Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese af Biokompatible Liquid Crystal Elastomer Skum som Cell Stilladser til 3D Spatial Cell Cultures

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/55452
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 3, 3, 1
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

Summary

Denne undersøgelse viser en metode til fremstilling af 3D, biologisk nedbrydelige, skumlignende celle scaffolds baseret på biokompatible sidekædeegenskaber flydende krystal elastomerer (afgørende for store komplekse). Konfokal mikroskopi eksperimenter viser, at skumlignende afgørende for store komplekse tillade cellevedhæftning, proliferation og den spontane tilpasning af C2C12s myoblaster.

Abstract

Her præsenteres en trin-for-trin udarbejdelse af en 3D, biologisk nedbrydeligt, skum-lignende celle stillads. Disse skeletter blev fremstillet ved tværbinding stjerne blokcopolymerer featuring kolesterol enheder som sidekæde-sidegrupper, hvilket resulterer i smektisk-A (SMA) flydende krystaller elastomerer (afgørende for store komplekse). Skum-lignende stilladser, fremstillet ved anvendelse af metal-skabeloner, tilbyder indbyrdes forbundne mikrokanaler, hvilket gør dem egnede som 3D cellekultur stilladser. De kombinerede egenskaber af den regelmæssige struktur af metallet skum og af elastomeren resultat i en 3D celle stillads, der fremmer ikke kun højere celleproliferation sammenlignet med konventionelle porøse template film, men også bedre styring af massetransport (dvs. næringsstoffer, gasser, affald etc.). Karakteren af metal skabelon giver mulighed for let manipulation af skum former (dvs. ruller eller film), og for udarbejdelsen af stilladser i forskellige porestørrelser for forskellige celle undersøgelser samtidig bevare bindelsesudstyrted porøse natur af skabelonen. Ætsningsprocessen påvirker ikke kemien i elastomererne, bevare deres biokompatible og bionedbrydelige natur. Vi viser, at disse smektiske afgørende for store komplekse, når der dyrkes for omfattende tidsperioder, muliggøre studiet af klinisk relevante og komplekse væv konstruktioner og samtidig fremme vækst og spredning af celler.

Introduction

Der er adskillige eksempler på biologiske og biokompatible syntetiske materialer beregnet til påføring i celleundersøgelser og til vævsregeneration sigte på cellebinding og proliferation 1, 2, 3, 4, 5. Der har været nogle få eksempler på biokompatible materialer, der er kendt som flydende krystal elastomerer (afgørende for store komplekse), der kunne reagere på ydre stimuli med anisotropisk molekylær bestilling 6, 7. Afgørende for store komplekse er reagerer på stimulering, materialer, der kombinerer de mekaniske og elastiske egenskaber af elastomerer med den optiske funktionalitet og molekylær bestilling af flydende krystaller 8, 9. Afgørende for store komplekse kan opleve ændringer i form, mekanisk deformation, elastisk opførsel og optiske egenskaber som svar på ydre stimuli (dvs.., varme, stress, lys, etc.) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Tidligere undersøgelser har vist, at flydende krystaller (LCS) kan fornemme vækst og orienteringen af celler 4, 17. Det er muligt derefter at antage, at afgørende for store komplekse kan være egnet til biologisk og medicinsk relevante anvendelser, herunder celle stilladser og tilpasning. Vi har tidligere rapporteret fremstillingen af smektiske biokompatible, bionedbrydelige, støbt-støbte og tynde afgørende for store komplekse film med et "Swiss-ostetype" porøs morfologi 6, 18. Vi også forberedt nematiske biokompatible afgørende for store komplekse med kugleformet morfologi som skeletter til cellevækst 19 <sup>, 20. Vores arbejde var rettet mod tuning de mekaniske egenskaber af de materialer til at matche dem i vævet af interesse 21. Også disse undersøgelser fokuserer på forståelse elastomer-celle interaktioner samt cellulære respons, når de elastomerer er underlagt eksterne stimuli.

De største udfordringer var delvist at skræddersy porøsitet afgørende for store komplekse at muliggøre cellevedhæftning og permeation gennem den elastomere matrix og for bedre massetransport. Porøsiteten af disse tynde film 6 tilladt for celle permeation gennem hovedparten af matrixen, men ikke alle porer var fuldt sammenkoblet eller havde en mere regelmæssig (homogen) porestørrelse. Vi rapporterede derefter på biokompatible nematic LCE elastomerer med kugleformede morfologier. Disse nematiske elastomerer tilladt for vedhæftning og proliferation af celler, men porestørrelsen varierede kun 10-30 um, som forebygges eller begrænset anvendelsen af ​​disseelastomerer med en bredere vifte af cellelinier 19, 20.

Tidligere arbejde af Kung et al. om dannelse af graphene skum under anvendelse af en "offer" metal skabelon viste, at det opnåede graphene skum havde en meget regelmæssig porøs morfologi dikteret af det valgte metal skabelon 22. Denne metode giver fuld kontrol over porøsitet og porestørrelse. På samme tid, formbarhed og fleksibilitet i metal skabelon tillade dannelsen af ​​anden skabelon former forud for forberedelse skum. Andre teknikker, såsom materiale udvaskning 23, gas templating 24, eller elektro-spundne fibre 25, 26 tilbyder også potentialet til fremstilling af porøse materialer, men de er mere tidskrævende og i nogle tilfælde, er porestørrelsen begrænset til kun nogle få mikrometer. Skum-lignende 3D afgørende for store komplekse fremstillet ved anvendelse af metal skabeloner muliggør en højere celle belastning; en forbedret proliferationshastighed; co-dyrkning; og, at sidst men ikke mindst, bedre massetransport forvaltning (dvs. næringsstoffer, gasser, og affald) sikre fuld væv udvikling 27. Skum-lignende 3D afgørende for store komplekse synes også at forbedre cellejustering; dette er mest sandsynligt i forhold til LC vedhæng sensing cellevækst og celle orientering. Tilstedeværelsen af ​​LC-dele i LCE synes at forbedre cellejustering med hensyn til celle placering inden LCE stilladset. Celler justeret indenfor stiverne i LCE, mens der ikke observeres nogen klar orientering hvor stiverne slutte sig sammen (kryds) 27.

Samlet set vores LCE celle stillads platform som en celle støtte medie giver muligheder for at tune den elastomere morfologi og elastiske egenskaber og til specifikt at lede tilpasningen af ​​(individuelle) celletyper til at skabe et bestilt, rumlige arrangementer of celler ligner levende systemer. Ud over det stillads stand til at opretholde og lede langsigtet cellevækst og proliferation, afgørende for store komplekse tillader også dynamiske forsøg, hvor celle orientering og interaktioner kan ændres i farten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Følgende trin til 3D LCE skumlignende præparat under anvendelse af 3-arm stjerne-blokcopolymer er vist i figur 1. For kernemagnetisk resonans (NMR) karakterisering, er det spektre registreret i deutereret chloroform (CDCI3) ved stuetemperatur på et Bruker DMX 400-MHz-instrument og internt refereres resterende toppe ved 7,26. Fouriertransformation infrarød (FT-IR) spektre er registreret ved anvendelse af et Bruker Vector 33 FT-IR spektrometer ved anvendelse svækket total reflektans mode. For hvert trin i følgende protokol, er det vigtigt at bære passende personlig beskyttelsesdragt (PPE).

1. Syntese af α-chlor-ε-caprolacton (monomer) (Ifølge fremgangsmåden i Jérôme et al. 28)

  1. Før påbegyndelse syntesen, oprense 27 g 3-chlorperbenzoesyre som følger:
    1. I 800 ml destilleret vand, tilsæt 1,28 g natriummonobasisk monohydrat og 8,24 g dinatriumphosphatheptahydrat. Justere pH til 7,4 (ved anvendelse af natriumhydroxid eller saltsyre) og reserve 30 ml af denne opløsning; dette er pufferopløsningen.
    2. Under anvendelse af en skilletragt, opløses 3-chlorperbenzoesyre i 35 ml diethylether. den organiske opløsning med 10 ml pufferopløsning vask (fremstillet i trin 1.1.1.). Gentag vask tre gange.
    3. Tilføje 3 g natriumsulfat direkte til den organiske opløsning; dette tørremiddel absorberer vand fra den organiske opløsning.
    4. Opløsningen filtreres til fjernelse af tørringsmidlet. Koncentrer filtratet under reduceret tryk ved anvendelse af en rotationsinddamper ved 850 mbar og 40 ° C.
  2. Opløseliggøre 18,5 g renset 3-chlorperbenzoesyre i 150 ml tør dichlormethan ved omrøring i ultralydsbad; dette tager typisk 20 min. Placer opløsning inde i en skilletragt.
  3. Inde i en to-hals, rundbundet kolbe,opløses 13,1 g 2-chlorcyclohexanon i 15 ml tør dichlormethan under anvendelse af en magnetisk omrører under nitrogengas. Hold omrøring.
  4. Monter skilletragt indeholdende 3-chlorperbenzoesyre opløsning (fra trin 1.2) til to-halset kolbe i trin 1.3. Skylle systemet med nitrogengas. Justere åbningen af ​​skilletragten, således at chlorperbenzoesyre opløsning falder dråbevis til 2-chlorcyclohexanon opløsning (1 dråbe hvert andet sekund) og omrøring af blandingen fortsættes under nitrogengas i 96 timer.
  5. Afkøl reaktionsblandingen til -20 ° C i 1 time til udfældning af m-chlorbenzoesyre (m -CBA) biprodukt.
  6. Foretage m-chlorbenzoesyre (m -CBA) og vaskes den resterende opløsning med mættede opløsninger af natriumthiosulfat, natriumbicarbonat og natriumchlorid.
  7. Fjern opløsningsmidlet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsinddamper ved 850 mbar og 40 ° C. Oprense lysegul, tyktflydende liquid ved destillation under reduceret tryk ved 2,3 Torr og 96 ° C.
  8. Overvåge succesen af syntesen under anvendelse af følgende 1H NMR toppe. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, CH CLCO), 4,37-4,26 (m, 1H, C H2O), 4,18-4,05 (m, 1H , C H2O), og 2,06-1,58 (m, 6H, -CH2--) 6, 27.

2. Syntese af α-Tre-armet stjerne-blokcopolymer (SBC-αCl) ved ringåbning Copolymerisation (Sharma et al. 6 og Amsden et al. 29)

  1. Før syntese, silanize en 20-ml ampul ved at fylde den med en 2% (v / v) opløsning af 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane i toluen og omrøring i ca. 24 timer. Skylles med isopropylalkohol og tørres ved at placere det i en ovn ved 140 ° C i 30 minutter.
  2. Tilføj 3.64 g destilleret ε-caprolacton, 0,5 g α-chlor-ε-caprolacton, og 0,25 ml glycerol til ampullen. Bland anvendelse af en vortex i 1 min.
  3. Tilføje 4,90 g D, L-lactid til ampullen og rense det med nitrogen. Placer ampullen i en ovn ved 120 ° C for at smelte D, L-lactid; denne proces tager typisk ca. 2 timer. Bland igen ved hjælp af en hvirvel for at sikre, at alt indholdet er godt opblandet og tilsæt 66 uL af tin (II) 2-ethylhexanoat (Sn (okt) 2) til ampullen.
    BEMÆRK: D, vil L-lactid køle ned under denne proces og skal blive genopvarmet i ovnen for at smelte.
  4. Energisk blande en sidste gang ved hjælp af vortex og skyl med nitrogen.
  5. Luk ampullen med en gummiprop. Placere en nål forbundet til et vakuumrør (hus vakuum er normalt nok) gennem gummiproppen. Tænd for vakuum og ved hjælp af en flamme, smelter den lange hals af glasset, vride langsomt, indtil glass kollapser på sig selv. Vær omhyggelig med ikke at smelte gummiprop. Når ampullen er tilsmeltet, som anbringes i et sandbad, en ovn eller passende varmeelement ved 140 ° C i 48 timer.
  6. Tag ampullen og lad den køle ved stuetemperatur.
  7. Bryde ampullen på den forseglede mærke og opløse højviskos væske ved tilsætning af 10 ml dichlormethan. Opløsningen overføres til en skilletragt.
  8. Forberede en kolbe indeholdende 100 ml kold methanol (afkølet under anvendelse af et tøris / acetone-bad ved en temperatur omkring -78 ° C). Fastsætte skilletragten (trin 2.7) på toppen af ​​kolben. Justere åbningen af ​​skilletragten, således at omkring to dråber falder hvert andet sekund (dråbevis).
  9. Indsamle det hvide bundfald ved filtrering (ved anvendelse af et papirfilter) og tør det i en vakuumovn mellem 50 og 60 ° C.
  10. Overvåge succesen af syntesen under anvendelse af følgende 1H NMR og FT-IR-toppe. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COCH CH3), 4,43-4,25 (m, CH Cl), 4,24-4,12 (m, CH2 O), 4,11-4,03 (t, J = 4,6 Hz, CH2 O), 3,80-3,68 (m, CH CH 2), 3,09-2,64 (bred, s, OH), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, α- H) og 1,77-1,25 (m, CH2, CH3); FT-IR (1 / λ [cm1]): 2.932 (s), 2869 (m), 1.741 (s), 961 (s), 866, og 735 (m) 6, 27.
    Bemærk: Til fremstilling af en mere hydrofil 3D LCE, fremstille en lineær blokcopolymer (LBC) i stedet for en SBC, efter ringåbning copolymerisation (ROP) ovenfor beskrevne procedure.
    1. Tilføje 0,3 g polyethylenglycol (PEG), 3,15 g ε-caprolacton, 1,0 g α-chlor-ε-caprolacton, og 5,0 g D, L-lactid til det silaniserede hætteglas mix.

    3. Syntetisk Modifikation af α-CI-Three Arm SBC til aN 3 -Tre Arm SBC (SBC-aN 3) (Ifølge Sharma et al. 6)

    1. I en rundbundet kolbe og under nitrogen opløses 5 g af SBC-αCl i 30 ml tørt N, N' dimethylformamid.
    2. Tilføje 0,22 g natriumazid og tillade at reagere natten over ved stuetemperatur.
      Forsigtig: Natriumazid er toksisk; bære passende personlig beskyttelsesdragt (PPE).
    3. Fjernelse af N, N'-dimethylformamid under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper ved 11 mbar og 40 ° C. Opløses blandingen i 30 ml toluen. Centrifugeres opløsningen tre gange ved 2.800 xg i 15 minutter for at fjerne saltet dannes. Inddamp toluen under reduceret tryk ved anvendelse af en rotationsfordamper ved 77 mbar og 40 ° C.
    4. Overvåge succesen af azidet substitution ved anvendelse af 1H NMR og FT-IR-toppe.
      BEMÆRK: [cm1]): 2.928, 2.108 (s, azid), 1.754 (s), 1.450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s), og 696 (m).

    4. Syntese af cholesteryl 5-hexynoat (LC-delen) (Ifølge Sharma et al. 6 og Donaldson et al. 30)

    1. I en rundbundet kolbe, blande 3 g 5-hexynsyre og 130 ml dichlormethan. Afkøl til 0 ° C ved anvendelse af et isbad.
    2. I en anden rundbundet kolbe, blandes 8,28 g N, N'-dicyclohexylcarbodiimid, 10,3 g cholesterol og 0,2 g 4-dimethylaminopyridin.
    3. Overfør 5 hexynsyren opløsning dråbevis til kolben indeholdende kolesterol blandingen og opretholde den endelige blanding ved 0 ° C i 1 time.
    4. Lad blandingen varme op til stuetemperatur natten over. Fjern det resulterende dicyclohexylurinstof bundfald ved filtrering under anvendelse af en klasse 415 papirfilter og kassere den.
    5. Koncentrer filtratet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsinddamper ved 850 mbar og 40 ° C. det opsamlede resten i 150 ml hexan opløses.
    6. Opløsningsmidlet afdampes under formindsket tryk under anvendelse af en rotationsinddamper ved 335 mbar og 40 ° C. Tilføj 350 ml ethanol til den olieagtige remanens at opsamle det endelige produkt. Vask tonet faststof dannet med ethanol og tør det faste produkt under vakuum ved 50 ° C.
    7. Overvåg syntesen under anvendelse af følgende 1H NMR og FT-IR-toppe. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, CH = C), 4,70-4,58 (m, 1H, CH OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, CH2CO), 2,34 (m, 2H, CH2-C H =), 2,31 (m, 2H, CH2 CH2-COO), 2,28 (s, 1H, HC = C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡C-2), 2,07-1,06 (m, 2H, CH2, CH), 0,94 (s, 3H, CH3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, CH3 CH), og 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, CH3-C-H), 0,67 (s, 3H, CH3). FT-IR (1 / λ [cm1]): 2,830-2,990 (bred og kraftig top), 2.104 (m), 1.695 (s), 1428 (m), 1.135 (m), 999 (s), 798 (s), og 667 (s).

    5. Syntetisk Modifikation af α-N 3 -Tre Arm SBC til a-cholesteryl-Three Arm SBC (SBC-αCLC) via et azid-Alkyn Huisgen cycloadditionsreaktion ( "Click" Reaction) hentes SBC-Chol (Ifølge Sharma et al. 6)

    1. I en rundbundet kolbe, opløses 1 molækvivalent SBC-aN 3 (1,5 g) i 100 ml frisk destilleret tetrahydrofuran (THF). Tilsæt 1,2 molære equivalent af cholesteryl 5-hexynoat (1,94 g), 0,1 molækvivalent kobber (I) iodid (0,06 g), og 0,1 molækvivalent af triethylamin (0,03 g). Omrør blandingen natten over ved 35 ° C under nitrogen.
    2. Opløsningsmidlet afdampes under formindsket tryk under anvendelse af en rotationsinddamper ved 357 mbar og 40 ° C.
    3. Opløs den resterende blanding i 80 ml dichlormethan og centrifugeres i 5 minutter ved 2.800 xg ved stuetemperatur for at fjerne uomsatte materialer og biprodukter.
    4. Overvåg syntesen under anvendelse af følgende 1H NMR og FT-IR-toppe. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazol), 5,43-5,34 (m, C = CH cholesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH3), 4,68 -4,55 (m, O-CH cholesterol), 4,24-4,19 (m, CH2 O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, CH2O), 4,11-4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH 2 O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH2), 2,31-2,25 (m, COCH2), 2,07-1,02 (m, CH2 CH3), 1,05-1,03 (s, CH2, CH3), 0,96-0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH2, CH3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH3), og 0,71-0,68 (s, CH3). FT-IR (1 / λ [cm1]): 3.260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1.460 (s), 1.370 (s), 1240 (m), 1.190 (s), 733 (s), og 668 (s).

    6. Syntese af 2,2-Bis (1-caprolacton-4-yl) propan (Crosslinker, BCP) (Ifølge Gao et al. 27 og Albertsson et al. 31)

    1. I en rundbundet kolbe, fremstilles en opløsning indeholdende 10,8 g 2-bis (4-hydroxy-cyclohexyl) propan og 52 ml eddikesyre.
    2. Fremstil en opløsning indeholdende 11 g chromtrioxid i 50 ml eddikesyre og 8 ml destilleret vand. Tilføje denne opløsning dråbevis til opløsningen fremstillet i trin 6.1, mens blandingen temperatur mellem 17 og 20 ° C (f.eks opretholdelse i enVandbad); denne dråbevis proces tager 2 timer. Når processen er færdig, lad opløsningen omrøres i ca. 30 min.
    3. Der tilsættes 50 ml 2-propanol. Omrør opløsningen natten over ved stuetemperatur.
    4. Koncentrer mørkviolet opløsning under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsinddamper ved 137 mbar og 40 ° C. Tilføj 300 ml destilleret vand til udfældning; bundfaldet bør være lys lilla.
    5. Filtrere det rå produkt under anvendelse af en klasse 415 papirfilter. Vask det faste materiale med ~ 250 ml destilleret vand, eller indtil bliver hvid.
    6. Opløs det faste materiale i 15 ml benzen ved 40 ° C og lade det rekrystallisere ved 25 ° C.
    7. Tilføje 8,34 g tørt diketon opløst i tør dichlormethan og en opløsning indeholdende 6,0 g 3-chlorperbenzoesyre i 75 ml dichlormethan til kolben.
    8. Tilbagesvale opløsningen ved 40 ° C i 24 timer.
    9. Afkøl reaktionsblandingen til -20 ° C i 10 min for at udfælde m
    10. Fjerne m-chlorbenzoesyre ved filtrering (ved anvendelse af et papirfilter) og koncentrer opløsningen under reduceret tryk.
    11. Vask viskose råproduktet med 200 ml 2-heptanon og tør bundfaldet under vakuum ved 50 ° C natten over.
    12. Overvåg syntesen under anvendelse af følgende 1H NMR og FT-IR-toppe. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, CH2 OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, CH2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, CH2 COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, CH 2 COO), 2,04-1,93 (m, 4H, -CH2-CH2 OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -CH2-CH2-COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C (CH3) 2), 0,84 (s, 6H, CH3 C-).
      13. 7. Oprettelse af porøse 3D Elastomer Scaffold Brug enten hexamethylendiisocyanat (HDI) eller 2,2-bis (1-caprolacton-4-yl) propan (BCP) 27 som Tværbindere (Ifølge Gao et al. 27)

      1. Forberede trearmet elastomer blandingen under anvendelse 0,75 g af SBC-αCLC ved tilsætning 0,25 ml HDI (eller 0,45 ml BCP) og 0,24 ml destilleret ε-caprolacton-monomer. Tilføj 60 pi Sn (okt) 2. Hvis anvendelse BCP stedet for HDI, bland SBC-αCLC og BCP anvendelse af en vortex og placere dem i en ovn ved 140 ° C, indtil BCP fuldt smelter og opløser (dette trin kan tage op til 2 timer). Når BCP er blevet opløst, tage det ud af ovnen og Sn (okt) 2 og vortex.
      2. Forberede en "offer" nikkelskum skabelon ved at skære en 1 x 4 cm metalstykke. Rul det fra en af de korte ender, således at den endelige valse er ca. en 1 x 1 cm metalstykke (se figur 4).
        3. <li> Sæt nikkel skum i et hætteglas eller aluminiumsfolie pakken og hæld blandingen fremstillet i trin 7.1 til fuld dækning skummet i 2 min. Fjerne overskydende blanding med en Pasteur-pipette. Lade den stå i en ovn natten over ved 80 ° C.
      3. Skrælle aluminiumsfolie eller bryde glasset. Under anvendelse af et barberblad, barbere elastomeren omkring metalskummet at blotlægge nikkelmetal.
      4. Forberede 1 M jern (III) chlorid (FeCl3) opløsning i 100 ml vand. Placer skummet i en kolbe og tilsættes 70 ml af FeCl3 opløsning. Stir i tre dage ved stuetemperatur og ændre FeCl3 løsning hver dag. Før hver ændring, omrør skummet med ioniseret vand i 0,5 timer.
        BEMÆRK: ætsning proces er typisk afsluttet efter tre dage. For at sikre at ætsningsprocessen er afsluttet, udfører taktile trykprøvning indtil skummene føles blød. Skum resistens over for taktile trykprøvning indikerer tilstedeværelsen af ​​en resterende metal skabelon.
      5. Skyl elastomer skum med ethanol og anbringes i en vakuumovn natten over ved 40 ° C.
      6. Karakterisere materialer ved hjælp af scanningselektronmikroskopi (SEM), differentiel scanningskalorimetri (DSC), trykprøvning mekaniske og termisk gravimetrisk analyse (TGA) 27.
        BEMÆRK: Til fremstilling af en mere hydrofil 3D LCE, udskifte SBC med LBC (at sikre, at LBC indeholder også en LC-del) efter trinene beskrevet i trin 7.5.

      8. Såning af Elastomer Stillads med SH-SY5Y-neuroblastomceller og Kultur Brug Sterile Techniques

      1. Steriliser elastomeren ved at vaske det to gange med 1 ml 70% ethanol. Udføre UV-bestråling i 10 minutter og vask med 1 ml 70% ethanol. Skyl det to gange med 1 ml sterilt vand og 1 ml phosphatpufret saltvand (PBS). Placer elastomererne i 24-brønds dyrkningsplader.
      2. Forberede celle vækstmedium for SH-SY5Y indeholdende 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep).
      3. Efter tælling af celler under anvendelse af en hæmatocyto, udarbejde 1.5 x 10 5 SH-SY5Y-celler suspenderet i 100 pi vækstmedium (frø opløsning). Tilsæt løsning oven på elastomerer, og sørg for at danne en dråbe.
      4. Inkubér podede elastomerer ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 timer for at fremme celleadhæsion. Tilsæt 0,5 ml vækstmedium. Inkuber igen ved 37 ° C med 5% CO2.
      5. Ændre mediet hver anden dag efter vask med 1 ml PBS.

      9. Mikroskopisk Imaging af elastomer Construct

      1. Fikseres cellerne dyrket på elastomerer med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 15 min. Skylles med 3 ml PBS tre gange i 5 minutter hver og placere elastomeren med de fikserede celler i en dyrkningsskål med en vedhæftet dækglas.
        Forsigtig: PFA er toksisk. Bær egnede personlige beskyttelsesbeklædning (PPE).
      2. Stai de faste prøver med 0,1% 4' , 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 500 pi PBS i 10 minutter og skylles to gange med 1 ml PBS i 5 minutter.
      3. Umiddelbart billede elastomererne ved hjælp konfokal mikroskopi med DAPI fluorescens, erhverve billedstakke der spænder prøven.
        BEMÆRK: Her blev billedstakke erhvervet ved hjælp af en 20X objektiv og en 60X objektiv.
      4. Analyser optisk konfokal billedstakke hjælp ImageJ 32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne rapport viser fremstillingen fremgangsmåde en porøs 3D LCE som et skelet til celledyrkning under anvendelse af et nikkelmetal skabelon. Den opnåede 3D LCE demonstrerer et komplekst sammenhængende kanal netværk, der giver mulighed for nem celle infiltration, samt mere egnet massetransport 27. Det blev konstateret, at cellerne er i stand til fuldt ud at trænge det sammenkoblede kanal netværk og er også i stand til at tilpasse inden LCE. Her, et metal nikkel skum (99% Ni, densitet på 860 g / cm2) blev udvalgt efter en lignende fremgangsmåde til fremstilling graphene skum tidligere rapporteret af Kung et al. 22. Metalskummet blev polymer støbt, med alle metal stivere fuldt dækket. Valget af metallet skum størrelse og tæthed er vigtigt, da det bibringer den endelige morfologi LCE og kan hjælpe med at efterligne vævsmiljø af interesse.

D, L- lactid (figur 2). Slutproduktet er en hydrofob 3-arm SBC. SBC'ere med 4 og 6 arme, lavet ved at erstatte glycerol node med pentaerythritol og dipentaerythritol henholdsvis er tidligere blevet rapporteret 18. For en mere hydrofil SBC, blev det centrale knudepunkt erstattet med oligoethylene oxid (se protokol noter). Imidlertid erstatte glycerol med oligoethylene oxid resulterer i en lineær blokcopolymer 27. Vi anvendte en modificeret syntese fra Younes et al. 29. Den ændrede udgave tillader anvendelse af en modificeret ε-caprolactone med en halogengruppe i to forskellige positioner, alfa- og gamma til carbonyl 6. Når SBC er dannet, den modificerede ε-caprolacton blok lider en forskydning af halogenatomet med en azidgruppe. Forskydningen af halogengruppe ved azidgruppen bekræftes af udseendet af 2.100 cm - 1 båndet ved hjælp svækket total reflektans (ATR) FT-IR (figur 3). Azidgruppen senere anvendes til kovalent fastgøre LC del (cholesteryl hexynoat) til stjerne-blokcopolymer anvendelse alkyn-azid Huisgen s cycloadditionsreaktion (også kendt som en "klik reaktion"), til opnåelse af endelige stjerne-blokcopolymer med en side -kæde kolesterol vedhæng enhed (SBC-Chol). Dannelsen af triazolringen bekræftes ved forsvinden af 2.100 cm - 1 bånd og fremkomsten af en singlet observeret ved 7,30 ppm i 1H NMR-spektre (se figur3). Vi har for nylig rapporteret om virkningen af anbringelsen af en halogengruppe enten alfa (α -Br) eller gamma (γ-Cl) til carbonylet på funktionaliserede ε CL 6. Det skal bemærkes, at erstatte det centrale knudepunkt i SBC co-polymerer med 4-arm- og 6-arm centrale kerner har en virkning på de mekaniske egenskaber af de opnåede afgørende for store komplekse fordi de centrale knudepunkter tjene som både initiatorer og iboende tværbindere 18 .

Når SBC-Chol er blevet fremstillet og fuldstændigt karakteriseret, tværbindingsprocessen under anvendelse af en metalskabelon er det sidste trin til fremstilling skum. SBC-Chol blev blandet med hexamethylendiisocyanat (HDI, tværbinder), ε-caprolacton, og Sn (oktav) 2 (ROP katalysator, se trin 7.1). Bis-caprolacton (BCP) tværbinder blev erstattet med HDI, som tidligere rapporteret. Metalskummet skæres og formes til den ønskede form (figur 4). To veje til fremstilling skum, nemlig den primære porøsitet (LCEF PP) og primær / sekundær porøsitet (LCEF P + SP), er tidligere blevet beskrevet. Her er LCEF P + SP, eller "dypning" metode, præsenteret, hvor nikkel skabelonen hurtigt dyppet i polymerblandingen. Metalskummet er placeret i en beholder fremstillet af aluminiumsfolie eller et scintillationsglas indeholdende polymerblandingen, med alle metal stivere fuldt nedsænket i polymerblandingen. Det overskydende polymerblanding fjernes forsigtigt. Denne polymer-dækket nikkel skabelon anbringes natten over, stadig inde i beholderen, i en ovn ved 80 ° C. Tværbinding udføres i nærvær af katalysatoren i ca. 2 timer. Efter tværbindingsprocessen polymeren-dækket nikkel skabelon fjernes fra dets beholder ved skrælning fra aluminiumsfolie eller bryde glasbeholder. Den overskydende polymer omhyggeligt barberet fra polymeren-dækket nikkel templspiste at blotlægge kanterne af nikkel template og placeret i en beholder med en mættet FeCl3-opløsning (figur 5). Efter et par timer, nikkel er næsten fuldstændigt fjernet, og kun LCE skum skylles med deioniseret (DI) vand for at fjerne nikkel / FeCl3-opløsning. LCE Skummet igen anbragt i en beholder med en mættet FeCl3 opløsning og skyllet med DI vand to gange mere. Efter ætsningsprocessen er afsluttet, og hele nikkel skabelonen helt elimineret, LCE skum viser et sammenkoblet kanalnet med udhulede stivere (figur 6). Figur 6 viser den interne LCE skum morfologi observeret under anvendelse af scanningselektronmikroskopi (SEM). De LCE skum stivere er hule, og den samlede regelmæssig morfologi er betinget af nikkel skum skabelon.

Tidligere brug af BCP krævede flere skridt til at holde det i Solution (dvs. smeltet), fordi BCP begynder at omkrystallisere så snart opløsningen køler ned nogle få grader (fra 140 ° C til stuetemperatur for at tilføje Sn (Oct) 2; se trin 7.1). Dette gør manipulation af blandingen metal skum og polymer udfordrende før tværbinding. Anvendelsen af ​​HDI som en tværbinder tilladt for en hurtigere tværbinding tid end ved anvendelse af BCP. BCP er et fast stof ved stuetemperatur, med et smeltepunkt på 140 ° C, hvorimod HDI er en væske ved stuetemperatur. Valget af tværbindere påvirker direkte forberedelse og, som i vores tilfælde, reduceret tværbindingen temperatur fra 140 til 80 ° C, hvilket også reducerer elastomer forberedelse.

LCE skum blev testet under anvendelse komprimering-deformation (film 1). En reduktion i LCE størrelse 70% observeres, uden effekt på udvendige dimensioner. Efter udgivelsen af ​​kompression fra LCE, det fuldt ud genvinder sin oprindelige sHAPE og størrelse. Det antages, at tilstedeværelsen af de flydende krystal-delene i LCE materiale er kritisk, som elastomerer fremstillet under de samme betingelser uden cholesterol ε-caprolacton blok ikke genvinde deres oprindelige form og kollapsede ind i sig selv.

Når LCE skum blev opnået, var de klar til at blive podet med neuroblastomer (SH-SY5Y) under anvendelse af standard celledyrkningsteknikker. LCE skum blev vasket to gange i 70% ethanol og skyllet tre gange med PBS før cellepodning. Inden for 2-3 dage efter cellepodning blev cellerne observeret at fastgøre til væggene i 3D LCE netværk. Til fuldstændig undersøgelse cellebinding og ekspansion inden LCE netværk blev celler fikseret efter 30 dage (figur 7). Celler blev fikseret, farvet med DAPI, og afbildet under anvendelse af konfokal mikroskopi. Cellerne fandtes at har spredt, bundet, og udvides til udstrakt dække 3D LCE stilladset netværk. Yderligeremere detaljeret analyse viste cellekerner forlængelse, som i de fleste tilfælde ikke blev påvirket af de krumme sektioner af 3D LCE stilladset netværk. Celleforlængelse kan også korreleres til cellejustering og er mest sandsynligt resultatet af smektisk-A fase karakteristisk for LCE fremlagt. Dette blev tidligere observeret i C2C12 celler dyrket efter 14 dage 27. I denne undersøgelse, viser vi, at cellerne fortsætter med at formere sig i mere end 14 dage; dette er ikke begrænset til C2C12 celler alene. Anvendelsen af ​​LCE skum kan udvides til næsten enhver cellelinie. Celler, der vokser på 3D LCE skumlignende scaffolds gavn af højere massetransport virkningsgrad sammenlignet med 2D stilladser. I 2D-stilladser, celler vokser sædvanligvis i lag oven på hinanden. Celler, der vokser på de øverste lag er de eneste, der har fuld adgang til alle næringsstoffer, gas og affald fjernelse (massetransport). Celler inden de nedre lag ikke kan få adgang næringsstoffer, og der er en højere grad af celle death i dette tilfælde. Inden 3D scaffolds, celler har en mere effektiv (sammenlignet med 2D skeletter) adgang til næringsstoffer, vækstfaktorer og gasser, tillader langsigtede celle- og vævsregeneration undersøgelser. ledelse Cell affald (fjernelse af affald) ved hjælp af 3D-LCE skum-lignende stilladser er også mere effektivt end i 2D stilladser. Porøsiteten (og / eller andre strukturelle egenskaber) af de afgørende for store komplekse tillader hurtig massetransport og øget cellefyldning sammenlignet med mindre porøse (eller andre) matricer, der tillader medier og cellulær adgang til centrale regioner i matrixen. Denne LCE platform er afstemmelig for at understøtte væksten af ​​mange typer primære og udødeliggjorte cellelinjer, herunder muskel, nerve, og hud, blandt andre, såvel som flercellede dyrkningssystemer. Væsentlige, det er en af ​​fordelene ved perronen, da det kan bruges til at dyrke mange forskellige celletyper og systemer i længere perioder. Hertil kommer, evnen vokse flere lag af celler i konstruktionen tættere emulATES naturlige miljøer.

figur 1
Figur 1: Generel fremgangsmåde beskriver trin-for-trin fremstilling og karakterisering af LCE skum. Se afsnittet protokol for detaljer. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Tværbinding arrangement med 3-arm SBC. Tværbindingen opbygningen af ​​den 3-arm SBC anvendelse biscaprolactone eller HDI som tværbindere i nærværelse af en nikkel metal skabelon til fremstilling af skum-lignende afgørende for store komplekse vises. Klik her for at se en større version af denne Figure.

figur 3
Figur 3: Skema af 1,2,3-triazol-dannelse (succesfulde "klik" reaktion) efterfulgt af 1H-NMR og FT-IR. Forskydningen af halogengruppe ved azidgruppen bekræftes af udseendet af 2.100 cm - 1 båndet ved hjælp svækket total reflektans (ATR) FT-IR. Dannelsen af triazolringen bekræftes ved forsvinden af 2.100 cm - 1 bånd og fremkomsten af en singlet, observeret ved 7,30 ppm i 1H-NMR-spektre. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4: Optiske billederaf forskellige skum former forud for tværbinding. Metalskummet skæres og formes til den ønskede form som vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 5
Figur 5: Nikkel skum før (A) og efter (B) tværbinding. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 6
Figur 6: LCE skum morfologi observeret ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi (SEM). Repræsentative SEM billeder af LCE skum på SBC-baserede (a og b) og LBC-baserede (c d) elastomerer brug af Ni-860 som metallet template er vist. Pile angiver udhulede stivere. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 7
Figur 7: Konfokal mikrografer udviser DAPI-farvede kerner af SH-SY5Y-celler knyttet til elastomerskum 30 dage efter podning. 2D-billeder blev stablet i z -retning, og tværsnit billeder i xz - og YZ -planes blev skabt. Billederne viser, at SH-SY5Y-celler (lyse pletter) fastgjort og ekspanderet inden for murene af de hule kanaler i elastomerskum. Cellerne rumligt udvidet til flere lag og strakte sig over 100 um gennem konstruktionen (som vist i xz - og yz -plane billede cross sectioner). Klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Film 1: Video billeder af deformation og inddrivelse af en LCE roll. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flydende krystallinske elastomerer er for nylig blevet undersøgt som biokompatible celle scaffolds grund af deres stimuli reaktionsevne. De har vist sig at være ideelle platforme som celle stilladser. Men en vigtig faktor at huske på, når de forbereder og designe et nyt LCE stillads er porøsitet. Inkorporering af udvaskelige faste stoffer 23 eller gasser resulterer ikke altid i homogen porøsitet eller fuldstændigt indbyrdes forbundne porer. Brugen af ​​en metal skabelon, der kan ætset ud ikke kun giver mulighed for at få en mere organiseret og regelmæssig indre struktur, men også giver mulighed for valg af porestørrelse og tæthed. Dette er direkte relateret til den tidligere anvendte til fremstilling af graphene skum 22 metalskabelon. Metal skabeloner giver også mulighed for at danne figurer før LCE krydsbinding, tillader en bred vifte af muligheder for at skabe avancerede og komplekse arkitekturer med regelmæssig porøsitet deunderskrevet at ligne endogene miljøer. Skum afgørende for store komplekse fremstillet ved anvendelse af denne metode giver mulighed for forbedret undersøgelse af cellemateriale og, endnu vigtigere, rumlige celle-celle-vekselvirkninger, en bedrift ikke muligt inden todimensionale (2D) miljøer. 2D celle stilladser tillader ikke, at cellerne frit interagere med naboceller. Desuden cellerne vokser typisk i monolag (eller direkte oven på hinanden), uden fuld adgang til rummet for vækst og, endnu vigtigere, til interaktion. Specifikke rumligt interagerende celletyper, såsom neuroner og gliaceller, er af afgørende betydning, når designe konstruktioner som potentielle implantater eller langsigtede eksperimentelle platforme til formål at afspejle levende systemer.

Vores modulære, opløsningsmiddelfri LCE syntese under anvendelse af en metalskabelon, præsenteres her, hjælper justere celleadhæsion ved at tune den hydrofobe / hydrofile balance ved at vælge den rette centrale knudepunkt og forholdet mellem monomerer 7 27. Dette er relevant for celle såning for at undgå et ekstra trin, der omfatter tilføjelse af en Matrigel lag, normalt gøres for at fremme celle vedhæftning. Mængden og størrelsen af ​​det centrale knudepunkt, samt tværbindingsmidlet, spiller en kritisk rolle i den endelige LCE, da de påvirker de termiske og mekaniske egenskaber af LC elastomerer. Derudover muliggør dette også tuning af bionedbrydelighedsgrænserne satser, som præsenteres før, så det passer til fuld regeneration af væv som LCE nedbrydes 6. I øjeblikket har vi igangværende eksperimenter med fokus på at undersøge, hvordan den type tværbindingsmiddel, central kerne, og udskiftning af D, L-lactid for L-lactid påvirker de elastiske egenskaber, celleadhæsion, proliferation og cellejustering.

Begrænsningerne ved denne protokol er: (1) den begrænsede række kommercielt tilgængelige metal (nikkel) skum og deres begrænsede rækkevidde i stolpeelementer dimensioner, (2)krav om, at LCE eller enhver anden polymer / elastomermateriale kemisk skal modstå betingelserne for metal etch (her en FeCl3 etch), og (3) at cellejustering synes at være begrænset til de flydende krystal modificerede elastomerer rapporteret her (moderselskabet ikke-LCE elastomerer viste ikke nogen nævneværdig cellejustering).

Sammenfattende har det tidligere vist, at SMA afgørende for store komplekse kan fremstilles ved hjælp af vores modulære synteseprocedure. Yderligere biokompatible LC dele kan være inkorporeret for at udforske deres mekaniske egenskaber og nye flydende krystallinske virkninger på celleproliferation og især cellejustering. Det er kendt, at mekaniske egenskaber, især Youngs moduli værdier, er kritisk for celleadhæsion, proliferation og cellejustering. Resultaterne her viser, at porøsitet SMA afgørende for store komplekse kan tunes ved hjælp af en metal skabelon til at give en effektiv måde at styre porestørrelsen og at skræddersy LCEform (dvs. samlet morfologi). Dypning af Ni skabelon i SCB polymerblandingen, efterfulgt af ætsning Ni skabelon giver en nem tilgang for nye LCE morfologier. De skumlignende afgørende for store komplekse her beskrevne tilvejebringelse af celler (her, SH-SY5Y, en standard celle model til at studere neuronal funktion) med en mere realistisk, 3D-miljø for vækst og interaktion. Så flere celletyper at vokse i flere lag spredt over hele elastomer nøje efterligner endogene neurale miljøer og tilbyder den interessante mulighed for mere avancerede 3D vævskultur eksperimenter. Brugen af ​​justerbare og dynamiske afgørende for store komplekse at efterligne indfødte arkitekturer baner vejen for næste generation celle modeller for langsgående og klinisk relevante celle studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Kent State University (forskningssamarbejde tilskud og støtte til regenerativ medicin initiativet på Kent State - ReMedIKS) for økonomisk støtte til dette projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane Alfa Aesar L16606 Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane TCI B0928 Reagent
2-chlorohexanone  Alfa Aesar A18613 Reagent
2-heptanone  Sigma Aldrich W254401 Solvent
2-propanol  Sigma Aldrich 278475 Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA Sigma Aldrich 273031 Reagent
4-dimethylaminopyridine Alfa Aesar A13016 Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI  Invitrogen D1306 Nuclear Stain
5-hexynoic acid  Alfa Aesar B25132-06 Reagent
Acetic acid VWR 36289 Solvent
Acetone Sigma Aldrich 34850 Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade  VWR 71001-866 Reagent
Benzene Alfa Aesar AA33290 Solvent
ε-caprolactone  Alfa Aesar A10299-0E Reagent
Chloroform VWR BDH1109 Solvent
Cholesterol Sigma Aldrich C8503 Reagent
Chromium(VI) oxide Sigma Aldrich 232653 Reagent
Copper(I) iodide Strem Chemicals 100211-060 Reagent
D,L-Lactide  Alfa Aesar L09026 Reagent
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Solvent
Diethyl ether  Emd Millipore EX0190 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME  CORNING Cellgo 10-013 Cell Media
Ethanol Alfa Aesar 33361 Solvent
Formaldehyde  SIGMA Life Science F8775 Fixative
Fetal bovine serum, FBS  HyClone SH30071.01 Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe VWR 28320 Filtration
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI Sigma Aldrich 52649 Crosslinker
Iron(III) chloride  Alfa Aesar 12357 Etching agent
Isopropyl alcohol VWR BDH1133 Solvent
Methanol Alfa Aesar L13255 Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Aldrich D80002 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Nickel metal template American Elements Ni-860 Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) ATCC CRL-2266 Cell line
Penicillin streptomycin  Thermo SCIENTIFIC 15140122 Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG Alfa Aesar B22181 Reagent
Sodium azide  VWR 97064-646 Reagent
Sodium bicarbonate AMRESCO 865 Drying salt
Sodium chloride BDH BDH9286 Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S-374 Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma Aldrich S9638 Drying salt
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313 Drying salt
Tetrahydrofuran Alfa Aesar 41819 Solvent
Thiosulfate de sodium AMRESCO 393 Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate Aldrich S3252 Reagent
Toluene Alfa Aesar 22903 Solvent
Triethylamine Sigma Aldrich 471283 Reagent
Trypsin HyClone SH30042.01 Cell Detachment
Olympus FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9 (2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

Tags

Bioengineering Liquid Crystal Elastomer 3D porøs Stilladser Cell Stilladser Cell Justering Cell Direktionalitet biokompatible
Syntese af Biokompatible Liquid Crystal Elastomer Skum som Cell Stilladser til 3D Spatial Cell Cultures
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prévôt, M. E., Ustunel,… More

Prévôt, M. E., Ustunel, S., Bergquist, L. E., Cukelj, R., Gao, Y., Mori, T., Pauline, L., Clements, R. J., Hegmann, E. Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (122), e55452, doi:10.3791/55452 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter