Summary
Viral-afledte peptider koblet til antistof-konjugater (ACs) er en tilgang vinder momentum på grund af potentialet for at levere molekylære nyttelast med øget tumor celle ophobning. Ved hjælp af fælles metoder til at vurdere peptid konjugering, AC og nyttelast intracellulære ophobning og tumor målretning, hjælper denne protokol forskere i de vigtige indledende udviklingsfaser.
Abstract
Antistof-konjugater (ACs) modificeret med virus-afledte peptider er en potentielt stærk klasse af tumor celle levering agenter for Molekylær nyttelast bruges i kræftbehandling og imaging på grund af øget cellulær ophobning over nuværende ACs. Under tidlig AC in vitro- er udvikling, fluorescens teknikker og radioimmunoassays tilstrækkelig for bestemmelse af intracellulære lokalisering, ophobning effektivitet og målet celle specificitet. I øjeblikket er der ikke enighed om standardiserede metoder for at forberede celler til evaluering af AC intracellulære ophobning og lokalisering. Den indledende testning af ACs modificeret med virus-afledte peptider er kritisk, især hvis flere kandidater har været konstrueret. Bestemmelse af intracellulære ophobning af fluorescens kan blive påvirket af baggrunden signal fra ACs på celleoverfladen og komplicere fortolkningen af ophobning. For radioimmunoassays, typisk behandlede celler er fraktioneret og radioaktivitet i forskellige celle rum målt. Men celle lysis varierer fra celle til celle og ofte nukleare og cytoplasmatisk rum er ikke tilstrækkeligt isoleret. Dette kan give vildledende oplysninger om nyttelast levering egenskaber. Intravenøs injektion af radiolabeled virus-afledte peptid-modificerede ACs i tumor forsynet med mus efterfulgt af radionuklid imaging er en kraftfuld metode til bestemmelse af tumor målretning og nyttelast levering egenskaber på i vivo fase af udvikling. Men dette er en forholdsvis ny fremgang og nogle grupper har evalueret virus-afledte peptid-modificerede ACs på denne måde. Vi beskriver behandlingen af behandlede celler mere præcist vurdere virus-afledte peptid-modificerede AC ophobning, når du bruger Konfokal mikroskopi og radioimmunoassays. Specifikt, bundet en metode til trypsinizing celler til at fjerne celleoverfladen ACs. Vi tilbyder også en metode til forbedring af cellulære fraktionering. Endelig giver denne protokol en i vivo metode ved hjælp af positron emissions tomografi (PET) for at vurdere oprindelige tumor målretning egenskaber i tumor-bærende mus. Vi bruger radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) som et eksempel nyttelast i denne protokol.
Introduction
Antistof-konjugater (ACs) er biopharmaceuticals, der modning i en transformativ klasse af effektive lægemidler til at forbedre kræftbehandling og til påvisning af tumorer. Består af et monoklonalt antistof (mAb) konjugeret til molekylære nyttelast som radioisotoper, små molekyler og biologiske toksiner, ACs er i stand til at levere disse payloads til kræftceller med udsøgte mål antigen affinitet og specificitet. Dermed ACs har potentiale til at reducere uspecifik toksicitet og øge nyttelasten aktivitet på webstedet tumor. Terapeutisk, er ACs transport af cytotoksiske små molekyler (ofte refereret til som antistof-drug konjugater) blevet godkendt til behandling af patienter med brystkræft og Hodgkins lymfom, som ikke har konventionelle behandlinger 1, 2. Derudover ACs transport af radioaktive isotoper (ofte kaldet radioimmunoconjugates) er også under udvikling. En AC transporterer en radioisotop for billedbehandling er godkendt til at identificere prostata kræft metastaser 3. Med mange mere terapeutisk ACs forelægges til godkendelse 4, er optimisme høj for fremtiden i ACs at forbedre kræft pleje 5.
Ikke desto mindre, når levere kemoterapeutika eller radioisotoper, ACs har svært ved effektivt akkumulere disse nyttelast inde i target-cellerne. Dette aspekt bidrager betydeligt i mange tilfælde i den manglende evne til i ACs at give langvarig sygdomsfri overlevelse eller høj kontrast tumor imaging 6,7. I almindelighed, når ACs binde deres mål antigener er de internaliseres gennem en proces kendt som receptor-medieret endocytose. ACs er derefter fanget inde i endosomes og smugles til lysosomer for nedbrydning og nyttelast frigive 8. Den intracellulære menneskehandel proces giver udfordringer for ACs opnår høje nyttelast specificitet og effekten mod målrette kræftceller. For eksempel, mange antigener såsom Her2 (mål for terapeutisk AC Trastuzumab-emtansine) kan genbruge op til 85% af bundne antistoffer i de første 30 min. 9. Desuden, når nedbrydning sker, frigivne kemoterapeutika og radioisotoper kan aktivt eksporteres af øget udtryk og/eller aktivitet af membran forbundet transport proteiner 10,11. Lysosomet nedbrydning også hindrer levering af nye biologiske nyttelast som terapeutisk enzymer og oligonukleotider, der kan være deaktiveret 12,13. I det væsentlige, er kræftcellen meget effektive på om ophævelse af den nødvendige intracellulære ophobning af nyttelast leveret af ACs.
Denne protokol beskriver, hvordan du implementerer begrebet ACs-koblet til virus-afledte peptider, specielt til undslippe endosome fastklemning og lokalisering til cellekernen. Med sådanne raffinement at manipulere værtssystemer celle, er det ikke overraskende, at udviklingen af virus-afledte proteiner og peptider som potentielle biopharmaceuticals længe har været indgroet i terapeutisk forskning 14. Angiv værtsceller for millioner af år virus har udviklet sig til at erhverve en enestående samling af proteiner kan udnytte normale fysiologiske pattedyr celle systemer til effektivt. For vira, som er internaliseret via receptor-medieret endocytose, er de også udfordret med flygter handel til lysosomet hvor stormløb af en lokaliseret koncentration af proteaser kan være problematisk for overlevelse. En vel karakteriseret viral-afledte peptid udnyttes i medicinafgivelse for undslippe endosome fastklemning er human immundefekt virus transaktivatoren transskription (Tat) protein 15. Tat er stand til at undslippe endosome fastklemning af sensing lav-pH på hvilket tidspunkt sker protein konformationelle ændringer aktivering Tat for at indsætte sig selv ind og forstyrre endosomal membran 16. Dette resulterer i Tat-nyttelast konjugater kan få adgang til cytoplasma. Den anden viral manipulation element, der vedrører denne protokol er den fremgangsmåde, der anvendes til at levere terapeutiske gener og narkotika til kernen 17. Virus har udviklet sig til at kunne manipulere vært celle maskiner til går forbi Kernemembranen ved at passere gennem den nukleare pore komplekse (NPC). Cellulære makromolekyler indeholder (eller binder sig til proteiner, der indeholder) nukleare lokalisering signaler (NLSs) nødvendige for bindende til nukleare transport proteiner (f.eks. karyopherins α og β), som giver de nødvendige bevægelser gennem NPC. Virus har udviklet proteiner til at indeholde NLS-sekvenser, der giver dem mulighed for at udnytte vært celle transport proteiner for shuttling i nucleus 18.
Talrige ACs har tidligere været functionalized med Tat - og NLS-afledte peptider og testet for deres evne til at ophobes inde i kræftcellerne og for målretning tumorer 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabel 1). Undersøgelser levere cytotoksiske nyttelast viste, at ACs modificeret med virus-afledte peptider er stand til at øge cellulære ophobning, cytotoksicitet og tumor dræbe over umodificeret ACs 22,26. Et fælles træk for denne roman klasse af AC er deres konstruktion. Typisk, peptider indeholde en terminal cystein giver en gratis sulfhydryl gruppe. MAbs er først reagerede med en noncleavable bifunctional crosslinker som indeholder N- hydroxysuccinimide (NHS) og maleimide grupper i modsatte ender. NHS estere reagere med primære aminer på mAb at danne akrylamid obligationer. Den monomers mAb med gratis maleimide grupper er derefter reagerede med sulfhydryl grupper på peptider til at danne et thioester bånd og dermed forbinder peptid og mAb. Selv om homobifunctional overfladebehandlingsvæsker har været brugt 28, heterobifunctional crosslinker er mere almindeligt anvendt i opbygningen af virus-afledte peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Denne protokol bruger specifikt crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-carboxylat (sulfo-Investeringsfondene) for sin brugervenlighed og fordi det er brugt i den godkendte antistof-drug konjugat Trastuzumab-emtansine og i mange virus-afledte peptid-ACs 8,22,23,26,31,32. Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) er den primære metode for i første omgang konstatering konjugation effektivitet og semi-kvantificere antallet af peptider pr. mAb. Konfokal mikroskopi ved hjælp af en fluorescently mærket sekundær antistof specifikke til mAb er typisk metode til i første omgang evaluering af intracellulær distribution egenskaber af virus-afledte peptid-modificerede ACs. Hidtil er radioisotoper de primære nyttelast leveret af virus-afledte peptid-modificerede ACs. Radioisotoper er fordelagtig, fordi radioaktivitet i celler er nemt kvantificeres ved gamma optælling. Derudover ACs, der er oversat til musemodeller af menneskelige kræftformer giver forskere mulighed for at evaluere tumor målretning ved hjælp af molekylær billeddannelse modaliteter som single photon emission beregnet tomografi og positron emission tomografi (PET) 23 , 32 , 33. I almindelighed, konstruktion og validering af testmetoder primært bruges af forskere giver en meget god vurdering af ACs modificeret med virus-afledte peptider stadiet indledende udvikling effektivt at komme ind og levere den nyttelast inde målcellerne og target tumorer.
TAT og NLS-modificerede ACs har belyst nøgleområder til yderligere forbedring af nyttelasten levering inden kræftceller og tumorer. Med hensyn til NLS-modificerede ACs, kan effektivitet i intracellulære ophobning være beskedne 23,31,34. Ineffektiv intracellulære ophobning er forårsaget af fortsatte endosomal entrapment. In vivo tumor målretning kan også blive formindsket med begge Tat og NLS-modificerede ACs. De aktive sekvenser af Tat og NLS indeholder flere positive ladede rester. Når knyttet til mAbs, kan den samlede kationiske afgift være betydeligt øgede 35. Som en konsekvens har af Tat og NLS-modificerede ACs øget optagelse i sundt væv og øget hurtige blod clearance.
Vores gruppe udviklet et komposit stof bestående af cholic syre knyttet til NLS (ChAcNLS; Figur 1). ChAcNLS-ændret ACs er stand til at øge intracellulære ophobning af leverede radioisotoper og forbedre tumor målretning i forhold til NLS-modificerede og traditionelle ACs 33,34. Mekanismen bag cholic syre er inspireret af udvalgte nonenveloped virus, der ikke kan stole på membran fusion at udnytte cholic syre til at udløse endosome flugt gennem dannelsen af ceramid evne. For eksempel, rekrutter svin enteriske virus cholic syre, der aktiverer sphingomyelinase, som katalyserer hydrolyse af sphingomyelin i ceramid 36,37,38. Dette destabiliserer endosomal membran og giver mulighed for virus undslippe. Således er cholic syre en anden virus-afledte komponent, der supplerer NLS.
Da feltet bevæger sig fremad og fremtidige forekommer fremskridt i nyttelast levering af ACs modificeret med virus-afledte peptider, det er et belejligt tidspunkt at give visuelle demonstrationer af deres biokemiske og funktionelle egenskaber under indledende udvikling. Her beskriver vi vores protokol for den oprindelige vurdering af virus-afledte peptid-modificerede ACs for effektive og enkle bestemmelse af intracellulære ophobning og tumor målretning i den tidlige fase udvikling. Vi bruger det kommercielt tilgængelige mAbs 7 g 3 og A14 som eksempel modelsystemer. Procedure 1 beskriver brugen af SDS-PAGE som en metode, der giver mulighed for ' go/no go' beslutninger for beregnede ACs. Procedure 2 beskriver en metode ved hjælp af trypsinization giver mulighed for bedre visualisering af AC intracellulære distribution og akkumulering. Procedure 3 beskriver en metode til forbedret intracellulære fraktionering til præcist bestemme nukleare lokalisering. I denne procedure vi udnytte nyttelast 64Cu (t1/2 = 12,7 h) fordi det er sårbare over for cellulære efflux og en positron emitter 10. Således er beskriver proceduren 4 i vivo tumor målretning karakterisering af PET imaging for at visualisere tumor optagelse i forhold til baggrund (dvs. nontarget sunde væv) og afgøre, om eksemplet med AC kan konkret og effektivt Target tumorer. Disse metoder er tilstrækkelig for efterforskerne udvikle ACs modificeret med virus-afledte peptider til at identificere kandidater til videre avancement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De i vivo dyreforsøg beskrevet blev udført efter en godkendt protokol og under de etiske retningslinjer for Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke etiske komité for animalsk eksperimenter.
1. antistof peptid konjugation
Bemærk: ChAcNLS kan syntetiseres ved enhver kommerciel peptid producent eller Universitet-tilknyttede peptid syntese serviceplatform. Syntesen af ChAcNLS kan findes i reference 34. For procedurer 1 og 2 bruger mAb 7 g 3, som er specifikke for leukæmi antigen IL-3Rα 39.
- I en 1,7 mL microcentrifuge tube, forberede en 10 mg/mL (~ 1 mg samlede antistof) løsning af 7 g 3 i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 7,6.
- Opløse sulfo-Investeringsfondene i dimethylsulfoxid (DMSO) ved en koncentration på 5-10 mM. Vortexing løsningen fungerer grundigt bedst for at opnå fuldstændig opløsning.
- Tilføje til de rør, der indeholder 7 g 3 opløst sulfo-Investeringsfondene løsning (typisk mellem 5-20 μL afhængigt af den molære forhold af sulfo-Investeringsfondene-til - 7 g 3 ønskes). Test sulfo-Investeringsfondene-til - 7 g 3 nøgletal 10-, 25-og 50-1 anbefales. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
-
Rense og koncentrere 7 g 3 maleimide-derivatized ved hjælp af en ultrafiltrering enhed og buffer udveksling i PBS, pH 7,0. Der centrifugeres ved 8.000 x g i ca 5 min. udsmid flow gennem og fyld med PBS, pH 7,0 og centrifugeres igen.
- Udføre det 7 - 8 gange helt udveksle bufferen. Genoprette den koncentrerede 7 g 3 protein ved at placere enheden filter op og ned i en ren microcentrifuge tube. Der centrifugeres i 2 min på 1.000 x g. gendannelsesdiskenheden bør være ca. 0,3 mL
- I rør indeholdende maleimide-aktiveret 7 g 3, tilføje 2-fold kindtand overskud af ChAcNLS i forhold til sulfo-Investeringsfondene-til - 7 g 3 forholdet anvendes i det forrige trin og inkuberes natten over ved 4 ° C. For eksempel, hvis en 10-1 sulfo-Investeringsfondene-til - 7 g 3 forholdet blev brugt, derefter bruge en 20-1 ChAcNLS-til - 7 g 3 forholdet. Samlede volumen bør ikke ændres væsentligt.
Bemærk: Selvom ChAcNLS ikke forårsager nedbør i løbet af konjugation processen dette er en mulighed, der kan opstå med andre peptider. Observere røret under reaktion for tegn af nedbør, som er mest sandsynligt forårsaget når peptider er hydrofobe. I disse tilfælde kan det være værd at revidere peptid af interesse for at designe ændringer at give øget hydrofiliciteten. - Koncentrere sig 7G 3-ChAcNLS bruger en ultrafiltrering enhed til ønskede koncentration og buffer exchange i PBS pH 7,4 (Se trin 1.4). Recovery udbyttet af total protein skal være ≥ 75% af den oprindelige råvare.
- Udføre SDS-PAGE for at vurdere de konstruerede 7G 3-ChAcNLS kandidater ved hjælp af en 12% polyacrylamid gel (giver tilstrækkelig adskillelse af ChAcNLS konjugeret tunge og lette kæder fra nonconjugated kæder). Mix 10 μg af 7G 3-ChAcNLS i side ladning buffer indeholdende 2 μl β-mercaptoethanol og indlæse i brønden.
- Sæt den korrekte spænding (120 V på 1 h for en 12% gel) og køre elektroforese. Stop elektroforese, når Coomassie farvning front når bunden af gelen.
Bemærk: Lad ikke Coomassie farvning foran køre off gel. - Fjern gel fra elektroforese apparater og skyl med affarvningsopløsning indeholdende 10% v/v iseddike og 20% v/v methanol.
- Tage et billede af gelen og med en lineal og måle afstanden (cm) overført for standarderne og 7 g 3 konjugater. Beregne værdien fastholdelse faktor (Rf), som er afstanden udvandrede opdelt af gel længde (fra hvor protein er lastet til Coomassie migration front). Plot molekylvægt (MW) i log mod Rf-værdier fra hver standard protein og ekstrapolere størrelsen af 7 g 3 konjugater.
- Beregne antallet af peptider pr. antistof ved at dividere forskellen i MW mellem 7 g 3 konjugater og uændrede 7 g 3 af 1768.5 g/mol (MW af ChAcNLS).
- Tage digitale billeder af Coomassie farvede gel og udføre densitometri analyse. På dette tidspunkt, kan udvalg af bly kandidat baseres på AC med det maksimale antal ChAcNLS molekyler, der ikke indeholder væsentlig samlede arter.
2. Konfokal mikroskopi for intracellulære ophobning evaluering
Bemærk: Det er vigtigt at teste celle-selektivitet intracellulære akkumulering af peptid-modificerede mAbs før udvikle formuleringer med en nyttelast på interesse. Fordi Tat har også vist sig at have en tilbøjelighed til uspecifikke celle penetration, er det værd at første analysere intracellulære ophobning og celle selektivitet inden virksomhed dyrt udvikling trin med dyre nyttelast. Derfor bør Procedure 1 også ændre isotype specifikke irrelevant kontrol mAbs. For resten af protokollen vil vi arbejde med ACs modificeret med 10 ChAcNLS molekyler per antistof. En skematisk, herunder vigtige skridt for procedurer 2 og 3 er beskrevet i figur 2.
Forsigtig: Dette trin i protokollen indebærer håndtering og manipulation af PARAFORMALDEHYD. Følg producentens anvisninger, når du håndterer.
- Behandle målceller TF-1a med 200 nM af 7G 3-ChAcNLS herunder modificerede kontrol mAbs. Inkuber 5 x 106 antigen-positive celler med konjugater i 1 timer ved 37 ° C.
- Efter 1 time, Fjern supernatanten og vask med 1 mL 3 x i iskold PBS. Tilføje friske medier og inkuberes i en ekstra time ved 37 ° C.
-
Efter den ekstra time, Fjern supernatanten og vask 3 x i 1 mL iskold PBS. Tilføje 0,5 mL PBS, som indeholder 0,25% trypsin og ethylendiamintetra syre (EDTA) ved 37 ° C i 3 op til 30 min.
Bemærk: Under første pilot test det anbefales at ikke trypsinize celler med henblik på at bestemme forskellene i AC intracellulære ophobning. Denne protokol fremmer brugen af trypsin og vi demonstrere, hvordan dette forbedrer evaluering af intracellulær ophobning effektiviteten af forskellige AC kandidater.- Test på forskellige tidspunkter for inkubation ved besigtigelse for alle celler er frakoblet. Derudover Inkuber celle delprøver med levedygtighed farvning løsninger og udføre analyse af handelsstrømmen cytometric som tidligere beskrevet 40.
- Neutralisere trypsin med 1,5 mL cellekultur RPMI 1640 media/10% føtal bovint serum. Centrifugeres celler på 500 x g i 5 min og Fjern supernatanten vask 3 x i 0,5 mL iskold PBS.
- Fix celler i 0,5 mL PBS, som indeholder 1% PARAFORMALDEHYD og 1% saccharose på isen for 30 min. vask celler 3 x i 0,5 mL iskold PBS og centrifugeres ved 250 x g i 5 min. Permeabilize celler i 0,5 mL PBS, som indeholder 0,15% Triton X-100 i 5 min på is. Vaske cellerne i iskold PBS og Gentag centrifugering.
-
Suspendere celler i 0,1 mL PBS, som indeholder 2 μg/mL (eller fabrikanten anbefalede koncentration) af en anti-murine (isotype specifikke) Fc sekundære polyklonale antistof konjugeret med AlexaFluor 647 i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
- Der centrifugeres ved 250 x g i 5 min og vask celler 3 x i 0,5 mL iskold PBS. Suspendere celler i 0,5 mL PBS.
PAUSE: Celler kan gemmes i køleskabet.
Bemærk: Det er vigtigt at vælge en sekundær antistof, der anerkender den korrekte isotype af mAb af interesse. AF647 er valgt på grund af sine langt infrarød emission, som ikke forstyrrer propidium Iodid (PI) farvning af kernen.
- Der centrifugeres ved 250 x g i 5 min og vask celler 3 x i 0,5 mL iskold PBS. Suspendere celler i 0,5 mL PBS.
- Tilføje PI til en koncentration på 10 μg/mL, container med celler. Næste, montere 1 x 105 celler på glas dias ved hjælp af montering medier og dække med et glas coverslip.
- Undersøge celler med en planlægge Apo 60 X oliebestandighedsobjektet NA 1.42 på en inverteret laser scanning Konfokal mikroskop. Opdage PI fluorescens bruger 488 nm argon laser og den spektrale scanning prisme til 600-650 nm. AF647 bruge fluorescens 633 nm helium-neon laser og den spektrale scanning prisme til 650-700 nm. Indsamle fluorescens emission fra PI og AF647 sekventielt.
Bemærk: Brug den samme indstilling hele evaluering og sammenligning af celler. Dog vil du nødt til at justere indstillingerne for trypsinized celler i forhold til ikke-trypsinized celler. - Bruge mikroskop til at erhverve billeder. Indsamle billeder ved hjælp af seriel vandrette optiske dele af 1.024 x 1.024 pixel med 2 X line gennemsnit taget med 0,5 μm mellemrum gennem hele cellen tykkelse. Præsentere billederne som stablede z-fremskrivninger fra fire på hinanden følgende skiver på den maksimale fluorescens intensitet.
- Analysere celler med mikroskop software. Optage den cellulære fordeling mønster af konjugater. Specifikt, vurdere om intracellulære fluorescens i cytoplasma er grupperet og nær celle overflade eller diffuse og homogen. Også evaluere relative fluorescens intensitet pr. celle.
3. radiolabeled AC konstruktion og cellulære fraktionering for evaluering af 64 Cu intracellulære levering effektivitet
Forsigtig: Procedurer 3 og 4 indebærer håndtering og manipulation af radioaktivitet. Før du udfører disse trin, skulle forskere have godkendt sikkerhedsuddannelse og protokoller godkendes fra deres hjem-institution stråling sikkerhedsmyndigheden.
Bemærk: For procedurer 3 og 4 vi bruge mAb A14, der er specifikke for invasive blære cancer antigen IL-5Rα41. Også, alle eksperimenter er tid følsomme på grund af den korte half-life af 64Cu. Generelt er det bedst ikke vente sidste 1 uge til at udføre in vitro- eksperimenter og ikke længere end 72 h for i vivo undersøgelser.
- En 1,7 mL tube suspendere 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic syre (NOTA-NHS) i DMSO til en koncentration på 10 mM.
- Reagere 50-fold kindtand overskud af NOTA-NHS med A14 (2 mg starter materiale) i 0,1 M natriumbikarbonat ved pH 8,6 i 1 time ved stuetemperatur i en volumen ≤ 0,5 mL (endelige NOTA-NHS volumen ikke bør overstige 2% v/v i samlede volumen).
- Rense og buffer-exchange NOTA-A14 bruger en ultrafiltrering enhed i PBS, pH 7,6 (Se trin 1.4).
- Efterfølgende udlæg i ChAcNLS, skal du følge trin 1,2-1,6.
- Reagere NOTA-A14-ChAcNLS (250 μg partier) med 100 megabecquerel (MBq) 64CuCl2 i 0,1 M natriumbikarbonat, pH 5,5 i 1 timer ved 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu er produceret på TR-PET cyclotron på CIMS 42.
- Koncentrere 64Cu-A14-ChAcNLS i PBS pH 7,4 bruger en ultrafiltrering enhed til den ønskede koncentration (Se trin 1.4).
-
Afgøre radiolabeling effektivitet af 64Cu-A14-ChAcNLS af instant tyndtlagskromatografi (ITLC) ved hjælp af kromatografi strimler og 0,1 M, pH 5,5 natrium citrat (ITLC elueringsvæsken) som opløsningsmiddel. Anvende 0,5 μL alikvot af reaktion løsning til ITLC strip. Udføre en autoradiograph af the strip og få et digitalt billede.
- Udføre densitometri for at opnå andelen af bundet og gratis 64Cu. Hvis gratis 64Cu indhold > 5%, vende tilbage til forrige trin og udføre yderligere rensning.
- Derudover udføre SDS-PAGE med Coomassie farvning for at evaluere sammenlægninger. Udføre en anden SDS-PAGE efterfulgt af en autoradiograph af gel for at afgøre, om der er radiolabeled samlede arter.
-
Affinitet bindende kvalitet check point: Inkuber 64Cu-A14 konjugater på stigende koncentrationer (0-100 nM) i to eksemplarer med 1 x 106 målceller pr. mL. At estimere uspecifik bindende, bland dobbelte prøver af 64Cu-A14 konjugater med celler i overværelse af 100-fold kindtand overskud af umærket A14.
- Efter 1 h inkubation på is, vaske cellerne og tælle samlede bundne antistof prøver og samlede uspecifik bundne antistof prøver i en gamma-counter. Graf specifikke bindende (samlede bundne antistof - uspecifikke bundet antistof) mod reaktive frie 64Cu-A14 (nM) anvendes i analysen. Bestemme dissociationskonstant (Kd) af ikke-lineær regression bruger graftegning software.
- For 64Cu cellulære ophobning undersøgelser: behandling af celler med 100 nM 64Cu-mærket A14 konjugater for 1 time, 6 h, og 24 timer ved 37 ° C som tidligere beskrevet33. Omfatte yderligere parametre såsom behandling i umodificeret A14 at blokere IL-5Rα websteder og ved 4 ° C til at blokere receptor-medieret internalisering.
- Ved definerede punkter, som tidligere beskrevet i trin 2.3 - 2.3.2, tilsættes 0,5 mL PBS indeholdende 0,25% trypsin og EDTA ved 37 ° C efterfulgt af neutralisering og vask.
- Inkuber celler i plasma membran lysisbuffer indeholdende 1% NP-40, 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 buffer i isbad i 10 min. derefter centrifugeres plasma membran-mængden cellerne på 90 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og Anbring i frisk tube. Dette repræsenterer cytoplasmatisk brøkdel. Vaske kerner 3 x i iskold PBS og tilføje vasker den cytoplasmatisk brøkdel.
- Sikre hætteglas indeholdende de nukleare og cytoplasmatisk fraktioner er forseglet. Derefter placere dem i en gamma counter kalibreret for 64Cu for at konvertere raw tæller til MBq.
-
Bestemme kvaliteten af kerner isolation ved at udføre Western blot analyse for Lamin A/C, en begrænset nukleare protein og Rab7, en rigelig cytoplasmatiske protein på hele cellens lysate, nukleare og cytoplasmatisk fraktioner.
- Behandle 5 x 106 celler med 500 μL af radio-immunoprecipitation-analysebuffer (RIPA) og plasma membran lysisbuffer i trin 3,12 indeholdende 1%, 2% og 4% NP-40. Endvidere behandle de isolerede kerner i 500 μL af RIPA buffer til at opnå isolerede nukleare proteiner.
- Bundfald isolerede nukleare, cytoplasmatisk og hele cellen proteiner ved hjælp af 4 x sample volumen af kolde acetone for 60 min. ved-20 ° C. På 13.000 x g i 10 min. der centrifugeres og dekanteres være omhyggelig med ikke at løsne protein pellet. Tilsæt 100 μL af PBS til at opløse proteiner.
- Læg 10 μg af protein i hver brønd med en 10% SDS-PAGE gel. Udføre elektroforese, som beskrevet i 1,7-1,9. Udføre Western Blot overførsel som tidligere beskrevet i refeference 43.
- Identificere stigen markører, der bedst svarer til en MW af ~ 40 kDa. Skær membranen i halv på dette mærke. Sonden den skamplet, der indeholder de højere MW proteiner med Lamin A/C-specifikke antistoffer. Sonde membran med de lavere MW proteiner med Rab 7-specifikke antistoffer. Vestlige skamplet er en velkendt teknik og beskrevet ikke i denne protokol.
4. PET Imaging evaluering af Tumor målretning
Bemærk: Teknikker til implanterer tumorceller i mus til at generere heterotopisk xenografts er velkendt og de fleste laboratorier har in-house protokoller skræddersyet til deres tumor system. Dette er således ikke dækket i protokollen. Xenograft model vil være nonobese diabetisk/svær kombineret immundefekte (NOD/SCID) mus forsynet med IL-5Rα-positive invasive blære tumorer HT-1376 og HT-B9. IL-5Rα-positive invasive blære tumorceller omfatter > 66% af samlede celler i xenograft. Derimod var kun ~ 11% af IL-5Rα-positive HT-B9 celler indeholdt i udviklede xenografts41. Denne model giver således et fremragende eksempel for evaluering af AC tumor målretning i to tumorer, der repræsenterer overskuelig patient tumor heterogenitet.
- I grupper, der indeholder ≥ indsprøjtes 4 (NOD/SCID) mus, 20-30 μg (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS og 64Cu-A14 i halen vene.
- Den samme dag kan placere en cylindrisk phantom (24,8 mL) der indeholder 5 MBq af 64Cu at konvertere de radioaktive tællinger pr. sekund i injiceres dosis pr. gram væv (%ID/g).
- Vente 48 timer og derefter bedøver mus ved at placere dem i en induktion kammer med 1,5 L/min ilt flow med 2% isofluran. Anvende sterile oftalmologiske salve til mus øjne efter induktion og før placering i PET scanner.
- Hurtigt overføre musen til en PET scanner tabel på næsen kegle for isofluran headfirst udsat position. Placering af respiration og rektal sonder og overvåge temperatur og åndedræt sats til at sikre, at fysiologiske forhold opretholdes under eksperimentet som tidligere beskrevet 44.
- Start PET dataopsamling ved hjælp af en regelmæssig prøveudtagning indstilling og en energi vindue af 250-650 keV. Typisk, en 45 minutters statisk scanning pr. musen er tilstrækkeligt til at give tilstrækkelig sammenfaldende begivenheder for genopbygning og produktion af høj kvalitet kæledyr billeder.
- Efter 64Cu-AC-scanning, fjerne musen fra scanneren og læg det tilbage i buret. Mulighed for musen til at tilstrækkeligt inddrive før han vendte tilbage til den animalske facilitet.
- Få rekonstruerede billeder ved hjælp af 20 gentagelser af en tre-dimensionel maksimale sandsynligheden forventning maksimering algoritme.
-
Udføre region af interesse (ROI) analyse af tumor og visuelt vurderbare organer ved hjælp af AKRYLAMID software.
- Tegne ROIs for at få kvantitative %ID/g data af manuelt ved hjælp af indstillingen 3D Freehand værktøj og omhyggeligt afgrænse tumorer eller den tilstødende lårmusklen. Tæller per pixel i ROI vil blive konverteret til %ID/g fra forrige trin 4.2.
- Sammenlign 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS billeder for tumor kontrast, og kvantitative ROI % ID/g og tumor til baggrund nøgletal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For Procedure 1, opførelsen af 7 g 3 modificeret med ChAcNLS brug af sulfo-Investeringsfondene, som en crosslinker er meget pålidelig. Typisk, når læsset på en 12% gel og analyseret af SDS-PAGE, dette resulterer i en identificerbar trinvis stigning i MW proportionalt med stigende sulfo-Investeringsfondene-til - 7 g 3 nøgletal bruges og giver mulighed for de tunge og lette kæder vurderes individuelt for ChAcNLS konjugering (figur 3). 7G 3 reagerede på 10-, 20-, 25- og 50-1 sulfo-Investeringsfondene-til - 7 g 3 nøgletal efterfulgt af Rf måling og MW ekstrapolering resultater i 3, 7, 10 og 20 ChAcNLS molekyler pr. 7 g 3. Af densitometri er procent monomer arter > 90% for 7 g 3 ændret med 3-10 ChAcNLS. For 7G 3-ChAcNLS20 er samlede arten 45%. Dette viser, SDS-PAGE er enkel, men effektiv for at vælge en 7G 3-ChAcNLS konjugat til videre udvikling. Selv om lille udtværing med antistof kæder kan forekomme grund antistof glykosylering griber dette ikke ind i identifikation af samlede arter.
For Procedure 2 viser den repræsentative data forskelle mellem at bruge trypsin og ingen trypsin, når de evaluerer virus-afledte peptid-modificerede ACs for intracellulære effektivitet ophobning. I dette eksempel, kan 7G 3-ChAcNLS evne til at øge sin intracellulære ophobning evalueres i celler behandles med og uden trypsin (figur 4). Betydningen af trypsinization er imidlertid indlysende, når tolkning ophobning af konjugater bruges til sammenligning til at bestemme AC effektivitet og selektivitet. Trypsinization giver mulighed for intracellulære fluorescens basisniveauet observeret med umodificerede 7 g 3 fastlægges. Man kan detalje, 7 g 3 er begrænset til cytoplasma i små foci. I modsætning hertil er celler, der ikke er trypsinized, 7G 3-specifikke Fluorescens er begrænset til cellens overflade på grund af overekspression af IL-3Rα på cellens overflade. Dette gør det vanskeligt at undersøge intracellulære ophobning og distribution, fordi fluorescens på celleoverfladen dominerer og dermed blokerer den intracellulære fluorescens fra bliver visualiseret. Trypsinizing celler er også vigtigt, når de evaluerer specificitet som bevis med IgG-ChAcNLS. Vi kan se at der er nogle ikke-specifik fluorescens fra cellens overflade men kunne ikke bestemme graden af de intracellulære ophobning, forårsaget af peptid, hvis cellerne ikke var trypsinized. Endelig uden trypsinization kunne man fejlagtigt fortolke at en nyligt udviklede AC ikke ophobes inde i target-cellerne. Som set med 7G 3-NLS, celler, ikke der trypsinized fleste af Fluorescens er igen fra cellens overflade. Efter trypsinization, kan man iagttage, at 7G 3-NLS akkumulerer, omend begrænset, inde i target-cellerne.
For proceduren 3 viser den repræsentative data kvalitetskontrol for byggeri, affinitet og in vitro- nyttelast levering effektiviteten og specificiteten for radioisotop 64Cu med A14-ChAcNLS. Densitometri udføres på Radiografisk billeder taget fra en 12% polyacrylamid gel indeholder 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS, eller 64Cu-A14-ChAcNLS viser, at de radiolabeled konjugater er 100% monomer arter (figur 5A). 64 Cu-A14-ChAcNLS viser nanomolar affinitet for IL-5Rα. A14-ChAcNLS som funktion af stigende koncentrationer af 64Cu-A14-ChAcNLS afslørede særlige bindende nærmede mætning i koncentrationer på 3-5 nM i både HT-1376 og HT-B9 celler (figur 5B). Kd til 64Cu-A14-ChAcNLS på HT-1376 og HT-B9 celler var 6,4 ± 1.7 nM og 3,1 ± 0,8 nM, henholdsvis. ChAcNLS konjugation reduceret affinitet af A14 ca 2,5 for IL-5Rα på HT-1376 og HT-B9 celler. Gamma optælling afslører, at forhøjelsen af radioaktivitet i kernen og cytoplasmaet leveres af 64Cu-A14-ChAcNLS er specifikke og øger over tid (figur 6). Typisk gamma optælling viser ca > 6-fold stigning i nukleare og intracellulære ophobning i celler behandles med 64Cu-A14-ChAcNLS i forhold til behandling med 64Cu-A14-ChAcNLS i nærværelse af overskydende uforandret A14 eller Hvornår behandling undersøgelser udføres på 4 ° C (figur 6A). Der er også en ≥ 3-fold stigning i nukleare og intracellulære ophobning af 64Cu relative celler behandles med 64Cu-A14 og 64Cu-IgG-ChAcNLS på alle tidspunkter testet (figur 6B).
Figur 7 viser betydningen af celle fraktionering protokol. HT-1376 og HT-B9 celler blev inkuberet med plasma membran lysisbuffer indeholdende 1% eller 2% 4% NP-40. Isolerede kerner bør udelukkende indeholde Lamin A/C. cytoplasmatisk fraktioner bør derfor være eksklusiv til Rab7. Som kontrol, skal hele celler mængden med RIPA buffer være positiv for Lamin A/C i begge fraktioner. Denne protokol viser, at når de evaluerer den nukleare fraktion af mængden HT-1376 celler, der ikke er nogen Rab7 til stede. Derudover er der ingen Lamin A/C stede i cytoplasmatisk fraktion. Men der er en nedsat mængde af Rab7 i cytoplasmaet taget fra celler mængden med 4% NP-40 (figur 7A). Dette tyder mest sandsynligt, at 4% NP-40 lysisbuffer er forstyrre Kernemembranen ud over plasmamembran. Dette resulterer i en blanding af nukleare proteiner med cytoplasmatisk proteiner og derfor udvander koncentrationen af Rab 7. Dette forklarer den reducerede mængden af Rab 7 nuværende. HT-B9 celler er endnu mere følsomme end HT-1376 celler. Når behandlet med plasma membran lysisbuffer ses indeholdende 4% NP-40, Lamin A/C tydeligt i cytoplasmatisk fraktion (figur 7B). Der er en tilsvarende reduktion i mængden af Lamin A/C i den nukleare fraktion. HT-B9 celler er også følsomme på 2% NP-40 lysisbuffer som mængden af Rab7 i den cytoplasmatiske brøkdel er synligt reduceret i forhold til 1% NP-40. Således bør man optimere cellulære fraktionering med de bestemte celler af interesse, så kvantitative resultater af nyttelasten ophobning i kernen og intracellulære rum er nøjagtig. Dette er vigtigt for at vurdere effektiviteten af nukleare lokalisering af en roman AC.
For Procedure 4, PET imaging på 48 timer efter injektion af 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS eller 64Cu-A14-ChAcNLS i mus forsynet med HT-1376 og HT-B9 heterotopisk xenografts på modsatte bagben giver mulighed for visualisering af tumor målretning egenskaber (figur 8). Som i vores eksempel afslører besigtigelse af PET-billeder HT-1376 og HT-B9 tumor lrettede funktioner 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14 og 64Cu-A14-NLS (figur 8A). I tilfælde hvor besigtigelse er svært som med HT-B9 tumorer, kan ROI analyse anvendes til at bestemme tumor til muskel nøgletal (fig. 8B).
Figur 1: ChAcNLS-ændret mAbs. NLS restprodukter fra SV-40 store T-antigen (KKKRKV) er klemt inde mellem spacer restkoncentrationer udjævnet af en N-terminale cystein. Cholic syre (grøn beslag) er koblet til cystein som tidligere beskrevet 34. Efter opførelse og rensning af ChAcNLS, cystein sulfhydryl gruppe bruges til konjugation via sulfo-Investeringsfondene (rød beslag; vist allerede knyttet til mAb). Bemærk: mAb (150 kDa) og ChAcNLS (1,8 kDa) er ikke til at skalere. Tilpasset og genoptrykt med tilladelse fra Paquette, forbedrer M. et al. NLS-cholic syre konjugation at IL-5Rαspecific antistof cellulære ophobning og in vivo tumor-targeting egenskaber i en blære cancer model. Bioconjugate kemi. Doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
-
Figur 2: skematisk af AC celle behandling tilgang og efterfølgende forarbejdning til analyse af Konfokal mikroskopi og til analyse af celle fraktionering kvalitet. Røde pile svarer til væsentlige skridt 2.2, 2.3, 3.15 og 3.15.4. Tilpasset og genoptrykt med tilladelse fra Beaudoin, S. et al. ChAcNLS, en roman ændring af antistof-konjugater tillader mål celle-specifikke Endosomal flygte, lokalisering til kernen, og forbedret samlede intracellulære ophobning. Molekylær farmaci. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Figur 3: analyse af ChAcNLS-ændret mAbs. Et reducerende SDS-PAGE viser den køre stige (L) med tilsvarende Molekylær vægt i kilodalton (kDa) og umodificeret 7 g 3 tunge og lette kæder som referencer. De følgende baner er migration bands af de tunge og lette kæder fra 7 g 3 ændret med 3, 7, 10 og 20 ChAcNLS.
Figur 4: analyse af mAb intracellulære Distribution og akkumulering. Konfokal mikroskopi billeder illustrerer den intracellulære 7 g 3 distribution og relative fluorescens ophobning i IL-3Rα-positive leukæmiceller behandles med 7 g 3, 7 G 3-ChAcNLS, IgG og IgG-ChAcNLS. Celler var trypsinized eller ikke trypsinized før fiksering. Cellekerner farves med propidium Iodid (PI, red), murine-Fc-AF647 farvestof (mAb; grøn), og PI/mAb fusioneret. Skalaen er 50 μm. Inden for trypsin og ingen trypsin grupper, blev billeder erhvervet med identiske Apparatindstillingen mellem forskellige ACs vist. Trypsin del af figur 4 er tilpasset fra refefence 34 med tilladelse. Tilpasset og genoptrykt med tilladelse fra Beaudoin, S. et al. ChAcNLS, en roman ændring til antistof-konjugater tillader målrette celle-specifikke Endosomal flugt, lokalisering til kernen, og forbedret samlede intracellulære ophobning. Molekylær farmaci. 13 (6), 1915-1926, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00075 (2016).
Figur 5: 64Cu-A14-ChAcNLS renhed og affinitet. (A) den radiokemiske renhed af 64Cu-mærket A14, A14-NLS, A14-ChAcNLS blev kontrolleret af SDS-PAGE efterfulgt af Autoradiografi. (B) særlige bindende kurver for 64Cu-A14 og 64Cu-A14-ChAcNLS på HT-1376 og HT-B9 celler. Fejllinjer angiver standardafvigelsen af eksperiment udført i replikeres. Tilpasset og genoptrykt med tilladelse fra Paquette, M. mfl. NLS-cholic syre konjugation at IL-5Rα-specifikke antistof forbedrer cellulære ophobning og in vivo tumor-targeting egenskaber i en blære cancer model. Bioconjugate kemi. Doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Figur 6: 64Cu nukleare og intracellulære ophobning. Repræsentative eksempel på celle behandling udføres i tre eksemplarer (fejllinjer betegne standardafvigelse) at demonstrere (A) specificitet og (B) ophobning forbedring af 64Cu-A14-ChAcNLS. % Ophobning er præsenteret i nucleus (venstre paneler) og total intracellulære rum (højre paneler) i forhold til det samlede beløb for radioaktivitet, der anvendes under behandlingen af IL-5Rα-positive invasive blære cancerceller. Fejllinjer angiver standardafvigelsen af eksperiment udført i replikeres. * angiver p ≤0.05.
Figur 7: analyse af celle fraktionering Procedure. Vestlige skamplet af (A) nukleare og (B) Cytoplasmic brøker for Lamin A/C (top blots, røde pile) og Rab 7 (bunden blots, sorte pile) fremstillet af behandling af HT-1376 og HT-B9 celler i plasma membran lysisbuffer indeholdende 1%, 2% eller 4 % NP-40. Hele celler mængden med RIPA buffer blev brugt som positiv kontrol for Lamin A/C og Rab7 i begge fraktioner. Kører standarder (L) er kun afbildet i top blots. Tre pile er vist for Lamin A/C på grund af dens flere isoformer. Tilpasset og genoptrykt med tilladelse fra Paquette, M. et al. NLS-cholic syre konjugation at IL-5Rα-specifikke antistof forbedrer cellulære ophobning og in vivo tumor-targeting egenskaber i en blære cancer model. Bioconjugate kemi. Doi:10.102/ACS.bioconjchem.8b00077. (2018).
Figur 8: In Vivo analyse af Tumor målretning af PET Imaging og ROI analyse. (A) PET billeder på 48 timer efter injektion af NOD/SCID mus forsynet med HT-1376 (røde pile) og HT-B9 (blå pile) tumorer intravenøst injiceres med 64Cu-A14, 64Cu-A14-NLS og 64Cu-A14-ChAcNLS. Grøn pil er leveren optagelse. Muskel ROI tegningen vist med magenta cirkel. (B) ROI HT-1376 og HT-B9 tumor til muskel nøgletal for ACs på 48 timer efter injektion. Fejllinjer angiver standardafvigelsen af eksperiment i n = 10 ROIs pr. mus (n = 5). * angiver p 0,05.
| TAT |
| CGGQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS 20 |
| CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ 30 |
| CGISYGRKKRRQRRR 29 |
| GRKKRRQRRRPPQGYC 22,25 |
| TRQARRNRRRRWRERQRGC 26 |
| NLS |
| CGYGPKKKRKVGG 21,23,24,27 |
| Cholic syre-CGYGPKKKRKVGG 34 |
Tabel 1: Liste over Tat og SV-40 store T-antigen afledt peptider bruges i AC ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Større mål af systemisk levering af anticancer-midler er at øge ophobning på tumor site, og optagelse i kræftceller og formindske uønskede bivirkninger i sundt væv. AC målrettet levering af molekylære nyttelast at tumorceller er en meget lovende metode til at behandle og afsløre tumorer. Men manglen effekt skyldes endosome fastklemning og ned stream lysosomale nedbrydning forbliver en vigtig udfordring. Mens denne protokol udnytter ChAcNLS peptid som et eksempel for opførelsen af næste generation ACs, kan de beskrevne procedurer tilpasses til enhver peptid-modificerede AC udvikles med henblik på at øge mængden af intracellulære leverede nyttelast målrettet kræftcellerne.
De mest afgørende skridt i denne protokol er: 1) at identificere og begrænse høj MW samlet arter; 2) trypsinization af celler før analysen til bestemmelse af intracellulære ophobning; 3) udføre kvalitetssikring af cellulære fraktionering procedurer; og 4) udfører PET imaging for at evaluere tumor målretning i vivo.
Det er vigtigt, konjugation af virus-afledte peptider til mAbs ikke medfører høje MW samlede arter, der er mest sandsynligt forårsaget af intramolekylære crosslinking mellem mAbs. Dette er den første bekymring og bør behandles før udvikler sig yderligere. Bevæger sig fremad med peptid-modificerede ACs, der indeholder uønskede aggregater kan give resultater, der giver falske beviser på aspekter såsom de intracellulære og i vivo nyttelast levering profiler. Reaktive maleimides på mAbs er sandsynligvis ansvarlige for kovalente sammenlægning. En løsning er at reducere sulfo Investeringsfondene til mAb-forholdet. Et andet alternativ er at bruge N-acetyl derivater af aminosyrer som Cys, Lys, hans, Ser og Thr under peptid konjugation til maleimide-aktiveret mAb 45. De nukleofil sidekæder er i stand til at reagere med maleimide gruppe af Investeringsfondene og mindske intra-antistof crosslinking. Alternativt, adskillelse af størrelse udstødelse kromatografi efter konjugation kan bruges til at isolere monomer arter 45. Lokationsspecifikke konjugation af peptid at antistoffet kan også udføres. For eksempel kan antistof kulhydrater ændres for konjugation til peptider, som har vist sig at effektivt producere monomer arter 24.
SDS-PAGE med 12% polyacrylamidgeler er en billig og effektiv metode til at få et bredt perspektiv af store forskelle i AC arter. Hvis en stigning i % polyacrylamid bruges, vil adskillelsen af tunge kæder og intramolekylære arter være vanskeligt at skelne. Omvendt, hvis en reduceret % polyacrylamid bruges, de lette kæder er tilbøjelige til at køre off gel. Gradient gels indeholder 4-20% polyacrylamid også give god fastholdelse skifter til de tunge og lette kæder på en enkelt gel. Blandt de forskellige analytiske teknikker til Biomolekylær analyse er high-performance væskekromatografi og kapillær elektroforese-SDS overlegen i forhold til SDS-PAGE for adskillelse og karakterisering af ACs 46. Ikke desto mindre, SDS-PAGE er en hurtig og billig metode til at analysere den oprindelige konstruktion i disse roman agenter og derefter beslutte, om den følgende fremgangsmåde.
Inkubation af celler i oploesning indeholdende 0,25% trypsin (trin 2.3), som fjerner et maksimalt antal celle-overflade proteiner og bundne ACs er vigtig, fordi det giver mulighed for bedre visualisering og relative stigninger i intracellulære akkumulering mellem reference antistoffer. Parametrene kamera er indstillet til at fange billeder ved maksimal fluorescens intensitet. Dette er på grund af variation fra celle til celle i mængden af AC, der er akkumuleret. Herigennem, fanger billeder ved maksimal intensitet tillader for celler med mindre AC ophobning skal også vurderes. Dog, kræft antigener er typisk meget udtrykt på tumorceller. Hvis cellerne ikke blev udsat for fordøjelsen af trypsin, vil derefter fluorescens stammer fra ACs på celle-overflade dominere billedet. Derudover uden trypsinization kunne udvikling være begrænset med ACs med subtile, men vigtige intracellulære ophobning egenskaber.
At sikre høj kvalitet cellulære fraktionering er vigtigt at præcist vurdere akkumuleringen af 64Cu i kerne versus cytoplasma. ChAcNLS evne til at øge AC og nyttelast intracellulære ophobning er på grund af den aktive lokalisering til kernen 34. Som fremtidige virus-peptider er udviklet, kan disse peptider også lokalisere til kernen som en del af deres mekanisme til at øge intracellulære nyttelasten effektiviteten. Det er således vigtigt at cellulære fraktionering er af høj kvalitet for præcist detaljer for denne proces. Denne protokol understreger betydningen af at evaluere kerner for cytoplasmatisk markører og også den cytoplasmatiske fraktion for nukleare markører. For eksempel, Hu et al., udviklet en AC modificeret med en Tat peptid og udforskede nukleare ophobning af en radioisotop nyttelast 24. Western blot analyse for calpain, en rigelig cytoplasmatiske protein, var til stede i den nukleare fraktion. Dette var sandsynligvis fordi kommercielle nukleare isolation kits blev brugt. Denne protokol demonstreret, at HT-1376 og HT-B9 celler kræves forskellige koncentrationer af NP-40 for at isolere beriget kerner med udbrudte hinder. Når HT-B9 celler blev mængden med buffer var indeholdende 4% NP-40, Lamin A/C tilstede i cytoplasmatisk brøkdel, der angiver behandlingen afbrydes nukleare membraner og tilladt for Lamin A/C at indtaste cytoplasma. Hvis de nukleare og cytoplasmatisk brøker ikke er isolerede omhyggeligt, kunne det være vanskeligt at identificere bidrag af nukleare lokalisering til samlede intracellulære ophobning. Der er rapporter om biologiske og kunstigt-afledt peptider, der specifikt retter sig mod andre intracellulære rum såsom endoplasmatiske reticulum, Golgi apparatet og mitokondrier 47,48,49. Isolering af intracellulære rum dermed stadig relevant.
Denne protokol er færdig med sin beskrivelse af 64Cu-A14-ChAcNLS målretning af HT-1376 og HT-B9 tumorer. Fra besigtigelse af PET-billeder i figur 8, fremgår det af den øgede tumor PET signal i forhold til de tilstødende reduceret omkring baggrund 64Cu-A14-ChAcNLS har overlegen målretning af HT-1376 og HT-B9 tumorer (figur 8A ). ROI analyser viser også sin evne til at evaluere tumor målretning. I vores eksempel bruge vi ROI tumor til muskel nøgletal til at kvantificere tumor målretning og vise 64Cu-A14-ChAcNLS er den overlegne AC (figur 8). PET imaging giver også mulighed for evaluering af AC binding i raske organer. Leveren er den primære organ, der metabolizes antistoffer. Figur 8A viser optagelsen i leveren er sammenlignelige i musene injiceret med 64Cu-A14-ChAcNLS og 64Cu-A14. På dette tidlige udviklingsfase tyder denne data på ChAcNLS ikke forårsager uønsket binding. 64 Cu har en halveringstid på 12,7 h, som er ikke ideelt til ACs, der har halveringstider i flere dage. Som tidligere beskrevet i den visuelle protokol af Zeglis og Lewis er brugen af langlivede radioisotop zirconium-89 (89Zr) en nyttelast, hvis fysiske halveringstid er ideel til mAbs og kan være afbildet af PET 50. Således, for at vurdere tumor levering over flere dage, 89Zr er en foretrukne valg. Dette er især vigtigt, hvis terapi er et mål, hvor høj tumor optagelse er gunstige og øger over tid med antistoffer 7. Biodistribution bør også udføres for at bestemme enkelte orgel optagelse til at udforske den målretning eller binding af egenskaber nyligt udviklet ACs. Derudover kan mus være predosed med uforandret specifikt antistof til at blokere receptoren websteder på tumorceller at evaluere målretning specificitet. Ikke desto mindre give 64Cu med PET imaging og ROI analyse tilstrækkeligt en indledende vurdering af tumor levering egenskaber af den udviklede ACs præsenteret i denne protokol.
Hidtil, ACs modificeret med virus-afledte peptider har været begrænset til levering af radioaktive isotoper. Dette er delvis på grund af historiske grunde og også fordi radioisotoper er nemt kvantificeres under in vitro og i vivo test, og kan visualiseres ved hjælp af noninvasive hele kroppen billeddiagnostiske modaliteter. Naturligvis, som feltet udvider til transport og levering af nyttelast end radioisotoper, som kemoterapeutika, enzymer og oligonukleotider, ændringer af de teknikker, der er beskrevet i denne protokol vil skulle udvikles. For eksempel, vil nye metoder til evaluering af intracellulær ophobning af alternative nyttelast skal udvikles. Derudover vil ændringer i vivo evaluering bee nødvendigt, da disse payloads kan ikke være let afbildet og derfor vil det være vanskeligt at vurdere biodistribution, specificitet og tumor optagelse effektivitet. Af disse grunde bør radionuklid nyttelast forbliver surrogat nyttelast for fremtidige udvikling med alternative laster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Cancer Research Society (Canada) og CIMS. Forfatterne takke Dr. Samia Ait-Mohand og Jean-Francois Beaudoin for bistand. Dr. Angel Lopez (Universitet i South Australia) for mAb A14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
References
- Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
- Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
- Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
- Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
- Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
- Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
- Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
- Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
- Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
- Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
- Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
- Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
- Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
- Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
- Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
- Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
- Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
- Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
- Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
- Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
- Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
- Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
- Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
- Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
- Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
- Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
- Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
- Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
- Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
- Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
- Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
- Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
- Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
- Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
- Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
- Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
- Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
- Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
- Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
- Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
- Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
- Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
- Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
- Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
