Summary
病毒衍生肽与抗体结合 (ACs) 是一种获得动力的方法, 由于可能提供的分子负载增加肿瘤细胞积累。利用常用的方法来评估肽共轭、AC 和有效载荷的胞内积累和肿瘤靶向, 这项协议帮助研究人员在关键的初步发展阶段。
Abstract
用病毒衍生肽修饰的抗体共轭物 (acs) 是一种潜在强大的肿瘤细胞传递剂, 用于癌症治疗和影像学的分子有效载荷, 原因是细胞积累超过了目前的 ACs。在早期交流体外开发过程中, 荧光技术和 radioimmunoassays 对确定细胞内定位、积累效率和靶细胞特异性都有足够的作用。目前, 对于制备细胞以评价交流细胞内聚集和定位的标准化方法尚无共识。对使用病毒衍生肽进行修饰的 ACs 的初步测试是至关重要的, 特别是如果已经建立了几个候选者。通过荧光法测定细胞内的细胞积累, 可影响其表面的背景信号, 使堆积物的解释复杂化。对于 radioimmunoassays, 通常被处理的细胞被分割, 并测量不同细胞间的放射性。然而, 细胞裂解从细胞到细胞不同, 通常细胞核和细胞质隔间没有充分的隔离。这可能会产生关于负载传递属性的误导性数据。核素病毒衍生肽修饰 ACs 在肿瘤荷载小鼠中的静脉注射和核素显像是确定肿瘤靶向和有效载荷传递特性的有力方法, 在体内阶段发展.然而, 这是一个相对较新的进展, 很少有团体以这种方式评估病毒衍生的肽修饰 ACs。我们描述治疗细胞的处理, 以更准确地评估病毒衍生的肽修饰交流积累时, 使用共焦显微镜和 radioimmunoassays。具体地说, 一种 trypsinizing 单元格移除单元格表面绑定 ACs 的方法。我们还提供了一种改善细胞分馏的方法。最后, 本协议提供了一个体内方法, 使用正电子发射断层扫描 (PET) 评估肿瘤小鼠的初始肿瘤靶向性。我们使用放射性同位素64Cu (t1/2 = 12.7 h) 作为本协议中的一个示例负载。
Introduction
抗体共轭 (ACs) 是生物成熟成为一个转化类的有效药物改善癌症治疗和检测肿瘤。ACs 由与分子有效载荷 (如放射性同位素、小分子和生物毒素) 共轭的单克隆抗体组成, 能够将这些有效载荷传递给具有精致靶抗原亲和性和特异性的癌细胞。因此 ACs 有可能显著减少非特异性毒性, 并增加肿瘤部位的有效载荷活动。治疗, ACs 运输细胞毒性小分子 (通常称为抗体-药物共轭) 已被批准处理乳腺癌和霍奇金淋巴瘤谁已经失败常规治疗1,2. 此外, 运输放射性同位素 (通常称为 radioimmunoconjugates) 的 ACs 也在开发中。通过交流传输放射性同位素进行成像, 确认前列腺癌转移3。随着更多的治疗 acs 提交批准4, 乐观是高的未来 acs, 以改善癌症护理5。
然而, 在运送化疗或放射性同位素时, ACs 很难有效地在靶细胞内积聚这些有效载荷。在许多情况下, 这方面显著地有助于 ACs 无法提供持久无疾病生存或高对比度肿瘤成像6,7。一般而言, 一旦 ACs 结合其目标抗原, 它们就会通过称为受体介导的吞的过程内部化。然后, ACs 被包裹在内涵体内并被贩运到溶酶体中, 用于降解和有效载荷释放 8. 细胞内的贩运过程给 ACs 带来了挑战, 以达到高有效载荷特异性和抗靶向癌细胞的功效。例如, 许多抗原, 如 Her2 (治疗交流曲妥珠单抗-emtansine 靶) 可以在前 30分钟9 中回收多达85% 的绑定抗体。此外, 一旦降解发生, 释放的化疗和放射性同位素可以通过增加表达和/或活动的膜相关传输蛋白10,11积极出口。溶酶体的降解也阻碍了新的生物有效载荷的传递, 如治疗酵素和寡核苷酸, 可以被停用12,13。从本质上讲, 癌细胞是高效的废除细胞内积累的有效载荷由 ACs 提供。
该协议描述了如何实现 ACs-耦合到病毒衍生肽的概念, 特别是为了逃避 endosome 诱捕和本地化到细胞核。这种复杂的操作宿主细胞系统, 这并不奇怪, 病毒衍生蛋白和肽作为潜在的生物的发展早已根深蒂固的治疗研究14。为了有效地进入宿主细胞, 在数以百万年的时间里, 病毒进化来获得一种特殊的蛋白质集合, 能够利用正常的生理哺乳动物细胞系统。对于通过受体介导的吞内化的病毒, 他们也面临着逃避贩运到溶酶体的挑战, 那里的蛋白酶局部浓度的冲击可能会对生存有问题。一种具有良好特征的病毒衍生肽, 用于药物的传递, 以逃避 endosome 诱捕是人体免疫机能丧失病毒 transactivator 转录 (达) 蛋白15。达能通过传感低 pH 值来逃避 endosome 诱捕, 在这种情况下, 蛋白质构象的变化发生, 使达能够插入和扰乱细胞膜膜16。这就产生了能进入细胞质的达-负载共轭物。与此协议相关的第二个病毒操作元素是用于将治疗基因和药物传递给核的方法17。病毒已经进化到成功地操纵宿主细胞机械, 通过核孔复合体通过核膜的进展。蜂窝大分子包含 (或结合含有的蛋白质) 核定位信号 (NLSs), 以绑定到核转运蛋白 (例如karyopherins α和β), 通过 NPC 提供必要的运动。病毒已经开发出含有 NLS 序列的蛋白质, 使它们能够利用宿主细胞传输蛋白来传送到细胞核18。
许多 ACs 以前已经功能性与达-和 NLS 衍生肽, 并测试他们的能力积累在癌细胞和靶向肿瘤19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (表 1)。提供细胞毒性有效载荷的研究表明, 通过病毒衍生肽进行修饰的 acs 能够显著增加细胞积累、细胞毒性和肿瘤死亡, 超过未修改的 ACs 22,26。这个新的交流类的一个共同特点是他们的建设。通常情况下, 多肽含有一个末端半胱氨酸, 提供游离巯基。抗体首先反应的是 noncleavable 双交联剂, 其中包含N-琥珀 (NHS) 和 maleimide 组在相反的一端。NHS 酯在单克隆抗体上与主要胺反应形成酰胺键。与自由 maleimide 组的反应, 然后反应与巯基组对肽形成一个硫酯键, 从而连接肽和单克隆。虽然同型交联剂已使用 28, 但 heterobifunctional 交联剂更常用于构建病毒衍生肽-ACs22,23,26, 31,32。本议定书特别使用交联 sulfosuccinimidyl 4-(n-马来) 环己烷-1-羧酸酯 (磺当局), 以便于使用, 因为它被用于经批准的抗体-药物共轭曲妥珠单抗-emtansine, 在许多病毒衍生肽-ACs 8,22,23,26,31,32。月桂酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS 页) 是初步确定共轭效率和半定量的多肽每单克隆的主要方法。共焦显微术使用荧光标记的二次抗体特定于单克隆, 通常是初步评价病毒衍生肽修饰 ACs 细胞内分布特性的方法。迄今为止, 放射性同位素是由病毒衍生的肽修饰 ACs 提供的主要有效载荷。放射性同位素是有利的, 因为细胞中的放射性可以很容易地通过伽玛计数来量化。此外, 被翻译成老鼠的人类癌症模型的 ACs 为研究人员提供了评估肿瘤靶向性的能力, 例如单光子发射计算机断层扫描和正电子发射层析成像 (PET)。23,32,33. 一般而言, 研究人员主要使用的构造和验证测试方法为在初始开发阶段对病毒衍生肽进行了改进的 ACs 提供了很好的评估, 以便有效地进入和交付靶细胞内的有效载荷和靶向肿瘤。
达-和 NLS 修饰的 ACs 已经照亮了进一步改善肿瘤细胞和肿瘤内有效载荷的关键领域。关于 NLS 修改的 ACs, 细胞内积累的效率可以是适度的23,31,34。细胞内积聚效率低下是由持续的细胞膜诱捕引起的。在体内肿瘤靶向也可以减少与达-和 NLS 修改 ACs。有效序列的达和 NLS 含有几个正电荷残留物。当附加到抗体时, 总阳离子电荷可以显著增加35。因此, 经和 NLS 改良的 ACs 增加了对健康组织的吸收, 并增加了快速的血液清除量。
我们的小组开发了一个复合化合物组成的胆酸与 NLS (ChAcNLS;图 1)。ChAcNLS 修饰的 acs 能够增加所提供的放射性同位素的胞内积累和改善肿瘤靶向性, 与 NLS 修改和传统 ACs 33,34。胆酸的机制是由选择 nonenveloped 病毒的能力所激发的, 不能依靠膜融合来利用胆酸通过神经酰胺的形成来触发 endosome 逃逸。例如, 猪肠道病毒新兵胆酸激活 sphingomyelinase, 催化鞘磷脂水解成神经酰胺 36, 37, 38. 这破坏细胞膜膜, 并允许病毒逃逸。因此, 胆酸是另一个病毒衍生成分, 补充 NLS。
随着这一领域的向前推进和未来的进步发生在负载交付由 ACs 修改与病毒衍生肽, 这是一个适当的时间来提供视觉示范其生物化学和功能特性的初步发展。在这里, 我们描述我们的协议, 初步评估病毒衍生肽修饰 ACs 的有效而简单的确定细胞内积累和肿瘤靶向在早期发展。我们使用商业上可用的抗体7G3 和 A14 作为示例模型系统。步骤1描述了使用 SDS 页作为一种方法, 允许对构造的 ACs 进行 "转/不走" 决策。程序2描述了一种使用 trypsinization 的方法, 用于改善交流细胞内分布和积累的可视化。步骤3描述了一种改进细胞内分馏的方法, 以准确确定核定位。在这个过程中, 我们利用负载64Cu (t1/2 = 12.7 h), 因为它易受细胞外流, 是正电子发射器10。因此, 程序4描述了在体内肿瘤靶向特征的 PET 成像, 以可视化肿瘤摄取相对于背景 (即nontarget 健康组织), 并确定该例交流是否可以具体和有效地靶向肿瘤。这些方法足以为研究人员开发的 ACs 修改与病毒衍生肽, 以确定候选者进一步提高。
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Protocol
所描述的体内动物实验是根据一项经批准的议定书和中心 Hospitalier Universitaire de 舍布鲁克伦理学委员会动物实验的道德准则进行的。
1. 抗体肽共轭
注: ChAcNLS 可在任何商业肽制造商或大学附属的多肽综合服务平台上合成。ChAcNLS 的合成可以在参考34中找到。对于程序1和2使用单克隆 7G3, 这是特定的白血病抗原 IL-3Rα 39。
- 在一个1.7 毫升的离心管, 准备10毫克/毫升 (1 毫克总抗体) 溶液的7G3 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS), pH 7.6。
- 将磺-当局在二甲基亚砜 (亚砜) 中溶解, 浓度为5-10 毫米。涡流解决方案, 以达到完全溶解的最佳效果。
- 添加到包含7G3 溶解磺-当局溶液的管 (通常在 5-20 ul 之间取决于 sulfo-SMCC-to-7G3 所需的摩尔比)。建议对10、25和50到1的 sulfo-SMCC-to-7G3 比率进行测试。室温孵育1小时。
-
在 PBS、pH 值7.0 中使用超滤装置和缓冲交换纯化和浓缩 maleimide-衍生物7G3。离心机在 8000 x g 左右, 约5分钟丢弃, 并填充 PBS, pH 值7.0 和离心机。
- 执行这7-8 次以完全交换缓冲区。将过滤装置倒在干净的离心管中, 以恢复浓缩7G3 蛋白。离心机为2分钟, 在 1000 x g. 回收量应约0.3 毫升
- 在含有 maleimide 活化7G3 的管中, 增加2倍摩尔的 ChAcNLS 相对于上一步所用的 sulfo-SMCC-to-7G3 比, 并在4摄氏度一夜之间孵化。例如, 如果使用了10到1的 sulfo-SMCC-to-7G3 比率, 则使用20到1的 ChAcNLS-to-7G3 比率。总成交量不应显著改变。
注意: 虽然 ChAcNLS 在共轭过程中不会引起降水, 但这是可能发生的其他肽。在反应过程中观察管内沉淀的迹象, 这很可能是由于多肽是疏水引起的。在这些情况下, 它可能值得重新研究的兴趣肽, 以便设计变化, 以提供增加的亲水性。 - 使用超滤装置将 7G3 ChAcNLS 浓缩到所需浓度和 PBS pH 值7.4 的缓冲交换 (见步骤 1.4)。总蛋白回收率应为原起始材料的≥75%。
- 使用12% 聚丙烯酰胺凝胶 (提供足够的分离 ChAcNLS 共轭重和轻链从 nonconjugated 链), 执行 SDS 页评估构建的 7G3 ChAcNLS 候选者。混合10微克的 7G3-ChAcNLS 在页面加载缓冲区包含 2 ul β-巯基乙醇和负载入井。
- 设置适当的电压 (120 V 为1小时12% 凝胶) 和运行电泳。当考马斯染料前端到达凝胶底部时, 停止电泳。
注意: 不要让考马斯染料前面的凝胶。 - 从电泳装置中取出凝胶, 用含有10% 伏/v 的冰乙酸和20% 伏/钒甲醇的脱色溶液冲洗。
- 采取凝胶的相片和用标尺和测量距离 (cm) 迁移为标准和7G3 共轭物。计算保留系数 (Rf) 值, 这是迁移距离除以凝胶长度 (从何处将蛋白质加载到考马斯迁移前端)。将分子量 (兆瓦) 与每个蛋白质标准中的射频值进行记录, 并推断7G3 共轭物的大小。
- 用1768.5 克/摩尔 (兆瓦 ChAcNLS) 除以7G3 共轭和未修改7G3 之间的差异, 计算每种抗体的肽数量。
- 采取考马斯染色凝胶的数字图像, 进行密度分析。在这一点上, 选择一个潜在的候选者可以根据 AC 与最大数量的 ChAcNLS 分子, 不包含重要的聚集物种。
2. 细胞内聚集评价的共焦显微术
注意: 重要的是要测试的细胞选择性的肽修饰抗体之前, 开发配方与有效载荷的利益。由于达也被证明具有非特异性细胞穿透的倾向, 它值得首先分析细胞内积累和细胞选择性, 然后采取昂贵的有效载荷的开发步骤。因此, 程序1还应修改同种特定无关的控制抗体。对于该协议的其余部分, 我们将使用 10 ChAcNLS 分子每抗体修改 ACs。图 2中描述了包括过程2和3的关键步骤的示意图。
注意: 该协议的这一步骤涉及对多聚甲醛的处理和操作。处理时请遵照制造商的指示操作。
- 治疗靶 TF-1a 细胞与200毫微米的 7G3-ChAcNLS 包括改良控制抗体。孵育 5 x 106抗原阳性细胞与共轭物为 1 h 在37°c。
- 1小时后, 取出上清, 用1毫升3x 的冰冷 PBS 冲洗。添加新鲜的媒体和孵化一个额外的小时在37摄氏度。
-
在增加的小时以后, 去除上清和洗涤3x 在1毫升冰冷 PBS。添加0.5 毫升的 PBS, 含0.25% 胰蛋白酶和乙二胺四乙酸 (EDTA), 37 摄氏度, 3 至30分钟。
注: 在初步试验中, 建议不要胰蛋白酶处理细胞, 以确定交流细胞内积聚的差异。这个协议促进了胰蛋白酶的使用, 我们展示了如何改善不同交流候选者细胞内积累效率的评估。- 通过目视检查所有要分离的单元格, 测试不同的孵化时间。此外, 孵化细胞整除数与生存能力染色解决方案和执行流细胞分析, 如前所述的 40.
- 中和胰蛋白酶与1.5 毫升细胞培养 RPMI 1640 media/10%fetal 牛血清。离心细胞在 500 x g 5 分钟, 去除上清, 并且洗涤3x 在0.5 毫升冰冷 PBS。
- 固定细胞在0.5 毫升 pbs 包含1% 多聚甲醛和1% 蔗糖在冰上30分钟洗涤细胞3x 在0.5 毫升冰冷 pbs 并且离心机在 250 x g 在5毫升 pbs 中0.5 个 Permeabilize 细胞 0.15% ml 在冰上包含分钟的海卫 X-100。在冰冷的 PBS 中洗涤细胞并重复离心。
-
悬浮细胞在0.1 毫升 PBS 包含2微克/毫升 (或制造商推荐浓度) 的抗鼠 (同种特异) Fc 次级多克隆抗体共轭到 AlexaFluor 647 在室温下在黑暗中的1小时。
- 离心机在 250 x g 5 分钟和洗涤细胞3x 在0.5 毫升冰冷 PBS。在0.5 毫升 PBS 中悬浮细胞。
暂停: 单元格可以存储在冰箱中。
注意: 必须选择一个二级抗体, 识别出正确的同种的单克隆的兴趣。AF647 是由于其远红外辐射而选择的, 不干扰碘碘 (PI) 染色的细胞核。
- 离心机在 250 x g 5 分钟和洗涤细胞3x 在0.5 毫升冰冷 PBS。在0.5 毫升 PBS 中悬浮细胞。
- 添加 PI 到10微克/毫升浓度的容器与细胞。接下来, 将 1 x 105单元格安装到玻璃幻灯片上, 使用安装介质并盖上玻璃盖玻片。
- 检查细胞与计划的60X 油浸泡目标 NA 1.42 在反向激光扫描共聚焦显微镜。检测 PI 荧光使用 488 nm 氩激光和光谱扫描棱镜设置为 600-650 nm。为 AF647 荧光使用633毫微米氦氖激光和光谱扫描棱镜设置为 650-700 毫微米。依次收集 PI 和 AF647 的荧光辐射。
注意: 在单元格的评估和比较中使用相同的设置。但是, 与非 trypsinized 单元格相比, 您必须调整 trypsinized 单元格的设置。 - 使用显微镜软件获取图像。使用 1024 x 1024 像素的串行水平光学剖面收集图像, 并通过整个细胞厚度在0.5 微米间隔内进行2X 线平均。在最大荧光强度下, 以四连续切片显示图像为堆叠 z 投影。
- 用显微镜软件分析细胞。记录共轭物的细胞分布格局。具体来说, 评估细胞质内的细胞内荧光是否被分组, 靠近细胞表面或弥漫和均匀。还要评估每个细胞的相对荧光强度。
3. 核素交流结构和细胞分馏法评价64铜胞内分娩效率
注意: 程序3和4涉及放射性的处理和操纵。在执行这些步骤之前, 研究人员应该已经批准了他们的家庭机构的辐射安全局批准的安全培训和协议。
注: 对于程序3和 4, 我们使用单克隆 A14, 这是特定的浸润性膀胱癌抗原 IL-5Rα41。此外, 由于64Cu 的短半衰期, 所有实验都是时间敏感的。一般而言, 最好不要等待过去1周来执行体外实验, 而不超过72小时用于体内研究。
- 在1.7 毫升管悬浮 22 '-(7-(2-(25-dioxopyrrolidin-1-基) 氧)-2-乙醛基)-14, 7-triazonane-14-己) diacetic 酸 (不-NHS) 在亚砜到浓度10毫米。
- 反应50倍摩尔过量的不-nhs 与 A14 (2 毫克起始材料) 在0.1 米碳酸氢钠在 pH 8.6 为 1 h 在室温下的容积≤0.5 毫升 (最后的非 NHS 卷不应超过 2% v/v 的总体积)。
- 净化和缓冲交换 NOTA-A14 使用一个超滤装置在 PBS, pH 值 7.6 (见步骤 1.4)。
- 对于后续的 ChAcNLS 连接, 请执行步骤 1.2-1.6。
- 反应 NOTA-A14-ChAcNLS (250 微克批次) 与 100 megabecquerel (MBq) 64CuCl2在 0.1 M 碳酸氢钠, pH 5.5 为 1 h 在37°c ≤0.1 毫升。64铜是在 CIMS 42上的 TR PET 回旋加速器上生产的。
- 将64Cu-A14-ChAcNLS 集中在 PBS pH 值7.4 中, 使用超滤装置达到所需浓度 (见步骤 1.4)。
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用色谱条和 0.1 M, pH 值5.5 柠檬酸钠 (ITLC 淋洗) 作为溶剂, 确定64Cu-A14-ChAcNLS 的 radiolabeling 效率 (ITLC)。将反应溶液的 0.5 ul 整除应用于 ITLC 条。执行 autoradiograph, 获取数字图像。
- 执行密度测量以获得绑定和自由64Cu 的比例。如果可用64Cu 内容为 > 5%, 请返回上一步并执行其他净化操作。
- 此外, 使用考马斯染色进行 SDS 页来评估聚合。执行第二个 SDS 页, 然后 autoradiograph 的凝胶, 以确定是否有核素的聚合物种。
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亲和结合质量检查点: 孵育64Cu-A14 共轭在增加浓度 (0-100 nM) 以重复与 1 x 106目标细胞每毫升。要估计非特异性绑定, 请将64Cu-A14 与细胞的重复样本混合在100倍摩尔超过未标记 A14 的情况下。
- 在冰上孵化1小时后, 在伽玛计数器中冲洗细胞和计数总束缚抗体样本和总非特异性束缚抗体样本。图特定绑定 (总绑定抗体-非特异性绑定抗体) 反对无活性自由64Cu-A14 (nM) 在化验中使用。通过使用图形软件进行非线性回归确定离解常数 (Kd)。
- 对于64cu 细胞积累研究: 以 100 nM 的64铜标记的 A14 共轭物治疗细胞 1 h, 6 h, 24 h 在37°c, 如前所述33。包括其他参数, 如在未修改的 A14 存在的情况下进行治疗, 以阻止 IL-5Rα地点和4摄氏度, 以阻断受体介导的内部化。
- 在定义的时间点, 如前述步骤 2.3-2.3.2, 添加0.5 毫升的 PBS, 含有0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 在37°c, 其次是中和和洗涤。
- 在 1% NP-40, 10 毫米三 pH 7.5, 10 毫米氯化钠, 3 毫米氯化镁2缓冲器的等离子膜裂解缓冲液中孵化细胞为10分钟. 离心机在 90 x g 的等离子膜裂解细胞为5分钟。
- 取出上清液并放置在新鲜的管子中。这代表细胞质分数。在冰冷的 PBS 中洗涤原子核 3x, 并将洗涤液加入胞浆部分。
- 确保含有核和细胞质馏分的瓶子密封。然后将它们放在校准为64Cu 的伽玛计数器中, 以便将原始计数转换为 MBq。
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通过对 Lamin、限制性核蛋白和 Rab7, 对全细胞裂解液、核和细胞质馏分进行了丰富的细胞质蛋白分析, 确定核分离的质量。
- 将 5 x 106单元格与 500 ul 的无线电免疫沉淀检测 (马国贤) 缓冲器和在3.12、1% 和 2% NP-40 的步骤4% 中的等离子膜裂解缓冲液治疗。此外, 在 500 ul 马国贤缓冲液中分离出的细胞核, 以获得分离的核蛋白。
- 用4x 的冷丙酮样品体积, 沉淀分离的核、细胞质和全细胞蛋白, 60 分钟-20 摄氏度。离心机在 1.3万 x g 的10分钟和醒酒上清, 小心不要去除蛋白颗粒。添加 100 ul 的 PBS, 以溶解蛋白质。
- 将10微克的蛋白质装入10% 页凝胶的每个井中。按照 1.7-1.9 的描述进行电泳。执行以前在 refeference 43中描述的西方印迹传输。
- 找出最符合 40 kDa 的阶梯标记。用这个标记把膜切成两半。用 Lamin A/C 特异抗体探测含有较高兆瓦蛋白的印迹。用7特异性抗体探测膜与下兆瓦蛋白。西方污点是一个众所周知的技术, 并没有在本议定书中描述。
4. 肿瘤靶向的 PET 成像评价
注: 在小鼠体内植入肿瘤细胞以产生异位移植的技术是众所周知的, 大多数实验室都有为其肿瘤系统量身定做的内部协议。因此, 议定书没有涵盖这一点。异种移植模型将非肥胖糖尿病/重症合并 immunodeficient (点头/免疫缺陷) 小鼠, IL-5Rα-positive 浸润性膀胱肿瘤 HT-1376 和 HT-B9。IL-5Rα-positive 浸润性膀胱肿瘤细胞包括 > 66% 的总细胞在异种移植。相比之下, 仅有11% 的 IL-5Rα-positive HT-B9 细胞包含在发育中的移植性41中。因此, 该模型提供了一个很好的例子, 以评估交流肿瘤靶向两个肿瘤, 代表可预见的病人肿瘤异质性。
- 在含有≥ 4 (点头/免疫缺陷) 小鼠的组中, 向尾静脉注入20-30 微克 (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS、 64Cu-A14-NLS 和64Cu-A14。
- 在同一天放置一个圆柱形幻影 (24.8 毫升), 其中包含 5 MBq 的64铜, 将每秒的放射性计数转换为每克组织的注射剂量 (%ID/克)。
- 等待48小时, 然后麻醉老鼠放置在一个感应腔内, 1.5 升/分钟的氧流与2% 异氟醚。在植入 PET 扫描仪前, 将无菌眼膏应用于鼠眼。
- 将鼠标迅速转移到一个宠物扫描仪表中的头俯卧位置与鼻锥的异氟醚。定位呼吸和直肠探头, 并监测温度和呼吸率, 以确保在实验中保持生理条件, 如前所述的44。
- 使用常规采样模式设置和 250-650 凯文的能量窗口开始获取 PET 数据。通常, 每只鼠标45分钟的静态扫描足以为高质量的 PET 图像的重建和生产提供足够的重合事件。
- 在64铜交流扫描之后, 从扫描仪中取出鼠标并将其放回笼子中。允许鼠标在返回动物设施之前充分恢复。
- 利用三维最大似然期望最大化算法的20次迭代获得重建图像。
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使用酰胺软件对肿瘤和视觉上应评的器官进行兴趣区 (ROI) 分析。
- 绘制 ROIs 获取定量%ID/g 数据手动使用3D 手绘工具设置, 并仔细描绘肿瘤或相邻大腿肌肉。ROI 中每个像素的计数将从上一步骤4.2 转换为%ID/g。
- 比较64Cu-A14、 64Cu-A14-ChAcNLS、 64Cu-A14-NLS 图像以进行肿瘤对比, 以及定量 ROI%ID/g 和肿瘤到背景比率。
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Representative Results
在程序1中, 用磺当局作为交联剂 ChAcNLS 改性7G3 的结构是非常可靠的。通常, 当加载到12% 凝胶和分析的 SDS 页, 这导致可区分逐步增加兆瓦比例增加 sulfo-SMCC-to-7G3 比率使用, 并允许重和轻链单独评估 ChAcNLS共轭 (图 3)。7G3 反应在 10, 20, 25 和50到 1 sulfo-SMCC-to-7G3 比率跟随射频测量和兆瓦推断结果在 3, 7, 10 和 20 ChAcNLS 分子每7G3。通过密度测定, 7G3 3-10 ChAcNLS, 单体的百分比为 > 90%。对于 7G3 ChAcNLS20 , 聚合种为45%。这表明, SDS 页面是简单而有效的选择 7G3 ChAcNLS 共轭, 以进一步发展。虽然, 轻微涂抹与抗体链可能发生的抗体糖基化这并不影响到总物种的鉴定。
在过程2中, 代表性数据表明, 在评价病毒衍生的肽修饰 ACs 对细胞内效率积累时, 使用胰蛋白酶和无胰蛋白酶之间存在差异。在这个例子中, 7G3 ChAcNLS 增加细胞内积累的能力可以在用和不带胰蛋白酶治疗的细胞中进行评估 (图 4)。然而, trypsinization 的重要性在解释用于比较的共轭物的积累时是明显的, 以确定交流效率和选择性。Trypsinization 允许基线细胞内荧光水平的建立, 观察与未修改的7G3。可以详细说明, 7G3 仅限于小病灶中的细胞质。与此相反, 不 trypsinized 的细胞, 由于细胞表面的 IL-3Rα过度表达, 7G3 特异荧光仅限于细胞表面。由于细胞表面的荧光占主导地位, 从而阻止了胞内荧光的可视化, 因此很难对胞内聚集和分布进行研究。Trypsinizing 细胞也很重要, 当评估特异性作为证据与 IgG-ChAcNLS。我们可以看到, 细胞表面有一些非特异的荧光, 但如果细胞不 trypsinized, 就无法确定肽引起的胞内积聚水平。最后, 如果没有 trypsinization, 你可能会错误地解释新开发的 AC 不会积聚在目标细胞内。正如 7G3-NLS 所看到的, 不 trypsinized 大多数荧光的细胞再次来自细胞表面。在 trypsinization 之后, 人们可以观察到, 7G3 在目标细胞内积累, 尽管有限。
对于过程 3, 代表数据显示了对同位素64Cu 与 A14-ChAcNLS 的构造、亲和性和体外有效载荷传递效率和特异性的质量控制。对从含有64Cu-A14、 64Cu-A14-NLS 或64Cu-A14-ChAcNLS 的12% 聚丙烯酰胺凝胶中拍摄的射线图像进行的密度测量表明核素共轭物为100% 个单体种类 (图 5A)。64Cu-A14-ChAcNLS 显示 nanomolar 亲和 IL-5Rα。A14-ChAcNLS 作为增加64Cu-A14-ChAcNLS 浓度的函数, 揭示了在 HT-1376 和 HT-B9 单元格中的浓度为 3-5 nM 的特定绑定接近饱和度 (图 5B)。在 HT-1376 和 HT-B9 细胞上的64Cu-A14-ChAcNLS 的 Kd 分别为 6.4 1.7 nm 和 3.1 # 0.8 nm。ChAcNLS 共轭降低了 A14 约2.5 倍的亲和性, IL-5Rα HT-1376 和 HT-B9 细胞。伽玛计数表明, 在细胞核和细胞质中, 由64Cu-A14-ChAcNLS 提供的放射性增加是特定的, 随着时间推移 (图 6) 增加。伽玛计数通常显示大约 > 6 倍增加的细胞核和胞内积累的细胞在处理64Cu-A14-ChAcNLS 相比, 治疗与64Cu-A14-ChAcNLS 在存在过剩未修改的 A14 或在4摄氏度时进行治疗研究 (图 6A)。在测试的所有时间点 (图 6B) 中, 64Cu 相对于使用64Cu-A14 和64Cu-IgG-ChAcNLS 处理的细胞, 其核和胞内积累的增长率也有≥3倍。
图 7演示了单元分馏协议的重要性。HT-1376 和 HT-B9 细胞以1%、2% 或 4% NP-40 的等离子膜裂解缓冲液孵化。孤立的细胞核应该完全包含 Lamin, 因此细胞质分数应该是专属的 Rab7。作为一个控制, 整个细胞裂解与马国贤缓冲应该是积极的 Lamin 的两个分数。该协议表明, 在评估裂解 HT-1376 细胞的核分数时, 没有 Rab7 存在。此外, 细胞质分数中没有 Lamin。然而, 从细胞裂解与 4% NP-40 (图 7A) 中取出的胞浆中的 Rab7 量减少了。这很可能意味着, 4% NP-40 裂解缓冲膜除了在等离子膜上还会破坏细胞核。这就导致了核蛋白与细胞质蛋白的混合, 从而稀释了7的浓度。这就解释了7目前的减少量。HT-B9 细胞比 HT-1376 细胞更敏感。当用含有 4% NP-40 的等离子膜裂解缓冲液处理时, Lamin 在胞浆分数 (图 7B) 中明显可见。核分数中 Lamin 的量也相应减少。HT-B9 细胞在 2% NP-40 裂解缓冲液中也敏感, 因为胞质分数中 Rab7 的数量明显减少, 相对于 1% NP-40。因此, 一个人应该优化细胞分馏与特定的细胞利益, 以便定量结果的有效载荷积累在细胞核和细胞内空间是准确的。这对于评价新型交流的核定位效率具有重要意义。
对于过程 4, 在64Cu-A14、 64Cu-A14-NLS 或64Cu-A14-ChAcNLS 的小鼠上注射48小时后的 PET 成像, 在相对后腿上的 HT-1376 和 HT-B9 异位移植允许肿瘤的可视化。目标属性 (图 8)。正如我们的示例中所示, 对 PET 图像的目视检查显示了64Cu-A14-ChAcNLS、 64Cu-A14 和64Cu-A14-NLS (图 8A) 的 HT-1376 和 HT-B9 肿瘤目标功能。然而, 在视力检查与 HT-B9 肿瘤困难的情况下, ROI 分析可用于确定肿瘤与肌肉的比值 (图 8B)。
图 1: ChAcNLS 修改的抗体.SV-40 大 T 抗原 (KKKRKV) 的 NLS 残留物被夹在由 n-端半胱氨酸覆盖的间隔残留物之间。胆酸 (绿色支架) 与先前描述的34的半胱氨酸耦合。在 ChAcNLS 的构建和纯化后, 半胱氨酸巯基通过磺-当局 (红括号) 进行共轭; 显示已附着于单克隆抗体)。注: 单克隆 (150 kDa) 和 ChAcNLS (1.8 kDa) 不进行缩放。经皮卡特、m.、IL-5Rαspecific 抗体的改良和转载, 可改善膀胱癌模型的细胞积累和体内肿瘤靶向性。Bioconjugate 化学.bioconjchem: 10.102/acs. 8b00077。(2018)。
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图 2:交流细胞处理方法和后续处理的示意图, 共聚焦显微镜分析和细胞分馏质量分析.红色箭头对应于基本步骤2.2、2.3、3.15 和3.15.4。改编和转载的许可, Beaudoin, ChAcNLS, 一个新的修改抗体结合允许靶细胞特异的细胞膜逃逸, 定位到细胞核, 并加强全胞内积累。分子药剂学.13 (6), 1915-1926, molpharmaceut: 10.1021/acs. 6b00075 (2016)。
图 3: 分析 ChAcNLS 修改的抗体.一个减少的 SDS 页显示的运行梯 (L) 与相应的分子量在 kilodalton (kDa) 和未修改的7G3 重和轻链作为参考。以下车道是重和轻的链子的迁移带从7G3 修改了与 3, 7, 10 和 20 ChAcNLS。
图 4: 对单克隆细胞内分布和累积的分析.共焦显微图像, 说明了7G3、7G3 ChAcNLS、igg 和 igg ChAcNLS 治疗 IL-3Rα-positive 白血病细胞胞内7G3 分布和相对荧光积累。细胞在固定前 trypsinized 或不 trypsinized。细胞核染色的碘碘化物 (PI; 红色), anti-murine-Fc-AF647 染料 (单克隆; 绿色), 和 PI/单克隆合并。刻度为50微米。在胰蛋白酶和无胰蛋白酶组内, 在所示的不同 ACs 之间获得了相同的仪器设置的图像。图4的胰蛋白酶部分是从 refefence 34的权限中进行调整的。经 Beaudoin、S. et等人的许可, 改编并转载。ChAcNLS, 一种新的抗体共轭修饰, 允许靶细胞特异的细胞膜逃逸, 定位到细胞核, 并增强细胞的全胞内积累。分子药剂学.13 (6), 1915-1926, molpharmaceut: 10.1021/acs. 6b00075 (2016)。
图 5: 64Cu-A14-ChAcNLS 纯度和亲和力。() 64铜标记的 A14、A14-NLS、A14-ChAcNLS 的放射化学纯度由 SDS 页检查, 后跟显影。(B) 在 HT-1376 和 HT-B9 单元格上64Cu-A14 和64Cu-A14-ChAcNLS 的特定绑定曲线。误差线表示在复制中执行的实验的标准偏差。经皮卡特、m. et al的许可改编并转载。IL-5Rα-specific 抗体对膀胱癌模型的细胞积累和体外肿瘤靶向性有改善。Bioconjugate 化学.bioconjchem: 10.102/acs. 8b00077。(2018)。
图 6: 64铜核和胞内积累。三进制单元格处理的典型示例 (误差线表示标准偏差) 以证明 () 特异性和 (B) 64Cu-A14-ChAcNLS 的累积增强。在 IL-5Rα-positive 浸润性膀胱癌细胞的治疗过程中, 细胞核 (左面板) 和全细胞内空间 (右面板) 的累积百分比呈比例。误差线表示在复制中执行的实验的标准偏差。* 指示p ≤0.05。
图 7: 单元格分馏过程分析.(A) 核和 (B) 胞浆分数为 Lamin A/C (顶部斑点; 红色箭头) 和 7 (底污点; 黑色箭头) 的印迹 (含1%、2% 或4的等离子膜裂解缓冲液中的 HT-1376 和 HT-B9 细胞)% NP-40。以马国贤缓冲器为 Lamin 的全细胞裂解和 Rab7 均为阳性对照。运行标准 (L) 只在上面的污点中描述。三箭头显示 Lamin, 因为它的多个亚型。经皮卡特、m. et等的许可改编和转载。IL-5Rα-specific 抗体对膀胱癌模型的细胞积累和体外肿瘤靶向性有改善。Bioconjugate 化学.bioconjchem: 10.102/acs. 8b00077。(2018)。
图 8:体内通过 PET 成像和 ROI 分析对肿瘤靶向分析。() 在48小时后注射的 HT-1376 (红色箭头) 和 HT-B9 (蓝箭) 肿瘤静脉注射有 64Cu-A14、 64Cu-A14-NLS 和64Cu-A14-ChAcNLS 的小鼠的 PET 图像。绿箭是肝脏摄取。用洋红色圆圈显示的肌肉 ROI 图。(B) ROI HT-1376 和 HT-B9 在注射后48小时内 ACs 的肿瘤-肌肉比值。误差条表示实验的标准偏差为每只鼠标 10 ROIs (n = 5)。* 指示p 0.05。
| 李永达 |
| CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20 |
| CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30 |
| CGISYGRKKRRQRRR 29 |
| GRKKRRQRRRPPQGYC 2225 |
| TRQARRNRRRRWRERQRGC 26 |
| nls |
| CGYGPKKKRKVGG 21232427 |
| 胆酸-CGYGPKKKRKVGG 34 |
表 1: 交流修饰用的 SV-40 和大 T 抗原衍生肽的列表。
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Discussion
系统地提供抗癌药物的主要目标是增加肿瘤部位的积聚, 并在癌细胞中吸收, 并减少健康组织中有害的副作用。交流靶向肿瘤细胞提供分子有效载荷是一种非常有前景的治疗和检测肿瘤的方法。然而, endosome 和下游溶酶体退化所引起的疗效仍然是一个重要的挑战。虽然该协议利用 ChAcNLS 肽作为下一代 ACs 的一个例子, 但所描述的程序可以适应任何被开发的多肽修饰交流, 目的是增加细胞内交付的负载量。靶向肿瘤细胞。
该协议最关键的步骤是: 1) 识别和限制高 MW 集料种类;2) 细胞胞内积累的分析前的 trypsinization;3) 执行细胞分馏程序的质量保证;和 4) 进行 PET 成像评估肿瘤靶向在体内。
重要的是, 病毒衍生肽与抗体的结合不会导致高 MW 集料物种, 这很可能是由抗体间内交联引起的。这是最初的关切, 应在进一步取得进展之前加以处理。使用含有不需要的聚合体的肽修饰 ACs 向前迈进, 可能会给出在诸如胞内和体内负载传递配置文件等方面提供虚假证据的结果。抗体上的反应性 maleimides 是最有可能对共价聚合负责的。一个解决方案是减少磺-当局与单克隆的比值。另一种选择是使用氨基酸的 n-乙酰衍生物, 如胱氨酸, 赖氨酸, 他的, 爵士, 和在肽共轭的 maleimide 激活的单克隆抗体45。亲核侧链能够与当局的 maleimide 基团发生反应, 减少抗体的交联。或者, 结合后的大小排除色谱分离可以用来隔离单体物种45。对抗体的多肽的特定部位的共轭也可以进行。例如, 抗体碳水化合物可以修改为共轭肽, 这表明有效地生产单体物种24。
SDS 页与12% 聚丙烯酰胺凝胶是一种廉价和有效的方法, 以获得广泛的视角, 大尺寸差异的交流品种。如果使用聚丙烯酰胺的百分比增加, 重链和内分子的分离将很难区分。反之, 如果使用减少的% 聚丙烯酰胺, 光链可能会运行的凝胶。含4-20% 聚丙烯酰胺的梯度凝胶还能为单个凝胶上的重光链提供良好的保留转移。在可供生物分子分析的各种分析技术中, 高效液相色谱和毛细管电泳-sds 优于 sds 页, 用于分离和表征 ACs 46。然而, SDS 页面是一个早期和廉价的方法来分析这些新的代理最初的建设, 然后决定以下的行动过程。
在含有0.25% 胰蛋白酶 (步骤 2.3) 的溶液中, 细胞的孵化是很重要的, 因为它可以改善可视性, 并在细胞内积累的相对增加参考抗体。摄像机参数设置为以最大荧光强度捕捉图像。这是因为在累积的 AC 量中, 从细胞到细胞的变化。因此, 以最大强度捕获图像, 可以对交流积累较少的单元进行评估。然而, 癌症抗原通常是高度表达的肿瘤细胞。如果细胞不被胰蛋白酶消化, 那么从 ACs 在细胞表面产生的荧光就会主宰图像。此外, 没有 trypsinization 的发展可以限制与 ACs 具有微妙但显著的胞内积累性质。
确保高质量的细胞分馏对于准确评价细胞核中的64铜与细胞质的积累非常重要。ChAcNLS 的能力增加交流和有效载荷胞内积累是由于主动定位到核34。随着未来的病毒肽的发展, 这些肽也可能定位到细胞核作为其机制的一部分, 以提高细胞内的有效载荷效率。因此, 重要的是, 细胞分馏是高质量的, 准确地详细说明这个过程。本议定书强调了评价细胞质标记核的重要性, 以及核标记的胞质分数。例如, 胡et, 开发了用 a 型肽修饰的 AC, 并探讨了放射性同位素有效载荷24的核积累。在核分数中存在着丰富的细胞质蛋白钙蛋白酶的印迹分析。这很可能是因为使用了商用核隔离套件。该协议表明, HT-1376 和 HT-B9 细胞需要不同浓度的 NP-40, 以分离富集细胞核与完整的膜。当 HT-B9 细胞与含有 4% NP-40 的缓冲液裂解时, Lamin 的胞质分数中存在一/c, 表明治疗破坏了核膜, 并允许 Lamin A/c 进入细胞质。如果核和细胞质分数不被仔细隔离, 就很难确定核定位对全胞内积累的贡献。有报告说, 生物和人工衍生的多肽, 专门针对其他细胞内腔, 如内质网, 高尔基仪器, 和线粒体47,48,49。因此, 细胞内隔间的隔离变得越来越重要。
该协议完成了对64Cu-A14-ChAcNLS 靶向 HT-1376 和 HT-B9 肿瘤的描述。从对图 8中的 pet 图像的目视检查中可以看出, 相对于相邻缩小的周围背景64Cu-A14-ChAcNLS 的肿瘤 pet 信号的增加明显优于 HT-1376 和 HT-B9 肿瘤 (图8A).ROI 分析还证明了它对肿瘤靶向性的评价能力。在我们的例子中, 我们使用 ROI 肿瘤-肌肉比值来量化肿瘤靶向, 并演示64Cu-A14-ChAcNLS 是高级 AC (图 8B)。PET 成像也可以评估健康器官中的交流隔离。肝脏是代谢抗体的主要器官。图 8A显示在肝脏中的摄取量可与64Cu-A14-ChAcNLS 和64Cu-A14 注射的小鼠相比。在这个早期的发展阶段, 这些数据表明 ChAcNLS 不会造成不必要的隔离。64Cu 的半衰期为12.7 小时, 这对于 ACs 来说并不理想, 因为它有几天的半衰期。正如 Zeglis 和刘易斯在视觉协议中所描述的那样, 使用寿命长的放射性同位素 zirconium-89 (89锆) 是一种有效载荷, 其物理半衰期非常适合抗体, 可以通过 PET 50进行成像。因此, 为评估肿瘤分娩数天, 89锆是首选选择。这是特别重要的, 如果治疗是一个目标, 高肿瘤摄取是有利的, 随着时间的推移增加抗体7。体内还应执行, 以确定个别器官吸收, 以进一步探索靶向或螯合性质的新开发的 ACs。此外, 小鼠可以 predosed 与未修改的特异抗体阻断肿瘤细胞受体部位, 以评估靶向特异性。尽管如此, 64Cu 与 PET 成像和 ROI 分析充分提供了对本议定书所提出的已开发 ACs 的肿瘤传递特性的初步评估。
迄今为止, 由病毒衍生肽修饰的 ACs 被限制在放射性同位素的运送上。这部分是由于历史原因, 也因为放射性同位素在体外和体内测试中很容易量化, 并且可以使用无创全身成像方式进行可视化。自然, 由于这一领域扩展到除放射性同位素以外的有效载荷的运输和交付, 如化疗、酶和寡核苷酸, 必须对本议定书所述技术进行修改。例如, 必须开发新的方法来评估替代有效载荷的胞内积累。此外, 对体内评估的修改将是必要的, 因为这些有效载荷不能轻易成像, 因此很难评估体内、特异性和肿瘤摄取效率。由于这些原因, 放射性核素有效载荷应继续作为替代性货物未来发展的替代有效载荷。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
这项工作由癌症研究协会 (加拿大) 和 CIMS 资助。作者感谢 Samia 博士 Mohand 和吉恩-弗朗索瓦 Beaudoin 的帮助。天使洛佩兹博士 (南澳大利亚大学) 为单克隆 A14。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
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