Summary
Viral afkomstige peptiden gekoppeld aan antilichaam-geconjugeerde (ACs) is een aanpak die wint dynamiek als gevolg van het potentieel van het leveren van moleculaire payloads met verhoogde tumor cel accumulatie. Gebruik makend van gemeenschappelijke methoden voor evaluatie van peptide conjugatie, AC en lading intracellulaire accumulatie en tumor gericht op, helpt dit protocol onderzoekers tijdens de cruciale eerste ontwikkelingsfasen.
Abstract
Antilichaam-geconjugeerde (ACs) bewerkt met virus afkomstige peptiden zijn een potentieel krachtig klasse van tumor cel levering agenten voor moleculaire laadvermogens gebruikt in de behandeling van kanker en imaging als gevolg van verhoogde cellulaire accumulatie over huidige ACs. Tijdens de vroege AC in vitro zijn ontwikkeling, fluorescentie technieken en radioimmunoanalyses voldoende voor het bepalen van de intracellulaire lokalisatie, accumulatie efficiëntie en target cel specificiteit. Op dit moment is er geen consensus over gestandaardiseerde methoden voor het voorbereiden van cellen voor de evaluatie van AC intracellulaire accumulatie en lokalisatie. De eerste testen van ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden is essentieel vooral als er meerdere kandidaten zijn aangelegd. Bepalen van intracellulaire accumulatie door fluorescentie kan worden beïnvloed door het signaal van de achtergrond van de ACs aan het celoppervlak en bemoeilijken de interpretatie van accumulatie. Voor radioimmunoanalyses, meestal behandelde cellen zijn gespreide en de radioactiviteit in verschillende cel compartimenten gemeten. Echter lysis van de cel varieert van cel naar cel en vaak nucleaire en cytoplasmatische compartimenten zijn niet afdoende geïsoleerd. Deze kan misleidende gegevens over de eigenschappen van de levering van de lading produceren. De intraveneuze injectie van radiolabeled virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs in tumor rekening houdend met muizen gevolgd door radionuclide imaging is een krachtige methode voor het bepalen van de tumor gericht en lading levering eigenschappen in de in-vivo -fase van ontwikkeling. Echter dit is een relatief recente vooruitgang en enkele groepen virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs op deze manier hebben geëvalueerd. We beschrijven de verwerking van behandelde cellen om nauwkeuriger virus afkomstige peptide gemodificeerde AC accumulatie bij het gebruik van de confocal microscopie en radioimmunoanalyses. Specifiek, een methode voor trypsinizing cellen verwijderen celoppervlak gebonden ACs. We bieden ook een methode voor het verbeteren van de cellulaire fractionering. Ten slotte, dit protocol voorziet een in vivo -methode met behulp van positron emissie tomografie (PET) evaluatie van de eerste tumor gericht op onroerend goed in tumor-dragende muizen. We gebruiken de isotoop 64Cu (t-1/2 = 12,7 h) als de payload van een voorbeeld in dit protocol.
Introduction
Antilichaam-geconjugeerde (ACs) zijn biofarmaceutica die zijn rijpen in een transformatieve klasse effectieve geneesmiddelen voor de verbetering van behandelingen van kanker en voor het opsporen van tumoren. Samengesteld uit een monoklonaal antilichaam (mAb) geconjugeerd met moleculaire payloads zoals radio-isotopen, kleine moleculen en biologische toxines, ACs kunnen leveren deze codering van de payloads tot kankercellen met uitgelezen doelwit antigeen affiniteit en specificiteit. Dus ACs hebben het potentieel om aanzienlijk verminderen van niet-specifieke toxiciteit en lading activiteit op de site van de tumor te verhogen. Therapeutisch, zijn ACs vervoer van cytotoxische kleine moleculen (meestal genoemd antilichaam-drug conjugaten) goedgekeurd voor de behandeling van patiënten met borstkanker en Hodgkin lymfoom die hebben gefaald conventionele behandelingen 1, 2. Daarnaast ACs vervoeren radioactieve isotopen (kortweg radioimmunoconjugaten) zijn ook in ontwikkeling. Een AC vervoeren een isotoop voor imaging is goedgekeurd voor het identificeren van prostaatkanker uitzaaiing 3. Met veel meer therapeutische ACs ingediend voor goedkeuring 4, is optimisme voor de toekomst van de ACs om kanker zorg 5hoog.
Echter bij het afleveren van chemotherapeutica of radio-isotopen, ACs ondervindt bij het effectief accumuleren deze codering van de payloads binnen doelcellen. Dit aspect aanzienlijk bijdraagt in veel gevallen in het onvermogen van de ACs om langdurige ziektevrije overleving of hoog contrast tumor imaging 6,7. In het algemeen, zodra ACs binden hun doel-antigeen zijn ze geïnternaliseerd via een proces dat bekend staat als receptor-gemedieerde endocytose. De ACs zijn vervolgens binnen de Endosomen in de val gelokt en verhandeld aan lysosomen voor afbraak en payload vrijgeven 8. Het intracellulaire mensenhandel proces vormt uitdagingen voor ACs aan het bereiken van een hoog laadvermogen specificiteit en werkzaamheid tegen kanker van de doelcellen. Bijvoorbeeld, veel antigenen zoals Her2 (doel voor therapeutische AC Trastuzumab-emtansine) tot 85% van de gebonden antilichamen in de eerste 30 min 9kunt recyclen. Bovendien, zodra aantasting optreedt, vrijgegeven chemotherapeutica en radio-isotopen kunnen worden actief geëxporteerd door de verhoogde expressie en/of activiteit van membraan geassocieerde vervoer eiwitten 10,11. Lysosoom afbraak belemmert ook de levering van nieuwe biologische payloads zoals therapeutische enzymen en oligonucleotides die kunnen worden gedeactiveerd, 12,,13. Kortom, is de kankercel zeer effectief bij intrekking van de nodige intracellulaire accumulatie van nettoladingen geleverd door ACs.
Dit protocol beschrijft hoe de uitvoering van het concept van het ACs-gekoppeld aan virus afkomstige peptides, speciaal voor endosome entrapment ontsnappen en lokaliseren naar de celkern. Met dergelijke verfijning te manipuleren cel hostsystemen, is het niet verwonderlijk dat de ontwikkeling van het virus afkomstige eiwitten en peptiden als potentiële biofarmaceutica lang heeft zijn ingebakken in therapeutisch onderzoek 14. Voor miljoenen jaren zijn virussen geëvolueerd om te verwerven van een uitzonderlijke collectie van eiwitten kunnen profiteren van normale fysiologische zoogdieren cel systemen om effectief gastheer cellen. Voor virussen die zijn geïnternaliseerd via receptor gemedieerde endocytose, zijn ze ook uitgedaagd met ontsnappen aan het lysosoom handel waar de aanval van een gelokaliseerde concentratie van proteasen kan problematisch zijn voor overleving. Een goed gekarakteriseerd virale afkomstige peptide gebruikt in drug levering voor het ontsnappen van endosome entrapment is het humaan immunodeficiëntie virus transactivator van transcriptie (Tat) eiwit 15. Tat vermag endosome entrapment ontsnappen door het aftasten van lage-pH op welk punt eiwit conformationele wijzigingen optreden waardoor Tat als u wilt invoegen zich in en verstoren de membraan endosomal 16. Dit resulteert in Tat-nettolading geconjugeerde kundig voor vlaag van het cytoplasma. Het tweede element van de virale manipulatie gerelateerde bij dit protocol is de aanpak gebruikt voor therapeutische genen en drugs naar de kern 17. Virussen zijn geëvolueerd om te manipuleren met succes host cel machines voor vordert langs het kernmembraan door door de nucleaire porie complexe (NPC). Cellulaire macromoleculen bevatten (of binding aan eiwitten die bevatten) nucleaire localisatie signalen (NLSs) nodig voor bindende tot nucleaire transport eiwitten (bv karyopherins α en β), waarmee de vereiste bewegingen door de NPC. Virussen hebben eiwitten bevatten NLS-sequenties die hen voorzien van de mogelijkheid om gebruik te maken van host cel vervoer eiwitten voor pendelen in de nucleus 18ontwikkeld.
Talrijke ACs eerder matiemaatschappij met Tat - en NLS-afgeleide peptiden en getest voor hun vermogen om te accumuleren binnen kankercellen en voor het targeten van tumoren 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabel 1). Studies leveren van cytotoxische payloads hebben aangetoond dat ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden kunnen aanzienlijk verhoging van cellulaire accumulatie, cytotoxiciteit en tumor doden over ongewijzigde ACs 22,26. Een gemeenschappelijk kenmerk voor deze nieuwe klasse van het Keuzeaxioma is hun bouw. Doorgaans bevatten peptiden een terminal cysteïne bieden een gratis sulfaatzuurstof groep. MAbs zijn eerste reageerde met een noncleavable bifunctionele crosslinker met N- hydroxysuccinimide (NHS) en maleimide groepen op tegenovergestelde uiteinden. De NHS esters reageren met primaire amines op de mAb aan amide-bindingen. De gereageerde mAb met gratis maleimide groepen is het vervolgens reageerde met de sulfaatzuurstof groepen op de peptiden te vormen van een thio-ester-binding en dus het koppelen van de peptide en mAb. Hoewel homobifunctional crosslinkers geweest gebruikte 28, heterobifunctional crosslinker meer in het algemeen worden gebruikt in de bouw van virus-afgeleide peptide-ACs 22,23,26, 31,-32. Dit protocol gebruikt met name de crosslinker-sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC) voor zijn gebruiksgemak en omdat het wordt gebruikt in de goedgekeurde antilichaam-drug geconjugeerde Trastuzumab-emtansine en in veel virus-afgeleide peptide-ACs 8,22,23,26,31,32. Polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-pagina) voor natrium dodecyl sulfaat is de primaire methode voor het aanvankelijk bepaling vervoeging rendement en semi-quantifying hetaantal peptiden per mAb. Confocale microscopie met behulp van een fluorescently-gelabeld secundair antilichaam specifiek voor de mAb is meestal de methode voor het aanvankelijk uitrekenen intracellulaire distributie eigenschappen van peptide gemodificeerde ACs virus-afgeleide. Tot nu toe zijn de radio-isotopen de primaire payloads geleverd door virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs. Radio-isotopen zijn voordelig omdat radioactiviteit in cellen wordt gemakkelijk gekwantificeerd door gamma tellen. Daarnaast ACs die zijn vertaald in muismodellen van menselijke kanker onderzoekers voorzien de mogelijkheid om de tumor gericht op met behulp van moleculaire beeldvorming modaliteiten zoals single photon emission berekende tomografie en positron emissie tomografie (PET) 23 , 32 , 33. In het algemeen, de constructie en validatie testmethoden voornamelijk gebruikt door onderzoekers bieden een zeer goede beoordeling van ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden tijdens het aanvankelijke ontwikkelingsstadium effectief invoeren en leveren de lading binnen doelcellen en voor doel tumoren.
Tat - en NLS-gemodificeerde ACs hebben verlichte sleutelgebieden voor verdere verbetering van de nettolading levering binnen cellen van kanker en tumoren. Met betrekking tot de NLS gemodificeerde ACs kunnen de efficiëntie van intracellulaire accumulatie bescheiden 23,31,34. Inefficiënte intracellulaire accumulatie wordt veroorzaakt door voortdurende endosomal entrapment. In vivo tumor targeting kan ook worden verminderd met beide Tat en NLS-gemodificeerde ACs. De actieve sequenties van Tat en NLS bevatten verschillende positief geladen residuen. Wanneer gekoppeld aan mAbs, kunnen de algemene kationische last aanzienlijk verhoogde 35. Dientengevolge hebben de Tat - en NLS-gemodificeerde ACs verhoogd van opname in de gezonde weefsels en snelle bloed klaring verhoogd.
Onze fractie ontwikkeld een samengestelde stof bestaande uit cholzuur en gekoppeld aan NLS (ChAcNLS; Figuur 1). ChAcNLS gemodificeerde ACs kunnen verhogen van intracellulaire accumulatie van radio-isotopen geleverde en tumor gericht op t.o.v. NLS gemodificeerde en traditionele ACs 33,34te verbeteren. Het mechanisme is erachter cholzuur en is geïnspireerd door de mogelijkheid van select nonenveloped virussen die niet op membraan fusion vertrouwen gebruiken cholzuur en om te activeren endosome ontsnappen door de vorming van ceramide. Varkens darmen virus werft bijvoorbeeld cholzuur en dat activeert sphingomyelinase, die de hydrolyse van sphingomyelinase in ceramide 36,37,38katalyseert. Dit endosomal membraan destabiliseert en zorgt voor virus ontsnappen. Cholzuur en is dus een ander virus afkomstige onderdeel dat perfect past bij NLS.
Als dit veld beweegt naar voren en toekomstige optreden vooruitgang in lading levering per ACs bewerkt met virus afkomstige peptides, is het een geschikt moment om visuele demonstraties van hun biochemische en functionele kenmerken tijdens de initiële ontwikkeling. Hier beschrijven we onze protocol voor de initiële beoordeling van virus-afgeleide peptide gemodificeerde ACs voor de efficiënte maar eenvoudige bepaling van intracellulaire accumulatie en tumor gericht op tijdens de vroege fase ontwikkeling. Als modelsystemen voorbeeld gebruiken we de verkrijgbare mAbs 7G 3 en de A14. Procedure 1 beschrijft het gebruik van SDS-pagina als een methode die het mogelijk voor besluiten van de ' go/no go' voor gebouwd ACs maakt. Procedure 2 beschrijft een methode met behulp van trypsinebehandeling waardoor verbeterde visualisatie van AC intracellulaire verspreiding en accumulatie. Procedure 3 beschrijft een methode voor verbeterde intracellulaire fractionering nauwkeurig bepalen nucleaire localisatie. In deze procedure we gebruik maken van de nettolading 64Cu (t-1/2 = 12,7 h) want het is kwetsbaar voor cellulaire efflux en een positron emitter 10is. Dus, de Procedure 4 beschrijft in vivo tumor gericht op karakterisering door PET imaging te visualiseren van opname van de tumor ten opzichte van de achtergrond (dat wil zeggen nontarget gezonde weefsels) en te bepalen of het voorbeeld AC kan specifiek en effectief doel de tumoren. Deze methoden zijn voldoende voor onderzoekers ontwikkelen ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden te identificeren van kandidaten voor verdere vooruitgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De in vivo dierproeven beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurde protocol en onder de ethische richtsnoeren van de ethische commissie van Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke voor dier experimenten.
1. antilichaam Peptide Woordherkomst en-opbouw
Opmerking: ChAcNLS kan gesynthetiseerd worden bij elke commerciële peptide fabrikant of universiteit-aangesloten peptide synthese serviceplatform. De synthese van ChAcNLS kan worden gevonden in verwijzing 34. Procedures 1 en 2 gebruikt u de mAb 7G 3, specifiek voor de leukemie-antigeen IL-3Rα- 39.
- In een tube van 1,7 mL microcentrifuge, bereid een 10 mg/mL (~ 1 mg totale antilichaam) oplossing voor 7G 3 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,6.
- Ontbinden sulfo-SMCC in dimethylsulfoxide (DMSO) met een concentratie van 5-10 mM. Vortexing de oplossing zeer grondig geschikt met het oog op een volledige ontbinding.
- Voeg toe aan de buis met 7G 3 de opgeloste sulfo-SMCC-oplossing (doorgaans tussen 5-20 μL afhankelijk van de molaire verhouding van sulfo-SMCC-tot - 7G 3 gewenst). Testen van sulfo-SMCC-tot - 7G 3 ratio's van 10 - 25- en 50-tegen-1 wordt aanbevolen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
-
Zuiveren en het concentreren van de 3 7G maleimide-derivatized met behulp van een ultrafiltratie apparaat en buffer uitwisseling in PBS, pH 7.0. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende ongeveer 5 min. Discard stroom door en vul met PBS pH 7,0 en centrifuge opnieuw.
- Uitvoeren van dit 7 - 8 keer te wisselen volledig de buffer. Recover de geconcentreerde 7G 3 eiwit door het plaatsen van het apparaat filter ondersteboven in een schone microcentrifuge buis. Centrifugeer gedurende 2 min op 1000 x g. herstel volume moet ongeveer 0.3 mL
- Voeg 2-fold molaire overmaat van ChAcNLS ten opzichte van de sulfo-SMCC-tot - 7G 3-verhouding gebruikt in de vorige stap in de buis met de maleimide-geactiveerde 7G 3, en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Bijvoorbeeld, als een 10-tegen-1 sulfo-SMCC-tot - 7G 3-verhouding werd gebruikt, gebruikt u een 20-tegen-1 ChAcNLS-tot - 7G 3-verhouding. Totale volume mag niet aanzienlijk worden gewijzigd.
Opmerking: Hoewel ChAcNLS geen neerslag tijdens het Gelijkklinkende woorden veroorzaakt dit is een mogelijkheid die met andere peptiden optreden kan. Observeer de buis tijdens de reactie op tekenen van neerslag, die waarschijnlijk wordt veroorzaakt wanneer peptiden hydrofobe zijn. In deze gevallen wellicht moeite waard zijn herzien van de peptide van belang om ontwerpwijzigingen om verhoogde hydrophilicity. - Het concentreren van de 7G 3-ChAcNLS met behulp van een apparaat van de ultrafiltratie aan gewenste concentratie en buffer uitwisseling in PBS pH 7.4 (zie stap 1.4). De opbrengst van de terugwinning van totaal eiwit moet ≥ 75% van de oorspronkelijke grondstof.
- SDS-pagina om te evalueren van de geconstrueerde 7G 3-ChAcNLS kandidaten met behulp van een 12% polyacrylamide-gel (biedt voldoende scheiding van de ChAcNLS geconjugeerd zware en lichte kettingen van nonconjugated ketens) uitvoeren. Mix 10 μg 7G 3-ChAcNLS in PAGINALADING buffer met 2 μL β-mercaptoethanol en laadt in goed.
- Instellen van de juiste spanning (120 V voor 1 h voor een 12% gel) en voer de elektroforese. Stop de elektroforese wanneer de voorkant van de kleurstof Coomassie de onderkant van de gel bereikt.
Opmerking: Laat niet de Coomassie kleurstof voorkant weggelopen van de gel. - Verwijderen van gel uit elektroforese apparaat en spoel met destaining oplossing met 10% (v/v) van ijsazijn en 20% v/v methanol.
- Maak een foto van de gel en met een liniaal en meet de afstand (cm) gemigreerd voor de normen en 7G 3 geconjugeerde. Berekenen van de waarde van de retentie factor (Rf), waarin de afstand wordt gemigreerd verdeeld door de lengte van de gel (vanaf waar eiwit wordt geladen naar de voorkant van de migratie Coomassie). Uitzetten van het molecuulgewicht (MW) in logboek tegen de Rf-waarden van elke standaard proteïne en de grootte van de 7G 3 te extrapoleren conjugaten.
- Bereken het aantal peptiden per antilichaam door het verdelen van het verschil in MW tussen 7G 3 vervoegt en 7G 3 ongewijzigd door 1768.5 g/mol (MW van ChAcNLS).
- Nemen van digitale beelden van de gel Coomassie gebeitste en densitometrie analyses uit te voeren. Op dit punt, kan selectie van een kandidaat van het lood worden gebaseerd op de AC met het maximum aantal ChAcNLS moleculen die geen significante statistische soorten bevat.
2. confocale microscopie voor intracellulaire accumulatie evaluatie
Opmerking: Het is belangrijk om te testen de selectiviteit van de cel van intracellulaire accumulatie van de peptide gemodificeerde mAbs voorafgaand aan de ontwikkeling van formuleringen met een lading van belang. Omdat Tat is ook aangetoond dat een neiging voor het niet-specifieke cel penetratie, loont eerste analyseren intracellulaire accumulatie en cel selectiviteit vóór onderneming dure ontwikkeling stappen met dure laadvermogens. Om deze reden moet Procedure 1 isotype specifieke irrelevant controle mAbs ook wijzigen. Voor de rest van het protocol zullen wij werken met ACs bewerkt met 10 ChAcNLS moleculen per antilichaam. Een schema met inbegrip van de belangrijkste stappen voor Procedures 2 en 3 is beschreven in Figuur 2.
Let op: Deze stap van het protocol omvat de behandeling en de manipulatie van paraformaldehyde. Volg de instructies van de fabrikant in bij de behandeling.
- Doelcellen TF-1a met 200 nM van 7G 3-ChAcNLS met inbegrip van aangepast besturingselement mAbs te behandelen. Incubeer 5 x 106 antigeen-positieve cellen met de geconjugeerde gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Na 1 uur bovendrijvende vloeistof verwijderen en wassen met 1 mL 3 x in ijskoude PBS. Voeg nieuwe media toe en incubeer gedurende een uur bij 37 ° C.
-
Na de extra uur, bovendrijvende vloeistof verwijderen en spoelen 3 x in 1 mL ijskoud PBS. Voeg 0,5 mL PBS met 0,25% trypsine en ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) bij 37 ° C gedurende 3 tot 30 min.
Opmerking: Tijdens de eerste piloot testen is het aanbevolen om niet trypsinize cellen om te bepalen van de verschillen in AC intracellulaire accumulatie. Dit protocol bevordert het gebruik van trypsine en we laten zien hoe dit verbetert de beoordeling van de efficiëntie van de intracellulaire accumulatie van verschillende AC kandidaten.- Test de verschillende tijdstippen voor incubatie door visuele controle voor alle cellen worden losgemaakt. Daarnaast broeden cel aliquots met levensvatbaarheid kleuringsvloeistoffen en stroom cytometrische analyses als eerder beschreven 40uit te voeren.
- Neutraliseer trypsine met 1,5 mL van de cultuur van de cel RPMI 1640 media/10% foetale runderserum. Centrifugeer cellen bij 500 x g gedurende 5 min, bovendrijvende vloeistof verwijderen en 3 x wassen in 0,5 mL ijskoud PBS.
- Fix cellen in 0,5 mL PBS, met 1% paraformaldehyde en 1% sucrose op ijs voor 30 min. Wash cellen 3 x in 0,5 mL ijskoud PBS en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min. Permeabilize cellen in 0,5 mL PBS met 0,15% Triton X-100 voor 5 min op ijs. Cellen in ijskoude PBS wassen en centrifugeren herhalen.
-
Schorten cellen in 0,1 mL PBS met 2 μg/mL (of de fabrikant aanbevolen concentratie) van een anti-RattenUitrustingen (isotype specifieke) Fc secundaire polyclonal antilichaam geconjugeerd met AlexaFluor 647 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min en wassen cellen 3 x in 0,5 mL ijskoud PBS. Schorten cellen in 0,5 mL PBS.
PAUZE: Cellen kunnen worden opgeslagen in de koelkast.
Opmerking: Het is essentieel om te selecteren van een secundair antilichaam dat de juiste isotype van de mAb van belang herkent. AF647 is gekozen vanwege haar ver-infrarood emissie, die niet interfereert met propidium jodide (PI) kleuring van de kern.
- Centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min en wassen cellen 3 x in 0,5 mL ijskoud PBS. Schorten cellen in 0,5 mL PBS.
- PI tot een concentratie van 10 μg/mL tot de container met cellen toevoegen. Vervolgens monteer 1 x 105 cellen in glazen dia's met behulp van montage media en cover met een dekglaasje glas aan.
- Cellen met een Plan Apo 60 X olie onderdompeling doelstelling NA 1.42 op een omgekeerde laser scannen confocal microscoop onderzoeken. Detecteren PI fluorescentie met behulp van de 488 nm argon laser en de spectrale scannen prisma instellen voor 600-650 nm. Gebruik de 633 nm helium neon laser en de spectrale scannen prisma instellen voor 650-700 nm voor AF647 fluorescentie. Fluorescentie emissies opeenvolgend van PI en AF647 verzamelen.
Opmerking: Gebruik dezelfde instelling gedurende de evaluatie en vergelijking van de cellen. Echter zul je instellingen voor trypsinized cellen ten opzichte van niet-trypsinized cellen aan te passen. - Microscoop software gebruiken voor het verwerven van beelden. Het verzamelen van beelden met behulp van seriële horizontale optische secties van 1024 x 1024 pixels met 2 X lijn gemiddeld 0,5 μm regelmatig door de dikte van de gehele cel genomen. Presenteren de beelden als gestapelde z-projecties van vier opeenvolgende segmenten op de maximale fluorescentie-intensiteit.
- Cellen met Microscoop software analyseren. Het patroon van de cellulaire distributie van de geconjugeerde opnemen. Specifiek, evalueren of intracellulaire fluorescentie in het cytoplasma wordt gegroepeerd en in de buurt van de cel oppervlakte of diffuus en homogeen. Ook het evalueren van de intensiteit van de relatieve fluorescentie per cel.
3. radiolabeled AC bouw en cellulaire fractionering voor de evaluatie van 64 Cu intracellulair levering efficiëntie
Let op: Procedures 3 en 4 betrekken de behandeling en de manipulatie van radioactiviteit. Voordat u deze stappen uitvoert, moeten de onderzoekers hebben goedgekeurd veiligheidstraining en protocollen uit hun eigen instelling straling veiligheidsinstantie erkend.
Opmerking: Voor Procedures 3 en 4 gebruiken we de mAb A14, die is specifiek voor de invasieve blaas kanker antigeen IL-5Rα41. Ook zijn alle experimenten tijdgevoelig te wijten aan de korte halfwaardetijd van 64Cu. In het algemeen, is het best niet wachten afgelopen 1 week in vitro experimenten uitvoeren en niet langer dan 72 h voor in vivo studies.
- Schorten in een tube van 1,7 mL 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic zuur (NOTA-NHS) in DMSO tot een concentratie van 10 mM.
- Reageren 50-fold molaire overmaat van NOTA-NHS met A14 (2 mg grondstof) in 0,1 M natriumbicarbonaat bij pH 8.6 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een volume ≤ 0,5 mL (het eindvolume van NOTA-NHS mag niet meer dan 2% (v/v) van het totale volume).
- Zuiveren en buffer-uitwisseling NOTA-A14 met behulp van een apparaat van ultrafiltratie in PBS, pH 7,6 (zie stap 1.4).
- Voor latere bevestiging van ChAcNLS, stappen 1.2-1.6.
- NOTA-A14-ChAcNLS (250 μg batches) reageren met 100 megabecquerel (MBq) 64CuCl2 in 0,1 M natriumbicarbonaat, pH 5.5 gedurende 1 uur bij 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu wordt geproduceerd op het cyclotron TR-PET bij de CIMS 42.
- Concentreren 64Cu-A14-ChAcNLS in PBS pH 7.4 met behulp van een apparaat van de ultrafiltratie tot de gewenste concentratie (zie stap 1.4).
-
Bepaal de radiolabeling efficiëntie van 64Cu-A14-ChAcNLS door onmiddellijke dunne-laag chromatografie (ITLC) met behulp van chromatografie strips en 0,1 M, pH 5.5 Natriumcitraat (ITLC eluens) als oplosmiddel. Toepassing 0,5 μL aliquoot deel van de oplossing van de reactie op de ITLC-strip. Het uitvoeren van een autoradiograph van de strip en het verkrijgen van een digitaal beeld.
- Densitometrie voor het verkrijgen van het aandeel van de gebonden en vrij van 64Cu uitvoeren Als gratis 64Cu inhoud > 5% is, terug te keren naar de vorige stap en extra reiniging uitvoeren.
- Daarnaast voeren SDS-pagina met Coomassie kleuring om aggregaties te evalueren. Een tweede SDS-pagina gevolgd door een autoradiograph van de gel om te bepalen als er radiolabeled statistische soorten uitvoeren
-
Affiniteit bindend kwaliteit controlepost: Incubeer 64Cu-A14 geconjugeerde op toenemende concentraties (0-100 nM) in tweevoud met 1 x 106 target cellen per mL. Als u wilt schatten niet-specifieke binding, meng u dubbele monsters van 64Cu-A14 geconjugeerde met cellen in aanwezigheid van 100-fold molaire overmaat van labelloze A14.
- Na een incubatieperiode van 1 h op ijs, wassen van cellen en tellen van totale afhankelijke antilichaam monsters en totale niet-specifieke afhankelijke antilichaam monsters in een gamma-teller. Grafiek specifieke bindende (totale afhankelijke antilichaam - niet-specifieke gebonden antilichaam) tegen reactieve gratis 64Cu-A14 (nM) gebruikt in de test. Bepaal de dissociatieconstante (Kd) door middel van niet-lineaire regressie met behulp van grafische software.
- Voor 64Cu cellulaire accumulatie studies: behandelen van cellen met 100 nM van de 64Cu-geëtiketteerden A14 conjugaten voor 1 h, 6 h, en 24 uur bij 37 ° C33zoals hiervoor is beschreven. Aanvullende parameters zoals behandeling in aanwezigheid van ongewijzigde A14 voor takel IL-5Rα terreinen en bij 4 ° C voor het blokkeren van receptor-gemedieerde internalisering bevatten.
- Gedefinieerde destijds punten, als eerder beschreven in stap 2.3 - 2.3.2, Voeg 0,5 mL PBS met 0,25% trypsine en EDTA bij 37 ° C gevolgd door neutralisatie en wassen.
- Incubeer de cellen in het plasmamembraan lysis-buffermengsel met 1% NP-40, 10 mM Tris pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 buffer op ijs voor 10 min. Centrifugeer het plasmamembraan-lysed cellen bij 90 x g gedurende 5 min.
- Bovendrijvende vloeistof verwijderen en plaatsen in verse buis. Dit vertegenwoordigt de cytoplasmatische breuk. Wassen kernen 3 x in ijskoude PBS en wast op de cytoplasmatische breuk toe te voegen.
- Zorgen voor flesjes met de nucleaire en cytoplasmatische breuken zijn verzegeld. Plaats ze dan in een gamma counter gekalibreerd voor 64Cu om te converteren van raw graven naar MBq.
-
Bepalen de kwaliteit van de isolatie van de kernen door het uitvoeren van westelijke vlekkenanalyse voor triplex netvoeding, een beperkte nucleaire eiwit en Rab7, een overvloedige cytoplasmatische eiwit op de gehele cel lysate, nucleaire en cytoplasmatische breuken.
- Traktatie 5 x 106 cellen met 500 μL van radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer en het plasma membraan lysis-buffermengsel in stap 3,12 met 1%, 2% en 4% NP-40. Bovendien behandelen de geïsoleerde kernen in 500 μL van RIPA buffer te verkrijgen van geïsoleerde nucleaire eiwitten.
- Neerslag van eiwitten van de geïsoleerde nucleaire, cytoplasmatische en hele cel met behulp van 4 x Het monstervolume koude aceton voor 60 min bij-20 ° C. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 10 minuten en decanteren supernatant voorzichtig niet te verjagen van de eiwit-pellet. Voeg 100 μl van PBS te ontbinden van eiwitten.
- 10 μg van eiwit in ieder putje van een 10% SDS-pagina gel laden. Voert elektroforese zoals beschreven in 1.7-1.9. Overdraagt Western Blot zoals eerder is beschreven in refeference 43.
- Het identificeren van de markeringen die het beste overeenkomen met een MW van ~ 40 kDa ladder. Snij het membraan doormidden op deze markering. Sonde van de vlek met de hogere MW eiwitten met Lamin A/C-specifieke antilichamen. Sonde van het membraan met de lagere MW eiwitten met de Rab 7-specifieke antilichamen. Westelijke vlek is een bekende techniek en niet beschreven in dit protocol.
4. PET Imaging evaluatie van de Tumor gericht op
Opmerking: De technieken van het implanteren van tumorcellen in muizen voor het genereren van heterotopic xenografts zijn bekend en de meeste laboratoria hebben in-house protocollen op maat gemaakt voor hun systeem van de tumor. Dit valt dus niet in het protocol. Het xenograft-model zullen nonobese diabetes/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (knik/SCID) muizen die IL-5Rα-positieve invasieve blaas tumoren HT-1376 en HT-B9. De cellen van de tumor van de IL-5Rα-positieve invasieve blaas omvatten > 66% van het totaal aantal cellen in de xenograft. Daarentegen waren slechts ~ 11% van de IL-5Rα-positieve HT-B9 cellen opgenomen in ontwikkelde xenografts41. Dus biedt dit model een uitstekend voorbeeld voor het evalueren van AC tumor gericht op in twee tumoren die te verwachten patiënt tumor heterogeniteit vertegenwoordigen.
- In groepen met ≥ injecteert 4 (knik/SCID) muizen, 20-30 μg (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS en 64Cu-A14 in de ader van de staart.
- Plaats op dezelfde dag een cilindrische phantom (24.8 mL) met 5 MBq van 64Cu omzetten van de radioactieve graven per seconde in de ingespoten dosis per gram weefsel (%ID/g).
- Wacht 48 uur en vervolgens anesthetize muizen door ze te plaatsen in een inductie-zaal met 1,5 L/min voor zuurstof stroom met 2% Isofluraan. Toepassing steriele ophthalmic zalf op muis ogen na inductie en voor plaatsing in de PET-scanner.
- Snel de muis naar een PET-scanner-tabel in de headfirst vatbaar positie met een neus voor Isofluraan overbrengen. Plaats de ademhaling en de rectale sondes en de monitor temperatuur en ademhaling tarief om ervoor te zorgen dat de fysiologische omstandigheden worden gehandhaafd tijdens het experiment zoals eerder beschreven 44.
- Start de PET data-acquisitie met behulp van een regelmatige bemonstering modus instelling en een energie-venster van 250-650 keV. Een 45 minuten durende statische scan per muis is meestal voldoende voor voldoende samenvallende gebeurtenissen voor wederopbouw en productie van PET-afbeeldingen van hoge kwaliteit.
- Na de scan 64Cu-AC, muis uit de scanner te verwijderen en plaats deze terug in de kooi. Toestaan voor de muis voldoende herstellen voordat u terugkeert naar het dier faciliteit.
- Gereconstrueerde beelden met behulp van 20 iteraties van een driedimensionale Maximum waarschijnlijkheid verwachting maximalisatie algoritme te verkrijgen.
-
Regio van belang (ROI) analyse van de tumor en visueel verifieerbare organen gebruik van de AMIDE-software uit te voeren.
- ROIs kwantitatieve %ID/g om gegevens te verkrijgen door handmatig met behulp van de instelling van het 3D Freehand gereedschap tekenen en zorgvuldig af te bakenen de tumoren of de aangrenzende bovenbeen spier. De tellingen per pixel in de ROI zal worden omgezet in %ID/g uit de vorige stap 4.2.
- Vergelijk 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS beelden voor tumor daarentegen en kwantitatieve ROI % ID/g en tumor-naar-achtergrond ratio's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor Procedure 1, de constructie van 7G 3 bewerkt met ChAcNLS gebruik van sulfo-SMCC als een crosslinker zeer betrouwbaar is. Meestal, wanneer geladen op een 12% gel en geanalyseerd door SDS-PAGE, dit resulteert in een te onderscheiden stapsgewijze verhoging MW evenredig met verhoging van sulfo-SMCC-tot - 7G 3 ratio's gebruikt en zorgt voor de zware en lichte kettingen worden individueel beoordeeld voor ChAcNLS vervoeging (Figuur 3). 7G 3 reageerde op 10-, 20 - 25- en 50-tegen-1 sulfo-SMCC-tot - 7G 3 ratio's gevolgd door Rf meting en MW extrapolatie resultaten in de 3, 7, 10 en 20 ChAcNLS moleculen per 7G 3. Door densitometrie is het percentage monomeer soorten > 90% voor 7G 3, gewijzigd met 3-10 ChAcNLS. Voor 7G 3-ChAcNLS20 is de statistische soort 45%. Hieruit blijkt DAT SDS-pagina is eenvoudig maar effectief voor het selecteren van een 7G 3-ChAcNLS conjugaat voor verdere ontwikkeling. Hoewel, lichte smeren met antilichaam ketens kan optreden vanwege antilichaam glycosylatie interfereert dit niet met de identificatie van de statistische soorten.
Voor Procedure 2 toont de representatieve gegevens verschillen tussen trypsine en geen trypsine bij de beoordeling van virus-afgeleide peptide gemodificeerde ACs voor intracellulaire efficiëntie accumulatie. In dit voorbeeld kan het vermogen van 7G 3-ChAcNLS te verhogen van het intracellulaire accumulatie worden geëvalueerd in cellen die zijn behandeld met en zonder trypsine (Figuur 4). Het belang van trypsinebehandeling blijkt echter bij de interpretatie van de accumulatie van geconjugeerde gebruikt voor vergelijking om te bepalen van AC-efficiëntie en selectiviteit. Trypsinebehandeling zorgt voor het basisniveau van de intracellulaire fluorescentie worden vastgesteld zoals waargenomen met ongewijzigde 7G 3. Een detail kan dat 7G 3 beperkt tot het cytoplasma in kleine foci is. In tegenstelling, cellen die niet zijn trypsinized, de 7G 3-specifieke fluorescentie is beperkt tot het celoppervlak als gevolg van de overexpressie van IL-3Rα op het celoppervlak. Dit maakt het moeilijk te onderzoeken van intracellulaire accumulatie en distributie de fluorescentie bij het celoppervlak domineert en dus blokkeert de intracellulaire fluorescentie van wordt gevisualiseerd. Trypsinizing cellen is ook belangrijk bij de beoordeling van specificiteit als bewijs met IgG-ChAcNLS. We kunnen zien dat er enkele niet-specifieke fluorescentie van het celoppervlak is maar niet zou kunnen om te bepalen van het niveau van de intracellulaire accumulatie veroorzaakt door de peptide als de cellen waren niet trypsinized. Tot slot, zonder trypsinebehandeling kan een ten onrechte interpreteren dat een nieuw ontwikkelde AC niet in de doelcellen ophopen doet. Zoals gezien bij 7G 3-NLS, cellen die niet de meerderheid van de fluorescentie trypsinized is weer van het celoppervlak. Na trypsinebehandeling, kan men waarnemen dat 7G 3-NLS ophopen, zij het beperkte, binnen de doelcellen.
Voor 3 van de Procedure toont de representatieve gegevens kwaliteitscontrole voor bouw, affiniteit en in vitro payload levering efficiëntie en specificiteit voor de isotoop 64Cu met A14-ChAcNLS. Densitometrie uitgevoerd op radiografische opnamen van een 12% polyacrylamidegel met 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, of 64Cu-A14-ChAcNLS blijkt dat de radiolabeled geconjugeerde 100% monomeer soorten (figuur 5A). 64 Cu-A14-ChAcNLS toont nanomolar affiniteit voor IL-5Rα. A14-ChAcNLS als een functie van toenemende concentraties van 64Cu-A14-ChAcNLS bleek specifieke bindende benaderd verzadiging in concentraties van 3-5 nM in zowel HT-1376 en HT-B9 cellen (figuur 5B). De Kd voor 64Cu-A14-ChAcNLS op HT-1376 en HT-B9 cellen was 6,4 ± 1,7 nM en 3.1 ± 0.8 nM, respectievelijk. ChAcNLS vervoeging verlaagd de affiniteit van A14 ongeveer 2.5-fold IL-5Rα op HT-1376 en HT-B9 cellen. Gamma tellen blijkt dat de stijging van de radioactiviteit in de kern en het cytoplasma geleverd door 64Cu-A14-ChAcNLS is specifiek en verhoogt na verloop van tijd (Figuur 6). Gamma tellen meestal ongeveer toont > 6-fold stijging van de accumulatie van nucleaire en intracellulair in cellen behandeld met 64Cu-A14-ChAcNLS in vergelijking met de behandeling met 64Cu-A14-ChAcNLS in aanwezigheid van de overmaat ongewijzigde A14 of wanneer behandeling studies uitgevoerd bij 4 ° C (figuur 6A). Er is ook een ≥ 3 katernen toename van nucleaire en intracellulaire accumulatie van 64Cu ten opzichte van cellen die zijn behandeld met 64Cu-A14 en 64Cu-IgG-ChAcNLS op alle tijdstippen getest (figuur 6B).
Afbeelding 7 toont het belang aan van de cel fractionering protocol. HT-1376 en HT-B9 cellen werden geïncubeerd met plasmamembraan lysis-buffermengsel met 1%, 2% of 4% NP-40. Geïsoleerde kernen moeten uitsluitend bevatten Lamin a/c dienovereenkomstig cytoplasmatische breuken moeten worden exclusief voor Rab7. Als een besturingselement moet de hele cellen lysed met RIPA buffer positief voor triplex airco in beide breuken. Dit protocol wordt aangegeven dat bij de beoordeling van de nucleaire Fractie van lysed HT-1376 cellen, er geen Rab7 aanwezig. Daarnaast is er geen triplex airco aanwezig in de cytoplasmatische Fractie. Er is echter een beperkte hoeveelheid van de Rab7 in het cytoplasma ontleend aan cellen lysed met 4% NP-40 (figuur 7A). Dit suggereert waarschijnlijk dat 4%-NP-40 lysis-buffermengsel is het verstoren van het kernmembraan naast het plasma-membraan. Dit resulteert in het mengen van nucleaire eiwitten met cytoplasmatische eiwitten en dus de concentratie van Rab 7 verdunt. Dit verklaart de verminderde hoeveelheid Rab 7 aanwezig. HT-B9 cellen zijn nog gevoeliger dan HT-1376 cellen. Wanneer plasmamembraan lysis-buffermengsel behandeld is met 4% NP-40, triplex airco duidelijk zichtbaar in de cytoplasmatische fractie (figuur 7B). Er is een overeenkomstige verlaging van triplex airco in de nucleaire Fractie. HT-B9 cellen zijn ook gevoelig op 2% NP-40 lysis-buffermengsel, zoals de hoeveelheid Rab7 in de cytoplasmatische fractie is zichtbaar verminderd ten opzichte van 1% NP-40. Zo moet een cellulaire fractionering met de bepaalde cellen van belang optimaliseren zodat kwantitatieve resultaten van lading cumulatie in de kern en de intracellulaire ruimte kloppen. Dit is belangrijk voor de evaluatie van de doeltreffendheid van nucleaire localisatie van een roman AC.
Voor Procedure 4 zorgt PET beeldvorming op 48 h na injectie van 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS of 64Cu-A14-ChAcNLS in muizen HT-1376 en HT-B9 heterotopic xenografts op tegenovergestelde achterpoten die voor de visualisatie van de tumor gericht op Eigenschappen (Figuur 8). Zoals in ons voorbeeld onthult visuele inspectie van de PET beelden de HT-1376 en HT-B9 tumor targeting mogelijkheden van 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14 en 64Cu-A14-NLS (figuur 8A). Echter, in gevallen waar visuele inspectie moeilijk als met de HT-B9 tumoren is, ROI analyse kan worden gebruikt om te bepalen van tumor-aan-spier ratio's (Figuur 8).
Figuur 1: ChAcNLS gemodificeerde mAbs. NLS residuen van SV-40 grote T-antigeen (KKKRKV) zijn ingeklemd tussen spacer residuen afgetopt door een N-terminal cysteïne. Cholzuur en (groene vierkant haakje) is gekoppeld aan cysteïne als eerder beschreven 34. Na bouw en reiniging van ChAcNLS, de cysteïne sulfaatzuurstof groep wordt gebruikt voor conjugatie via sulfo-SMCC (rode beugel; getoond al verbonden met de mAb). Opmerking: mAb (150 kDa) en ChAcNLS (1.8 kDa) zijn niet op schaal. Aangepast en herdrukt met toestemming van Paquette, verbetert M. et al. NLS-cholzuur zure vervoeging aan IL-5Rαspecific antilichaam de cellulaire accumulatie en in vivo tumor-targeting eigenschappen in een blaas kanker model. Bioconjugate chemie. DOI:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
-
Figuur 2: van AC cel behandeling aanpak en verdere verwerking voor analyse door confocale microscopie en voor analyse van de kwaliteit van de fractionering cel schematisch. Rode pijlen overeen met essentiële stappen 2.2, 2.3, 3.15 en 3.15.4. Aangepast en herdrukt met toestemming van Beaudoin, S. et al. ChAcNLS roman aangebrachte antilichaam-geconjugeerde toelaat Target cel-specifieke Endosomal ontsnappen, een localisatie op de Nucleus en verbeterde totale intracellulaire accumulatie. Moleculaire Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Figuur 3: analyse van ChAcNLS gemodificeerde mAbs. Een reducerend SDS-pagina de lopende ladder (L) met bijbehorende molecuulgewichten in tonen kilodalton (kDa) en ongewijzigde 7G 3 zware en lichte ketens als verwijzingen. De volgende rijstroken zijn de banden van de migratie van de zware en lichte ketens van 7G 3, gewijzigd met 3, 7, 10 en 20 ChAcNLS.
Figuur 4: analyse van mAb intracellulaire verspreiding en accumulatie. Confocale microscopie beelden ter illustratie van de intracellulaire 7G 3 verspreiding en accumulatie van de relatieve fluorescentie in IL-3Rα-positieve leukemie cellen behandeld met 7G 3, 7 G 3-ChAcNLS, IgG en IgG-ChAcNLS. Cellen werden trypsinized of niet trypsinized voorafgaand aan de fixatie. Kernen zijn gekleurd met propidium jodide (PI; rood), anti-murine-Fc-AF647 kleurstof (mAb; groen), en PI/mAb samengevoegd. Schaal is 50 μm. Binnen de trypsine en geen trypsine groepen, werden beelden verkregen met identieke instrumentele instellingen tussen de verschillende ACs komt te staan. Het gedeelte van de Trypsine van figuur 4 is aangepast van refefence 34 met toestemming. Aangepast en herdrukt met toestemming van Beaudoin, S. et al. ChAcNLS, een nieuwe wijziging van antilichaam-geconjugeerde toelaat Target cel-specifieke Endosomal ontsnappen, Localization voor de Nucleus, en verbeterde totale intracellulaire accumulatie. Moleculaire Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Figuur 5: 64Cu-A14-ChAcNLS zuiverheid en affiniteit. (A) de radiochemische zuiverheid van 64Cu-geëtiketteerden A14, A14-NLS, A14-ChAcNLS werden gecontroleerd door SDS-PAGE gevolgd met behulp van autoradiografie. (B) specifieke bindende curven voor 64Cu-A14 en 64Cu-A14-ChAcNLS op HT-1376 en HT-B9 cellen. Foutbalken geven de standaarddeviatie van een experiment uitgevoerd in repliceren. Aangepast en herdrukt met toestemming van Paquette, M. et al.. NLS-cholzuur zure vervoeging aan IL-5Rα-specifieke antilichaam verbetert de cellulaire accumulatie en in vivo tumor-targeting eigenschappen in een blaas kanker model. Bioconjugate chemie. DOI:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Figuur 6: 64Cu nucleaire en intracellulaire accumulatie. Representatief voorbeeld van cel behandeling uitgevoerd in drievoud (foutbalken duiden standaarddeviatie) om aan te tonen van de specificiteit van de (A) en (B) verbetering van de accumulatie van 64Cu-A14-ChAcNLS. De accumulatie van % wordt gepresenteerd in de nucleus (linker panelen) en de totale intracellulaire ruimte (juiste panelen) ten opzichte van de totale hoeveelheid radioactiviteit gebruikt tijdens de behandeling van IL-5Rα-positieve invasieve blaas kankercellen. Foutbalken geven de standaarddeviatie van een experiment uitgevoerd in repliceren. * geeft de p ≤0.05.
Figuur 7: analyse van cel fractionering Procedure. Westelijke vlek van nucleaire (A) en (B) Cytoplasmic breuken voor triplex airco (bovenste blots; rode pijlen) en Rab 7 (onderkant blots; zwarte pijlen) verkregen behandeling van HT-1376 en HT-B9 cellen in plasmamembraan lysis-buffermengsel met 1%, 2% of 4 % NP-40. Hele cellen lysed met de buffer RIPA werd gebruikt als positieve controle voor triplex A/C en Rab7 in beide breuken. Lopende normen (L) zijn alleen in top blots afgebeeld. Drie pijlen staan voor triplex airco vanwege zijn meerdere isoforms. Aangepast en herdrukt met toestemming van Paquette, M. et al. NLS-cholzuur zure vervoeging aan IL-5Rα-specifieke antilichaam verbetert de cellulaire accumulatie en in vivo tumor-targeting eigenschappen in een blaas kanker model. Bioconjugate chemie. DOI:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Figuur 8: In Vivo analyse van de Tumor gericht op door PET beeldvorming en ROI analyse. (A) PET beelden op 48 h na injectie van knik/SCID muizen die HT-1376 (rode pijlen) en HT-B9 (blauwe pijlen) tumoren intraveneus ingespoten met 64Cu-A14 en 64Cu-A14-NLS 64Cu-A14-ChAcNLS. Groene pijl is lever opname. Spier ROI tekening weergegeven met magenta cirkel. (B) ROI HT-1376 en HT-B9 tumor-aan-spier verhoudingen van de ACs op 48 h na injectie. Foutbalken geven standaarddeviatie van experiment in n = 10 ROIs per muis (n = 5). * geeft aan p 0.05.
| Tat |
| CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20 |
| CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30 |
| CGISYGRKKRRQRRR 29 |
| GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25 |
| TRQARRNRRRRWRERQRGC 26 |
| NLS |
| CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27 |
| Cholzuur en-CGYGPKKKRKVGG 34 |
Tabel 1: Lijst van Tat en SV-40 grote T-antigeen afgeleid peptiden in AC wijzigingen gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belangrijkste doelstellingen van systemische levering van anti-kanker agenten zijn te verhogen van accumulatie op de site van de tumor, en opname binnen kankercellen, of ongewenste bijwerkingen in de gezonde weefsels. AC gericht levering van moleculaire payloads aan tumorcellen is een zeer veelbelovende benadering behandelen en tumoren op te sporen. Echter het gebrek aan doeltreffendheid veroorzaakt door beklemming van de endosome en beneden lysosomale aantasting van de stream blijft een belangrijke uitdaging. Terwijl dit protocol maakt gebruik van de ChAcNLS peptide als voorbeeld voor de bouw van de volgende generatie ACs, zijn de beschreven procedures aanpasbaar aan elk peptide gemodificeerde AC ontwikkeld met het doel van het verhogen van de hoeveelheid intracellulair geleverde payload gericht kankercellen.
De meest kritische stappen in dit protocol zijn: 1) identificeren en beperken van hoge MW statistische soorten; 2) de trypsinebehandeling van cellen vóór de analyse voor het bepalen van de intracellulaire accumulatie; 3) het uitvoeren van de waarborging van de kwaliteit van de cellulaire fractionering procedures; en 4) uitvoeren van huisdier om te evalueren van de tumor gericht op in vivoimaging.
Het is belangrijk dat de vervoeging van virus-afgeleide peptiden aan mAbs niet leidt tot een hoge MW statistische soorten die waarschijnlijk door intramoleculaire crosslinking tussen mAbs veroorzaakt wordt. Dit is de eerste zorg en moet worden aangepakt voordat verder vordert. Vooruit met peptide gemodificeerde ACs die ongewenste aggregaten bevatten, kan de resultaten die valse over aspecten zoals de intracellulaire en in vivo payload levering profielen bewijzen opleveren. Reactieve maleimides over mAbs is wat is waarschijnlijk verantwoordelijk voor covalente aggregatie. Een oplossing is om de sulfo-SMCC-naar-mAb-verhouding. Een ander alternatief is het gebruik van N-acetyl derivaten van aminozuren zoals Cys, Lys, zijn Ser en Thr tijdens peptide vervoeging tot en met de maleimide-geactiveerde mAb- 45. De nucleofiele zijketens zijn in staat om te reageren met de groep van de maleimide van SMCC en intra-antilichaam crosslinking verlagen. Anderzijds kan de scheiding door grootte uitsluiting chromatografie na conjugatie te isoleren monomeer soorten 45worden gebruikt. Sitespecifiek vervoeging van de peptide aan het antilichaam kan ook worden uitgevoerd. Bijvoorbeeld, kunnen antilichaam koolhydraten worden gewijzigd voor conjugatie aan peptides, waarvan is aangetoond dat het efficiënt produceren monomeer soorten 24.
SDS-pagina met 12% polyacrylamide gels is een goedkope en effectieve methode om te krijgen een breed perspectief van groot formaat verschillen in AC soorten. Als een toename van de % polyacrylamide wordt gebruikt, zullen de scheiding van zware kettingen en intramoleculaire soorten moeilijk te onderscheiden. Omgekeerd, als een verminderde % polyacrylamide is gebruikt, de lichte kettingen dreigen te lopen uit de gel. Kleurovergang gels met 4-20% polyacrylamide ook bieden goede retentie frequentieverschuivingen bij de zware en lichte kettingen op een enkele gel. Onder de verschillende analytische technieken beschikbaar voor biomoleculaire analyse zijn hoge-prestatie vloeistofchromatografie en capillaire elektroforese-SDS superieur aan SDS-pagina voor de scheiding en de karakterisering van ACs- 46. SDS-pagina is echter een vroege en goedkope methode voor het analyseren van de initiële bouw van deze nieuwe agenten en dan beslissen over de volgende cursus van actie.
De incubatie van de cellen in oplossing met 0,25% trypsine (stap 2.3), die een maximum aantal celoppervlak eiwitten en afhankelijke ACs verwijdert is belangrijk, omdat het zorgt voor verbeterde visualisatie en relatieve stijgingen van de intracellulaire accumulatie tussen Referentie antilichamen. De camera parameters zijn ingesteld om beelden bij maximaal fluorescentie intensiteit te vangen. Dit is gevolg van variatie van cel naar cel in het bedrag van AC die is verzameld. Dus, vastleggen van beelden bij maximale intensiteit zorgt voor cellen met minder AC accumulatie ook worden geëvalueerd. Kanker-antigenen worden echter meestal sterk uitgedrukt op tumorcellen. Als de cellen het niet aan de spijsvertering door trypsine onderworpen werden, dan is de fluorescentie die afkomstig zijn van de ACs aan het celoppervlak zou domineren van de afbeelding. Bovendien, zonder trypsinebehandeling kan ontwikkeling worden beperkt met ACs met subtiele maar belangrijke intracellulaire accumulatie eigenschappen.
Het waarborgen van cellulaire fractionering van hoge kwaliteit is belangrijk om nauwkeurig beoordelen van de accumulatie van 64Cu in de kern ten opzichte van het cytoplasma. Het vermogen van ChAcNLS om het verhogen van de accumulatie van AC en lading intracellulaire is te wijten aan de actieve localization voor de nucleus- 34. Als toekomstige virus-peptiden zijn ontwikkeld, kunnen ook deze peptiden lokaliseren op de nucleus als onderdeel van hun mechanisme intracellulaire payload efficiëntie te vergroten. Het is dus belangrijk dat cellulaire fractionering van hoge kwaliteit voor nauwkeurig het detail van dit proces. Dit protocol onderstreept het belang van de evaluatie van de kernen van cytoplasmatische markeringen en ook de cytoplasmatische breuk voor nucleaire markeringen. Bijvoorbeeld, Hu et al., ontwikkelde een AC gewijzigd met een peptide Tat en nucleaire accumulatie van een isotoop lading 24onderzocht. Westelijke vlekkenanalyse voor calpain, een overvloedige cytoplasmatische eiwit, was aanwezig in de nucleaire Fractie. Dit was waarschijnlijk omdat commerciële nucleaire isolatie kits werden gebruikt. Dit protocol aangetoond dat HT-1376 en HT-B9 vereist verschillende concentraties van NP-40 cellen om te isoleren verrijkt kernen met intact membranen. Wanneer HT-B9 cellen werden lysed met buffer was met 4% NP-40, triplex airco aanwezig in de cytoplasmatische breuk die aangeeft de behandeling verstoord nucleaire membranen en toegestaan voor triplex airco in te voeren van het cytoplasma. Als de nucleaire en cytoplasmatische breuken zorgvuldig niet geïsoleerd zijn, zou het moeilijk te bepalen van de bijdrage van nucleaire localization voor totale intracellulaire accumulatie. Er zijn meldingen van biologische - en kunstmatig-afgeleide peptiden die specifiek gericht zijn op andere intracellulaire compartimenten zoals endoplasmatisch reticulum, Golgi-apparaat en mitochondriën 47,48,49. Het isolement van intracellulaire compartimenten wordt dus steeds relevanter.
Dit protocol eindigt met de beschrijving van 64Cu-A14-ChAcNLS targeting van HT-1376 en HT-B9 tumoren. Van de visuele controle van de PET-afbeeldingen in Figuur 8, het is duidelijk door de verhoogde tumor PET signaal ten opzichte van de aangrenzende verminderd omringende achtergrond 64Cu-A14-ChAcNLS heeft superieure targeting van HT-1376 en HT-B9 tumoren (figuur 8A ). ROI analyse blijkt ook haar vermogen om te evalueren van de tumor gericht. In ons voorbeeld gebruiken we ROI tumor-aan-spier ratio's te kwantificeren tumor gericht en tonen 64Cu-A14-ChAcNLS is de superieure AC (Figuur 8). HUISDIER imaging voorziet ook in de evaluatie van het AC vastleggen in gezonde organen. De lever is het belangrijkste orgaan dat antilichamen metaboliseert. Figuur 8A toont opname in de lever is vergelijkbaar in muizen ingespoten met 64Cu-A14-ChAcNLS en 64Cu-A14. Op deze vroege ontwikkelingsfase suggereert deze gegevens dat chacnls veroorzaakt geen ongewenste vastleggen. 64 Cu heeft een halfwaardetijd van 12,7 h, die is niet ideaal voor ACs die half-leven van meerdere dagen. Zoals eerder is beschreven in het visuele protocol door Zeglis en Lewis is het gebruik van de langlevende isotoop zirkonium-89 (89Zr) een lading waarvan fysische halveringstijd is ideaal voor mAbs en image kan worden gemaakt door huisdier 50. 89Zr is voor de evaluatie van tumor levering gedurende een aantal dagen, dus een juiste keuze. Dit is vooral belangrijk als therapie is een doel waar hoge tumor opname is gunstig en verhoogt na verloop van tijd met antilichamen 7. Ook moet ook worden uitgevoerd om te bepalen van individuele orgel opname verder te verkennen de targeting of vastleggen van eigenschappen van nieuw ontwikkelde ACs. Daarnaast kunnen muizen worden predosed met ongewijzigde specifieke antilichaam voor takel terreinen van de receptor op tumorcellen te evalueren targeting specificiteit. Niettemin, 64Cu met PET beeldvorming en ROI analyse voldoende bieden een eerste evaluatie van de tumor levering eigenschappen van de ontwikkelde ACs gepresenteerd in dit protocol.
ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden geweest tot nu toe beperkt tot de levering van radioactieve isotopen. Dit is deels te wijten aan historische redenen en ook omdat radio-isotopen gemakkelijk tijdens het in vitro en in vivo testen zijn gekwantificeerd en kunnen worden gevisualiseerd met behulp van noninvasive gehele lichaam beeldvormende modaliteiten. Natuurlijk, dit veld breidt uit naar het transport en de aflevering van de codering van de payloads dan radio-isotopen, zoals chemotherapeutica, enzymen en oligonucleotides, aangebrachte wijzigingen in de technieken beschreven in dit protocol zal moeten worden ontwikkeld. Bijvoorbeeld, zal nieuwe methoden voor de evaluatie van de intracellulaire accumulatie van alternatieve payloads moeten worden ontwikkeld. Daarnaast zal de wijzigingen voor in vivo evaluatie bee noodzakelijk, aangezien deze codering van de payloads kunnen niet gemakkelijk worden beeld en daarom het moeilijk worden zal om ook, specificiteit en tumor opname efficiëntie te beoordelen. Om deze redenen moeten radionuclide payloads blijven als surrogaat payloads voor toekomstige ontwikkeling met alternatieve ladingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de kanker Research Society (Canada) en de CIMS. De auteurs bedanken Dr. Samia Ait-Mohand en Jean-Francois Beaudoin voor hulp. Dr. Angel Lopez (Universiteit van Zuid-Australië) voor mAb A14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
References
- Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
- Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
- Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
- Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
- Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
- Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
- Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
- Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
- Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
- Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
- Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
- Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
- Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
- Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
- Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
- Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
- Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
- Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
- Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
- Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
- Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
- Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
- Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
- Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
- Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
- Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
- Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
- Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
- Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
- Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
- Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
- Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
- Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
- Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
- Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
- Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
- Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
- Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
- Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
- Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
- Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
