד ChAcNLS ההטיה (איור 3). 7 גרם 3 הגיבה ב 10 - 20, 25-, 50 ל-1 sulfo-SMCC-כדי - 7G 3 יחסי ואחריו Rf למדידה ו תוצאות אקסטרפולציה MW 3, 7, 10, 20 ChAcNLS מולקולות לכל 7G 3. מאת densitometry, המין מונומר אחוז הוא > 90% 3 7G שופרת ChAcNLS 3-10. ג'י 7 3-ChAcNLS20 מינים הצבירה הוא 45%. זה מדגים שמרחביות-דף היא פשוטה אך יעילה לבחירת ג'י 7 3-ChAcNLS נזווג עבור פיתוח נוסף. למרות, מריחת קלה עם שרשראות נוגדנים יכולה להתרחש בשל גליקוזילציה נוגדן זה אינו מפריע הזיהוי של מינים צבירה.

2 נוהל, הנתונים נציג מדגים ההבדלים בין שימוש טריפסין, אין טריפסין בעת הערכת נגזר וירוס מהונדס פפטיד ACs עבור הצטברות יעילות תאיים. בדוגמה זו, ניתן להעריך את היכולת של ג'י 7 3-ChAcNLS כדי להגדיל את הצטברות תאיים בתאים מטופלים עם ובלי טריפסין (איור 4). עם זאת, החשיבות של trypsinization מתבטא בעת פירוש הצטברות conjugates המשמש להשוואה כדי לקבוע יעילות AC ואת סלקטיביות. Trypsinization מאפשר רמת קרינה פלואורסצנטית תאיים בסיסית שתוקם כפי שנצפה עם 3 7G שלא שונתה. אחד ניתן פירוט כי 7G 3 הינה מוגבלת אל הציטופלסמה של מוקדים קטנים. לעומת זאת, התאים הם לא trypsinized, ג'י 7 ספציפי ל- 3 הוא מוגבל השטח התא כתוצאה ביטוי של IL-3Rα על פני התא. זה מקשה לחקור הצטברות תאיים והפצה כי זריחה על פני תא חולש ובכך חוסם את קרינה פלואורסצנטית תאיים של להיות דמיינו. Trypsinizing תאים חשוב גם בעת הערכת ירידה לפרטים כראיה עם IgG-ChAcNLS. אנו יכולים לראות שיש כמה פלורסצנטיות שאינם ספציפיים מהמשטח תא אבל לא יהיה מסוגל לקבוע את הרמה של הצטברות תאיים הנגרמת על ידי פפטיד אם התאים לא היו trypsinized. לבסוף, ללא trypsinization אחד יכול לפרש בטעות כי AC פיתח אינה צוברת בתוך התאים היעד. כפי שניתן לראות עם ג'י 7 3-NLS, התאים שאינם trypsinized הרוב המכריע של קרינה פלואורסצנטית הוא שוב מעל פני השטח של התא. לאחר trypsinization, אחד ניתן להבחין כי ג'י 7 3-NLS לצבור, מבורכות, בתוך תאי היעד.

3 הליך, הנתונים נציג מדגים בקרת איכות ליעילות משלוח המטען הבנייה, זיקה ו במבחנה וספציפיות עבור radioisotope 64Cu עם A14-ChAcNLS. Densitometry מתבצע על רדיוגרפי תמונות שנלקחו 12% לזיהוי ג'ל המכיל 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, או 64Cu-A14-ChAcNLS כי conjugates radiolabeled הם 100% מונומר מינים (איור 5A). 64 Cu-A14-ChAcNLS מראה nanomolar אהדה IL-5Rα. A14-ChAcNLS כפונקציה של ריכוז 64Cu-A14-ChAcNLS גילה איגוד ספציפי ניגש רוויה בריכוזים של 3-5 nM HT-1376 והן HT-B9 תאים (איור 5B). Kd במשך 64Cu-A14-ChAcNLS-HT-1376 ותאים HT-B9 היה 6.4 ± 1.7 nM ו 3.1 ± 0.8 nM, בהתאמה. ChAcNLS ההטיה צמצמה את זיקתו של A14 כ 2.5-fold עבור IL-5Rα-HT-1376 ותאים HT-B9. גמא סופר מגלה כי העלייה לרדיואקטיביות בגרעין, בציטופלסמה מועברים על ידי 64Cu-A14-ChAcNLS הוא ספציפי ומגביר לאורך זמן (איור 6). גמא סומך בדרך כלל מדגים כ > 6-fold עלייה גרעינית, תאיים הצטברות תאים שטופלו 64Cu-A14-ChAcNLS לעומת טיפול עם 64Cu-A14-ChAcNLS בנוכחות עודף A14 שלא שונתה או כאשר הטיפול מחקרים מבוצעים ב 4 ° C (איור 6A). יש גם ≥ מקופלים ל- 3 לודיג גרעיני ונבדק תאיים הצטברות 64Cu יחסיות לתאים שטופלו 64Cu-A14 ו 64Cu-אג-ChAcNLS בנקודות זמן כל (איור 6B).

איור 7 מדגים את החשיבות של פרוטוקול fractionation תא. תאים HT-1376 ו- HT-B9 היו מודגרות עם קרום פלזמה פירוק מאגר המכיל 1%, 2% או 4% NP-40. גרעינים בודדים להכיל אך ורק Lamin/ג. בהתאם שברים cytoplasmic צריך להיות בלעדית עבור Rab7. כפקד, lysed עם מאגר ריפה כל התאים צריכים להיות חיוביים עבור מזגן מיטל שני שברים. פרוטוקול זה מראה כי בעת הערכת השבר הגרעין של תאים HT-1376 lysed, יש Rab7 לא נוכח. בנוסף, יש אין מזגן מיטל נוכח השבר cytoplasmic. עם זאת, יש כמות מופחתת של Rab7 בציטופלסמה שנלקחו תאים lysed עם 4% NP-40 (איור 7 א). הדבר מצביע ככל הנראה על שמאגר פירוק NP-40 זה 4% מפריעה קרום גרעיני בנוסף קרום פלזמה. זו התוצאה שילוב בין חלבונים גרעיניים עם חלבונים cytoplasmic, ובכך מחליש את הריכוז של ראב 7. זה מסביר את כמות מופחתת של ראב 7 הנוכחי. HT-B9 תאים רגישים יותר מאשר HT-1376 תאים. כאשר מטופלים עם קרום פלזמה פירוק מאגר המכיל 4% NP-40, מיטל מזגן הוא לראות בבירור השבר cytoplasmic (איור 7 ב). יש ירידה המתאימים בסכום של מיטל/ג השבר הגרעין. HT-B9 תאים רגישים גם ב- 2% NP-40 פירוק מאגר כמו מידת Rab7 של השבר cytoplasmic בעליל מופחת ביחס 1% NP-40. לפיכך, אחד צריך לייעל fractionation הסלולר עם תאי מסוים של עניין כך תוצאות כמותיות ההצטברות המטען גרעין והמרחב תאיים מדויקות. זה חשוב להערכת היעילות של גרעיני לוקליזציה של רומן AC.

4 נוהל, מאפשר דימות PET-48 שעות לאחר הזרקה של 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS או 64Cu-A14-ChAcNLS בעכברים הנושאת HT-1376 ו- HT-B9 הטרוטופיות xenografts על רגליו האחוריות מול עבור הפריט החזותי של גידול פילוח נכסים (איור 8). בדוגמה שלנו, בדיקה ויזואלית של תמונות חיות מחמד חושף את HT-1376 ו- HT-B9 הגידול יכולות של 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14 64Cu-A14-NLS (איור 8A). עם זאת, במקרים בהם בדיקה ויזואלית קשה כמו עם גידולים HT-B9, רועי ניתוח יכול לשמש כדי לקבוע יחסי גודל הגידול-כדי-שריר (איור 8 ב').

Figure 1
איור 1: שינוי-ChAcNLS mAbs. שאריות של NLS של SV-40 גדול T אנטיגן (KKKRKV) הם דחוקה בין שאריות מרווח כתרים על ידי ציסטאין N-מסוף. חומצה כולית (סוגר מרובע ירוק) הוא מצמידים ציסטאין כפי שתואר לעיל 34. לאחר הבנייה, טיהור של ChAcNLS, הקבוצה sulfhydryl ציסטאין משמש ההטיה באמצעות sulfo-SMCC (סוגר מרובע אדום; מוצג כבר קשור mAb). הערה: mAb (150 kDa) ו ChAcNLS (1.8 kDa) הם לא לשינוי גודל. הותאם והוא התפרסם בכתב באישור פאקט, מ' ואח NLS-כולית ההטיה חומצה כדי נוגדן IL-5Rαspecific משפר את צבירה התאית, מאפייני פילוח הגידול ויוו במודל סרטן שלפוחית השתן. כימיה Bioconjugate. doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077. (2018).
-

Figure 2
איור 2: סכמטי של גישה טיפולית AC תא ועיבוד עוקבות עבור ניתוח לפי מיקרוסקופיה קונפוקלית ועבור ניתוח של איכות Fractionation תא. חצים אדומים תואמות שלבים חיוניים 2.2, 2.3, 3.15 ו- 3.15.4. מותאם והוא התפרסם בכתב עם הרשאה מ Beaudoin, ChAcNLS et al. ס, הרומן השינוי לברוח נוגדן-Conjugates המתיר יעד ספציפי תא Endosomal, לוקליזציה גרעין, והצטברות משופר הכולל תאיים. פרמצבטיקה מולקולרי. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).

Figure 3
איור 3: ניתוח של ChAcNLS-השתנה mAbs. הפחתת מרחביות-עמוד מראה הסולם פועל (L) עם משקולות מולקולרי התואם ב- kilodalton (kDa) ו- 3 7G יאומתו שרשראות קלות וכבדות כהפניות. המסלולים הבאים הם הלהקות ההעברה של הרשתות קל 3 7G ששינה עם 3, 7, 10, 20 ChAcNLS.

Figure 4
איור 4: ניתוח של mAb הפצה תאיים והצטברות. מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות הממחישות את 3 7G תאיים הפצה והצטברות פלורסצנטיות יחסית בתאי לוקמיה IL-3Rα-חיוביים שטופלו 7G 3, 7 G 3-ChAcNLS, IgG ו- IgG-ChAcNLS. תאים trypsinized או trypsinized לא לפני קיבוע. הגרעינים מוכתמים propidium יודיד (PI; אדום), צבע אנטי-murine-Fc-AF647 (mAb; ירוק), PI/mAb ממוזג. סולם הוא 50 μm. בתוך של טריפסין, אין קבוצות טריפסין, נרכשו תמונות עם הגדרות מכשיר זהה בין ACs שונים המוצגים. החלק טריפסין של איור 4 מותאמת מ refefence 34 עם הרשאה. הותאם והוא התפרסם בכתב באישור Beaudoin, S. et al. ChAcNLS, לערוך שינויים הרומן נוגדן-Conjugates המתיר יעד ספציפי תא Endosomal לברוח, לוקליזציה גרעין ומשופר הכולל הצטברות תאיים. פרמצבטיקה מולקולרי. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).

Figure 5
איור 5: 64Cu-A14-ChAcNLS טוהר ואהדה. (א) טוהר רדיוכימי של 64התווית על-ידי Cu A14, A14-NLS, A14-ChAcNLS שנבדקו על ידי מרחביות-דף ואחריו autoradiography. (B) עקומות איגוד ספציפי עבור 64Cu-A14 ו 64Cu-A14-ChAcNLS על תאים HT-1376 ו- HT-B9. קווי שגיאה מציינות סטיית התקן של הניסוי הופיעה שכפול. הותאם והוא התפרסם בכתב באישור פאקט, מ' ואח. ההטיה חומצה כולית-NLS כדי IL-5Rα-ספציפי נוגדן משפר את הצטברות הסלולרית ומאפיינים ויוו פילוח גידול במודל סרטן שלפוחית השתן. כימיה Bioconjugate. doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077. (2018).

Figure 6
איור 6: 64Cu גרעינית, תאיים הצטברות. נציג דוגמה טיפול תאי ביצע שהפקידים (קווי שגיאה מציינות סטיית תקן) כדי להדגים ירידה לפרטים (A) ו- (B) שיפור הצטברות של 64Cu-A14-ChAcNLS. ההצטברות % מוצג גרעין (לוחות שמאלה), שטח תאיים הכולל (לוחות נכון) ביחס הסכום הכולל של רדיואקטיביות בשימוש במהלך הטיפול של תאי סרטן שלפוחית השתן פולשנית IL-5Rα-חיוביות. קווי שגיאה מציינות סטיית התקן של הניסוי הופיעה שכפול. * מציין p ≤0.05.

Figure 7
איור 7: ניתוח של הליך Fractionation תא. תספיג חלבון גרעיני (A) ו- (B) Cytoplasmic שברים עבור מזגן למינציה (שהכלים העליונים; חצים אדומים) ו- 7 ראב (שהכלים התחתון; חצים שחורים) המתקבל טיפול של HT-1376 ותאים HT-B9 קרום פלזמה פירוק מאגר המכיל 1%, 2% או 4 % NP-40. תאים שלמים lysed עם מאגר ריפה שימש בקרה חיובית עבור מיטל/C ו- Rab7 שני שברים. פועל סטנדרטים (L) מתוארים רק ב שהכלים העליונים. שלושה חצים מוצגים עבור מיטל/C עקב שלה מספר איזופורמים. מותאם והוא התפרסם בכתב עם רשות מן פאקט, מ. et al. ההטיה חומצה כולית-NLS כדי IL-5Rα-ספציפי נוגדן משפר את הצטברות הסלולרית ומאפיינים ויוו פילוח גידול במודל סרטן שלפוחית השתן. כימיה Bioconjugate. doi:10.102/acs.bioconjchem.8b00077. (2018).

Figure 8
איור 8: In Vivo ניתוח של הגידול פילוח על-ידי הדמיה PET וניתוח ROI. (א) מחמד תמונות ב- 48 שעות לאחר הזרקה של עכברים הנד/SCID הנושאת HT-1376 (חצים אדומים) וגידולים HT-B9 (חיצים כחולים) מוזרק לווריד עם 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS 64Cu-A14-ChAcNLS. החץ הירוק הוא ספיגת בכבד. שריר רועי הציור מוצג עיגול בצבע ארגמן. (B) רועי HT-1376 ו- HT-B9 יחסי הגידול-כדי-שריר של ACs-48 שעות לאחר ההזרקה. קווי שגיאה מציינות סטיית התקן של הניסוי ב- n = 10 ROIs לכל העכבר (n = 5). * מציין p 0.05.

תאת
CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20
CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30
CGISYGRKKRRQRRR 29
GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25
TRQARRNRRRRWRERQRGC 26
NLS
CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27
חומצה כולית-CGYGPKKKRKVGG 34

טבלה 1: רשימת Tat, SV-40 גדול T אנטיגן נגזר פפטידים בשימוש AC שינויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יעדים עיקריים משלוח מערכתית של סוכנים אנטי סרטניים הם כדי להגדיל הצטברות בבית הגידול באתר, ספיגת בתוך תאים סרטניים, או להקטין תופעות לוואי לא רצויות ברקמות בריאות. משלוח AC ממוקד דים מולקולרית לתאי הגידול היא גישה מאוד מבטיח לטפל ולגלות גידולים. עם זאת, חוסר היעילות נגרם מלכוד אנדוזום ונשאר למטה השפלה lysosomal זרם מהווה אתגר חשוב. בעוד פרוטוקול זה מנצל את פפטיד ChAcNLS כדוגמא לבנייה של הדור הבא ACs, ההליכים המתוארים הם ומצוידת בכל AC שונה-פפטיד שפותחו במטרה להגדיל את כמות המטען ונמסרו תאיים כדי לפלח תאים סרטניים.

השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם: 1) זיהוי והגבלת MW גבוהה צבירה המינים; 2) trypsinization של תאים לפני ניתוח לקביעת הצטברות תאיים; 3) ביצוע אבטחת איכות של הליכים fractionation תאית; . ו-4) ביצוע הדמיה כדי להעריך את הגידול פילוח vivoאת חיית המחמד.

חשוב שההטיה של וירוס-derived פפטידים כדי mAbs לא תגרום גבוהה מינים צבירה MW נגרמת קרוב לוודאי crosslinking התפלגות בין mAbs. החשש הראשוני, צריך לטפל לפני מתקדמים נוספים. לנוע קדימה עם ACs פפטיד-השתנה המכילות צבירות לא רצויות יכול לתת תוצאות לספק עדות שקר על היבטים כגון הפרופילים משלוח המטען תאיים, ויוו . Maleimides תגובתי על mAbs הוא מה אחראי ככל הנראה לצורך צבירת קשרי ערכיות. פתרון אחד הוא להפחית את היחס sulfo-SMCC-כדי-mAb. אלטרנטיבה אחרת היא להשתמש N-acetyl נגזרות של חומצות אמינו כגון Cys, ליס, שלו, Ser ו חמישי במהלך פפטיד ההטיה mAb מופעל maleimide 45. הרשתות-הצד נוקלאופילי מסוגלים להגיב עם moiety maleimide של SMCC ולהקטין crosslinking אינטרה-נוגדן. לחלופין, ניתן להשתמש ההפרדה על ידי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה לאחר ההטיה לבודד מונומר מינים 45. ניתן גם לבצע בייעודי לאתר ההטיה של פפטיד על הנוגדן. לדוגמה, ניתן לשנות נוגדן פחמימות על ההטיה כדי פפטידים, אשר הראו לייצר ביעילות מונומר מינים 24.

מרחביות-דף עם 12% לזיהוי ג'לים היא שיטה יעילה וזולה כדי לקבל פרספקטיבה רחבה של גודל גדול הבדלים במין AC. אם עלייה % לזיהוי, הפרדת שרשראות כבדות התפלגות המינים יהיה קשה להבחין. לעומת זאת, אם משמש לזיהוי % מופחת, שרשראות אור נוטים להפעיל את הג'ל. מעבר צבע ג'ל המכיל 4-20% לזיהוי גם מספקים שמירה טובה משמרות עבור השלשלאות קל על ג'ל יחיד. בין אנליטי טכניקות שונות לניתוח למערכות ביולוגיות, כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים ו אלקטרופורזה נימי-מרחביות עדיפים מרחביות עמודים כדי להפוך את ההפרדה אפיון ACs 46. בכל זאת, למען חברה דמוקרטית-דף היא שיטה מוקדם ולא יקר כדי לנתח הבנייה הראשונית של הסוכנים האלה הרומן ואז להחליט על דרך הפעולה הבאה.

הדגירה של תאים בתמיסה המכילה 0.25% טריפסין (שלב 2.3), אשר מסיר מספר מרבי של התא-פני חלבונים ו- ACs מאוגד חשוב כי זה מאפשר הדמיה משופר עליות יחסית הצטברות תאיים בין התייחסות נוגדנים. המצלמה פרמטרים מוגדרים כדי ללכוד תמונות בעוצמת קרינה פלואורסצנטית המרבי. זאת בשל וריאציה מתא לתא בסכום של AC המצטבר. לפיכך, לכידת תמונות בעוצמה מקסימלית מאפשר עבור תאים עם פחות הצטברות AC גם ניתן להעריך. עם זאת, סרטן אנטיגנים בדרך כלל מאוד מבוטאים על תאים סרטניים. אם התאים היו לא נתון את תהליך העיכול על ידי טריפסין, ידי קרינה פלואורסצנטית שמקורם ACs על פני התא לשלוט בתמונה. בנוסף, ללא trypsinization פיתוח יכול להיות מוגבל עם ACs עם מאפיינים הצטברות תאיים העדינים אך משמעותית.

הבטחת איכות גבוהה fractionation הסלולר חשוב להעריך במדויק את ההצטברות של 64Cu בגרעין לעומת הציטופלסמה. היכולת של ChAcNLS כדי להגדיל את הצטברות תאיים AC ואת המטען נובע לוקליזציה פעיל אל גרעין 34. כמו וירוס העתידי-פפטידים מפותחות, פפטידים אלה עשויים גם בתרגום כדי לגרעין כחלק שלהם מנגנון כדי להגביר את היעילות המטען תאיים. לכן, חשוב שכי fractionation הסלולר להיות באיכות גבוהה לפרט במדויק את התהליך הזה. פרוטוקול זה מדגיש את חשיבות הערכת הגרעינים של סמני cytoplasmic וגם השבר cytoplasmic לסמני גרעינית. לדוגמה, Hu. et al., פיתח ממוזג ששינה עם פפטיד Tat, חקר הגרעין הצטברות המטען radioisotope 24. תספיג ןועברל calpain, חלבון cytoplasmic, שופע היה נוכח השבר הגרעין. זה היה קרוב לוודאי כי אלייזה גרעינית מסחרית שימשו. פרוטוקול זה הוכיח כי HT-1376 ו- HT-B9 תאים נדרשים ריכוזים שונים של NP-40 על מנת לבודד את הגרעינים מועשר עם ממברנות ללא פגע. כאשר lysed היו HT-B9 תאים עם מאגר המכיל 4% NP-40, מזגן עדנה לדאני ורד היה נוכח השבר cytoplasmic המציין הטיפול שיבשו גרעיני ממברנות המותר עבור מיטל/C להזין הציטופלסמה. אם השברים גרעינית, cytoplasmic אינן מבודדות בקפידה, זה יכול להיות קשה לזהות את התרומה של לוקליזציה גרעינית כדי צבירה כוללת תאיים. ישנם דיווחים של פפטידים ביולוגית, באופן מלאכותי-נגזר שמתמקדים תאים תאיים אחרים כגון רשתית תוך-פלזמית, גולג'י, ו המיטוכונדריה 47,48,49. לפיכך, בידודו של תאים תאיים הופכת יותר ויותר רלוונטי.

פרוטוקול זה מסיים עם תיאורה של 64Cu-A14-ChAcNLS מיקוד של HT-1376 HT-B9 גידולים. בדיקה ויזואלית של תמונות חיות מחמד באיור8, זה ברור על-ידי מוגברת גידול חיית מחמד אות יחסית מופחתת הסמוך סביב רקע 64Cu-A14-ChAcNLS יש מיקוד מעולה של גידולים HT-1376 ו- HT-B9 (איור 8A ). ניתוח ROI גם מדגים את היכולת להעריך את הגידול מיקוד. בדוגמה שלנו, אנו משתמשים רועי הגידול-כדי-שריר יחסי כדי לכמת את הגידול מיקוד ומדגימים 64Cu-A14-ChAcNLS הוא ה-AC סופריור (איור 8 ב'). הדמיית לחיות מחמד גם מאפשר הערכת AC sequestering באיברים בריאים. הכבד הוא האיבר העיקרי זה מעכל נוגדנים. איור 8A מדגים ספיגת בכבד משולה בעכברים מוזרק עם 64Cu-A14-ChAcNLS ועם 64Cu-A14. בשלב מוקדם זה פיתוח, נתונים אלה עולה ש-chacnls אינו גורם sequestering לא רצויות. 64 Cu יש תוחלת חיים של 12.7 ה', אשר אינו אידיאלי עבור ACs בעלי מחצית החיים של מספר ימים. כפי שתואר לעיל בפרוטוקול חזותית על-ידי Zeglis ולואיס, השימוש radioisotope מאריכים זירקוניום-89 (89Zr) הוא תוכן מנה של מחצית חיים פיזית אשר הינו אידיאלי עבור mAbs והוא יכול לדימות על ידי חיית המחמד 50. לפיכך, להערכת הגידול משלוח במשך מספר ימים, 89Zr הוא הבחירה המועדפת. הדבר חשוב במיוחד אם טיפול היא מטרה איפה הגידול גבוהה ספיגת היא חיובית ומגביר לאורך זמן עם נוגדנים 7. Biodistribution יש גם לבצע כדי לקבוע איברים בודדים ספיגת להעמיק ולחקור את הפגיעה המכוונת או sequestering מאפייני לאחרונה פיתחה ACs. בנוסף, יכול להיות predosed עכברים עם נוגדן ספציפי שלא שונתה כדי לחסום אתרי הקולטן על תאים סרטניים להעריך ירידה לפרטים מיקוד. למרות זאת, 64Cu עם חיית המחמד הדמיה וניתוח רועי מספיק לספק הערכה ראשונית של הגידול מסירה מאפיינים של ACs מפותחת הוצג פרוטוקול זה.

עד כה, ACs ששינה עם פפטידים נגזר וירוס היו מוגבלים לפתחו של פתולוגיה-ראגנטים. זה נובע בחלקו סיבות היסטוריות, וגם כי הן לכמת בקלות במהלך חוץ גופית בתוך ויוו ובדיקה של רדיואיזוטופים, ניתן לאבחן באמצעות שיטות הדמיה לא פולשנית של כלל הגוף. באופן טבעי, שדה זה מתרחב כדי העברה ושילוח דים חוץ רדיואיזוטופים, כגון chemotherapeutics, אנזימים oligonucleotides, שינויים בטכניקות המתוארות פרוטוקול זה יהיה חייב להיות מפותח. לדוגמה, הרומן שיטות להערכת הצטברות תאיים של מטענים חלופיים יצטרך להיות מפותח. בנוסף, שינויים להערכה ויוו יהיה הכרחי מטענים אלה לא לדימות בקלות, ולכן יהיה קשה להעריך את יעילות ספיגת biodistribution, ירידה לפרטים, גידול דבורים. מסיבות אלו, מטענים רדיונוקלידים צריכים להישאר בתור פונדקאית מטענים לפיתוח עתידי עם מטענים חלופיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי אגודת המחקר לסרטן (קנדה), את CIMS. המחברים תודה ד ר סמיה Ait-Mohand Beaudoin. ז'אן-פרונסואה לקבלת סיוע. ד ר אנג'ל לופז (אוניברסיטת דרום אוסטרליה) עבור mAb A14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sulfo-SMCC Thermo Scientific 22122 There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters EMD Millipore UFC505096 There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards BioRad 1610375EDU Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200056 100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate Thermo Scientific A-21235 1 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHS CheMatech C100
Lamin A/C antibody (N-18) Santa Cruz Biotechnology sc-6215
Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376362
A14 mAb BD Biosciences 555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermo Scientific NP0007
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-25ML
TF-1a cells ATCC ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium ATCC ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer Thermo Scientific 89900
AMIDE medical imaging software available at amide.sourceforge.net Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope Olympus
Fluoview Software Olympus www.olympus-lifescience.com
ITLC strips Biodex 150-771

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
  2. Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
  3. Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
  4. Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
  5. Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
  6. Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
  7. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  8. Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
  9. Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
  10. Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
  11. Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
  12. Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
  13. Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
  14. Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
  15. Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
  16. Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
  17. Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
  18. Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
  19. Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
  20. Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
  21. Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
  22. Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
  23. Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
  24. Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
  25. Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
  26. Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
  27. Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
  28. Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
  29. Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
  30. Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
  31. Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
  32. Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
  33. Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
  34. Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
  35. Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
  36. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
  37. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
  38. Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
  39. Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
  40. King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
  41. Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
  42. Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
  43. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  44. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
  45. Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
  46. Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
  47. Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
  48. Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
  49. Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
  50. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 133 ויראלי נגזר פפטידים נוגדן-conjugates עמודים מרחביות מיקרוסקופיה קונפוקלית fractionation הסלולר נחושת-64 חיית המחמד הדמיה
ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaudoin, S., Paquette, M.,… More

Beaudoin, S., Paquette, M., Fafard-Couture, L., Tremblay, M. A., Lecomte, R., Guérin, B., Leyton, J. V. Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting. J. Vis. Exp. (133), e55440, doi:10.3791/55440 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter