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Bioengineering

3 डी स्थानिक सेल संस्कृतियों के लिए सेल Scaffolds के रूप में Biocompatible लिक्विड क्रिस्टल Elastomer Foams का संश्लेषण

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/55452
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 3, 3, 1
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

Summary

इस अध्ययन के लिए 3 डी, बायोडिग्रेडेबल, फोम की तरह सेल biocompatible पक्ष-श्रृंखला लिक्विड क्रिस्टल इलास्टोमर (LCEs) के आधार पर मचान तैयार करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करता है। कोंफोकल माइक्रोस्कोपी प्रयोगों चलता है कि फोम की तरह LCEs सेल लगाव, प्रसार, और C2C12s myoblasts की सहज संरेखण के लिए अनुमति देते हैं।

Abstract

यहाँ, हम एक 3 डी, बायोडिग्रेडेबल, फोम की तरह सेल पाड़ के एक कदम-दर-कदम तैयारी प्रस्तुत करते हैं। इन scaffolds पार जोड़ने पक्ष-श्रृंखला पेंडेंट समूहों के रूप में कोलेस्ट्रॉल इकाइयों की विशेषता स्टार ब्लॉक सह पॉलिमर, smectic-ए (SMA) लिक्विड क्रिस्टल इलास्टोमर (LCEs) में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा तैयार किए गए थे। फोम की तरह मचान,, धातु टेम्पलेट का उपयोग कर तैयार परस्पर microchannels की सुविधा है, उन्हें 3 डी सेल संस्कृति scaffolds के रूप में उपयुक्त बना रही है। धातु फोम का और एक 3 डी सेल पाड़ कि पारंपरिक झरझरा टेम्प्लेट की फिल्मों, लेकिन बड़े पैमाने पर परिवहन के भी बेहतर प्रबंधन (यानी, पोषक तत्वों, गैसों, कचरे की तुलना में न केवल उच्च कोशिका प्रसार को बढ़ावा देता है elastomer परिणाम का नियमित रूप से संरचना के संयुक्त गुण , आदि)। धातु टेम्पलेट की प्रकृति फोम आकार (यानी, रोल या फिल्मों) की आसान हेरफेर के लिए अनुमति देता है और interconnec संरक्षण, जबकि अलग सेल के अध्ययन के लिए विभिन्न रोमकूप आकार के मचानों की तैयारी के लिएटेम्पलेट के टेड झरझरा प्रकृति। एचिंग की प्रक्रिया इलास्टोमर के रसायन शास्त्र को प्रभावित नहीं करता है, उनके biocompatible और बायोडिग्रेडेबल प्रकृति के संरक्षण। हम बताते हैं कि इन smectic LCEs, जब व्यापक समय अवधि के लिए बड़ा हो गया, नैदानिक ​​प्रासंगिक और जटिल ऊतक निर्माणों के अध्ययन के विकास और कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देने के लिए सक्षम है।

Introduction

वहाँ जैविक और biocompatible सिंथेटिक सेल के अध्ययन में और सेल लगाव और प्रसार 1, 2, 3, 4, 5 में लक्ष्य ऊतक पुनर्जनन के लिए आवेदन के लिए बनाया गया सामग्री के कई उदाहरण हैं। वहाँ biocompatible सामग्री, लिक्विड क्रिस्टल इलास्टोमर (LCEs) के रूप में जाना के कुछ उदाहरण, कि आणविक अनिसोट्रोपिक 6, 7 आदेश देने के साथ बाहरी उत्तेजनाओं का जवाब हो सकता है किया गया है। LCEs उत्तेजनाओं संवेदनशील सामग्री है कि ऑप्टिकल कार्यक्षमता और लिक्विड क्रिस्टल 8 की आणविक आदेश, 9 के साथ इलास्टोमर के यांत्रिक और लोचदार गुण गठबंधन कर रहे हैं। LCEs बाहरी stim के जवाब में आकार में परिवर्तन, यांत्रिक विरूपण, लोचदार व्यवहार, और ऑप्टिकल गुण अनुभव कर सकते हैंउली (यानी।, गर्मी, तनाव, प्रकाश, आदि) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16। इससे पहले के अध्ययनों से पता चला है कि लिक्विड क्रिस्टल (LCS) विकास और 4 कोशिकाओं, 17 के उन्मुखीकरण को समझ सकते हैं। यह LCEs सेल मचान और संरेखण सहित जैविक रूप से और चिकित्सकीय प्रासंगिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है कि तब संभव ग्रहण करने के लिए है। हम पहले एक "स्विस पनीर प्रकार" झरझरा आकृति विज्ञान 6, 18 की विशेषता smectic biocompatible, बायोडिग्रेडेबल, कच्चा-ढाला, और पतली LCEs फिल्मों की तैयारी सूचना दी है। हम यह भी कोशिकाओं की वृद्धि 19 <के लिए scaffolds जैसे गोलाकार आकृति विज्ञान के साथ nematic biocompatible LCEs तैयारsup> 20। हमारा काम ब्याज 21 के ऊतक के उन मैच के लिए सामग्री के यांत्रिक गुणों में बदलाव करने के उद्देश्य से किया गया था। इसके अलावा, इन अध्ययनों elastomer सेल बातचीत, साथ ही सेलुलर प्रतिक्रिया जब इलास्टोमर बाहरी उत्तेजनाओं के अधीन हैं समझने पर ध्यान केंद्रित।

मुख्य चुनौतियों LCEs elastomer मैट्रिक्स के माध्यम से सेल लगाव और पारगमन के लिए अनुमति देने के लिए की सरंध्रता अनुरूप बनाने के लिए भाग में और बेहतर जन परिवहन के लिए थे। इन पतली फिल्मों 6 की सरंध्रता मैट्रिक्स के थोक के माध्यम से सेल पारगमन के लिए अनुमति दी है, लेकिन सभी pores पूरी तरह से परस्पर थे या एक अधिक नियमित रूप से (सजातीय) छेद के आकार की थी। हम तो गोलाकार morphologies के साथ biocompatible nematic एलसीई इलास्टोमर को सूचना दी। ये nematic इलास्टोमर लगाव और कोशिकाओं के प्रसार के लिए अनुमति दी है, लेकिन छेद के आकार केवल 10-30 सुक्ष्ममापी, जो रोका से लेकर या इनमें से उपयोग सीमितसेल लाइनों 19, 20 की एक व्यापक विविधता के साथ इलास्टोमर।

कुंग एट अल द्वारा पिछले काम। एक "बलि" धातु टेम्पलेट का उपयोग कर ग्राफीन फोम के गठन से संबंधित पता चला है कि प्राप्त ग्राफीन फोम एक बहुत ही नियमित रूप से झरझरा आकृति विज्ञान चुना धातु टेम्पलेट 22 से तय था। यह पद्धति सरंध्रता और छेद के आकार का पूरा नियंत्रण प्रदान करता है। इसी समय, अलग टेम्पलेट के गठन के लिए फोम तैयारी करने से पहले आकार आघातवर्धनीयता और धातु टेम्पलेट के लचीलेपन की अनुमति। ऐसी सामग्री लीचिंग 23, गैस templating 24, या विद्युत काता फाइबर 25 के रूप में अन्य तकनीकों, 26 भी झरझरा सामग्री तैयार करने के लिए क्षमता प्रदान करते हैं, लेकिन वे और अधिक समय लेने वाली और, कुछ मामलों में, छेद के आकार तक सीमित है कर रहे हैं केवल कुछ माइक्रोमीटर। झागकी तरह 3 डी LCEs का उपयोग कर धातु टेम्पलेट्स एक उच्च सेल लोड के लिए अनुमति देने के लिए तैयार; एक बेहतर प्रसार की दर; सह संवर्धन; और, पिछले नहीं बल्कि कम से कम, बेहतर जन परिवहन प्रबंधन (यानी, पोषक तत्वों, गैस और अपशिष्ट) पूर्ण ऊतक विकास सुनिश्चित करने के लिए 27। फोम की तरह 3 डी LCEs भी सेल का मिलान भी सुधार करने के लिए दिखाई देते हैं; इस कोशिका वृद्धि और सेल उन्मुखीकरण संवेदन नियंत्रण रेखा पेंडेंट के संबंध में सबसे अधिक संभावना है। एलसीई भीतर नियंत्रण रेखा moieties की उपस्थिति एलसीई पाड़ के भीतर सेल स्थान के संबंध में सेल का मिलान को बढ़ाने के लिए प्रकट होता है। कोशिकाओं, एलसीई की struts भीतर संरेखित जबकि कोई स्पष्ट रुख जहां struts एक साथ (जंक्शनों) 27 में शामिल होने मनाया जाता है।

कुल मिलाकर, हमारे एलसीई एक सेल समर्थन माध्यम के रूप में सेल पाड़ मंच धुन पर अवसर प्रदान करता है elastomer आकृति विज्ञान और लोचदार संपत्तियों और विशेष रूप से (व्यक्तिगत) प्रकार की कोशिकाओं के संरेखण निर्देशित करने के लिए एक आदेश दिया है, स्थानिक व्यवस्था बनाने के लिए ओच कोशिकाओं जीवन प्रणालियों के समान है। इसके अलावा एक पाड़ को बनाए रखने और लंबी अवधि के सेलुलर विकास और प्रसार के निर्देशन में सक्षम प्रदान करने से, LCEs भी गतिशील प्रयोगों, जहां सेल अभिविन्यास और बातचीत मक्खी पर संशोधित किया जा सकता के लिए अनुमति देते हैं।

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Protocol

नोट: 3 डी एलसीई फोम की तरह तैयारी 3 हाथ के स्टार ब्लॉक copolymer प्रयोग करने के लिए निम्न चरणों के चित्र 1 में दिखाया गया है। नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) लक्षण वर्णन के लिए, स्पेक्ट्रा एक Bruker DMX 400 मेगाहर्ट्ज साधन पर कमरे के तापमान पर deuterated क्लोरोफॉर्म (CDCl 3) में दर्ज की गई और आंतरिक रूप से 7.26 पर अवशिष्ट चोटियों दर्शाया जाता है। फूरियर को बदलने अवरक्त (एफटी आईआर) स्पेक्ट्रा एक Bruker वेक्टर 33 एफटी आईआर तनु कुल परावर्तन मोड का उपयोग कर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर दर्ज हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण के लिए, यह उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक कपड़े (पीपीई) पहनने के लिए महत्वपूर्ण है।

1. α-क्लोरो ε-caprolactone का संश्लेषण (Monomer) (जेरोम एट अल में प्रक्रिया के अनुसार। 28)

  1. संश्लेषण शुरू करने से पहले, 3-chloroperbenzoic एसिड की 27 ग्राम शुद्ध इस प्रकार है:
    1. आसुत जल के 800 एमएल में, सोडियम की 1.28 ग्राम जोड़नेफॉस्फेट अकेले आधार monohydrate और सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय heptahydrate की 8.24 ग्राम। और रिजर्व इस समाधान के 30 एमएल (सोडियम हाइड्रॉक्साइड या हाइड्रोक्लोरिक एसिड का प्रयोग करके) 7.4 पीएच समायोजित करें; इस बफर समाधान है।
    2. एक जुदा कीप का प्रयोग, Diethyl ईथर के 35 एमएल में 3-chloroperbenzoic एसिड भंग। बफर समाधान के 10 एमएल के साथ जैविक समाधान धो (कदम 1.1.1 में तैयार किया।)। धोने तीन बार दोहराएँ।
    3. जैविक समाधान के लिए सीधे सोडियम सल्फेट के 3 जी जोड़ें; इस सुखाने एजेंट जैविक समाधान से पानी अवशोषित।
    4. सुखाने एजेंट दूर करने के लिए समाधान फ़िल्टर। 850 मिलीबार और 40 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी वाष्पक का उपयोग करके कम दबाव में छानना ध्यान लगाओ।
  2. एक अल्ट्रासोनिक स्नान में सरगर्मी से सूखी dichloromethane के 150 एमएल में शुद्ध 3-chloroperbenzoic एसिड की 18.5 ग्राम solubilize; इस प्रक्रिया में आम तौर पर 20 मिनट लगते हैं। एक जुदा कीप के अंदर समाधान रखें।
  3. एक दो गर्दन के अंदर, राउंड पेंदी वाले फ्लास्क,नाइट्रोजन गैस के तहत एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर शुष्क dichloromethane के 15 एमएल में 2-chlorocyclohexanone की 13.1 ग्राम भंग। सरगर्मी रखें।
  4. कदम 1.3 में जुदा दो गर्दन कुप्पी के लिए (कदम 1.2 से) 3-chloroperbenzoic एसिड समाधान युक्त कीप फिट। नाइट्रोजन गैस के साथ सिस्टम फ्लश। ताकि chloroperbenzoic एसिड समाधान 2-chlorocyclohexanone समाधान (1 ड्रॉप हर दूसरे सेकंड) में dropwise गिर जाता है जुदा कीप के उद्घाटन समायोजित करें और 96 घंटे के लिए नाइट्रोजन गैस के तहत मिश्रण सरगर्मी जारी है।
  5. 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण कूल मीटर -chlorobenzoic एसिड (एम -CBA) प्रतिफल तलछट।
  6. मीटर -chlorobenzoic एसिड (एम -CBA) फ़िल्टर और सोडियम thiosulfate, सोडियम बाइकार्बोनेट, और सोडियम क्लोराइड के संतृप्त समाधान के साथ शेष समाधान धोने।
  7. 850 मिलीबार और 40 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में विलायक निकालें। हल्के पीले, चिपचिपा liqu शुद्ध2.3 Torr पर कम दबाव और 96 डिग्री सेल्सियस के तहत आसवन द्वारा आईडी।
  8. संश्लेषण निम्नलिखित 1 एच एनएमआर चोटियों का उपयोग कर की सफलता की निगरानी करें। 1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, CDCl 3, δ [पीपीएम]): 4.75-4.68 (एम, 1H, सी एच ClCO), 4.37-4.26 (एम, 1H, सी एच 2 ओ), 4.18-4.05 (एम, 1H , सी एच 2 ओ), और 2.06-1.58 (एम, 6H, -सी एच 2 -) 6, 27।

2. के संश्लेषण α-तीन हाथ स्टार ब्लॉक Copolymer (SBC-αCl) अंगूठी उद्घाटन Copolymerization द्वारा (शर्मा एट अल। 6 और Amsden एट अल। 29)

  1. संश्लेषण से पहले, एक 2% (v / v) 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane की टोल्यूनि में समाधान के साथ यह भरने और 24 के बारे में ज के लिए सरगर्मी से एक 20 एमएल इंजेक्शन की शीशी silanize। isopropyl शराब के साथ कुल्ला और 30 मिनट के लिए 140 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रखकर इसे सूखने।
  2. 3 जोड़ेआसुत ε-caprolactone की 0.64 ग्राम, α-क्लोरो ε-caprolactone की 0.5 ग्राम, और इंजेक्शन की शीशी के लिए ग्लिसरॉल के 0.25 एमएल। 1 मिनट के लिए एक भंवर का उपयोग कर मिला लें।
  3. डी की 4.90 ग्राम, एल -lactide इंजेक्शन की शीशी में जोड़े और नाइट्रोजन के साथ जाने पर उसे साफ। 120 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में इंजेक्शन की शीशी प्लेस डी, एल -lactide पिघल; इस प्रक्रिया आम तौर पर के बारे में 2 घंटे लग जाते हैं। कि सभी सामग्री को अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं सुनिश्चित करें और टिन के 66 μL जोड़ने के लिए एक भंवर का उपयोग कर फिर से मिक्स (द्वितीय) 2-ethylhexanoate (Sn (अक्टूबर) 2) इंजेक्शन की शीशी के लिए।
    नोट: डी, एल -lactide इस प्रक्रिया के दौरान नीचे ठंडा हो जाएगा और ओवन पिघल में फिर से गर्म किया जा करने की आवश्यकता होगी।
  4. सख्ती एक आखिरी बार मिश्रण भंवर का उपयोग कर और नाइट्रोजन के साथ फ्लश।
  5. एक रबर डाट के साथ इंजेक्शन की शीशी को बंद करें। एक सुई एक वैक्यूम ट्यूब से जुड़ा जगह रबर डाट के माध्यम से (घर वैक्यूम आमतौर पर पर्याप्त है)। निर्वात को चालू करें और, एक लौ का उपयोग कर, कांच की लंबी गर्दन पिघल, जी जब तक धीरे-धीरे घुमालड़की पर ही गिर। रबर डाट पिघला नहीं करने के लिए सावधान रहें। एक बार इंजेक्शन की शीशी लौ-सील है, 48 घंटे के लिए 140 डिग्री सेल्सियस पर एक रेत स्नान, एक ओवन, या उचित हीटिंग तत्व में रखें।
  6. इंजेक्शन की शीशी निकाल कर यह कमरे के तापमान पर ठंडा करते हैं।
  7. सील के निशान पर इंजेक्शन की शीशी तोड़ और dichloromethane के 10 एमएल जोड़कर उच्च चिपचिपा तरल भंग। एक जुदा कीप का हल स्थानांतरित करें।
  8. (चारों ओर -78 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर एक सूखी बर्फ / एसीटोन स्नान का उपयोग ठंडा) एक कुप्पी ठंड मेथनॉल के 100 एमएल युक्त तैयार करें। कुप्पी की चोटी पर जुदा कीप (कदम 2.7) को ठीक करें। ताकि के बारे में दो बूँदें हर दूसरे सेकंड (dropwise) गिर जुदा कीप के उद्घाटन समायोजित करें।
  9. निस्पंदन द्वारा सफेद तलछट (एक कागज फिल्टर का उपयोग कर) को एकत्र करें और 50 और 60 डिग्री सेल्सियस के बीच एक वैक्यूम ओवन में इसे सूखने।
  10. संश्लेषण निम्नलिखित 1 एच एनएमआर और एफटी आईआर चोटियों का उपयोग कर की सफलता की निगरानी करें। 1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, CDCl 3, Δ [पीपीएम]): 5.29-5.03 (एम, सीओसी एच सी एच 3), 4.43-4.25 (एम, सी एच क्लोरीन), 4.24-4.12 (एम, सी एच 2 ओ), 4.11-4.03 (टी, जम्मू = 4.6 हर्ट्ज, सी एच 2 ओ), 3.80-3.68 (एम, सी एच सी एच 2), 3.09-2.64 (व्यापक, है, हे एच), 2.39 (टी, जम्मू = 4.5 हर्ट्ज, α- एच), 2.33 (टी, जम्मू = 5.1 हर्ट्ज, α- एच), और 1.77-1.25 (एम, सी एच 2, सी एच 3); एफटी आईआर (1 / λ [सेमी -1]): 2932 (s), 2,869 (एम), 1,741 (s), 961 (s), 866, और 735 (एम) 6, 27।
    ध्यान दें: एक और अधिक हाइड्रोफिलिक 3 डी एलसीई तैयार करने के लिए, एक रेखीय ब्लॉक copolymer (LBC) एक एसबीसी के बजाय तैयार, ऊपर वर्णित अंगूठी खोलने copolymerization (ROP) प्रक्रिया के बाद।
    1. पोलीएथीलीन ग्लाईकोल (पी.ई.जी.), 3.15 ग्राम ε-caprolactone के 0.3 ग्राम, α-क्लोरो ε-caprolactone की 1.0 ग्राम, और डी के 5.0 ग्राम, एल lactide silanized शीशी मिश्रण करने के लिए जोड़ें।

    3. α-क्लोरीन-तीन शाखा एसबीसी का सिंथेटिक संशोधन αN करने के लिए 3: तीन शैली शाखा एसबीसी (SBC-αN 3) (शर्मा एट अल के अनुसार। 6)

    1. एक गोल पेंदी वाले फ्लास्क में और नाइट्रोजन के तहत, सूखी एन, एन '-dimethylformamide के 30 एमएल में SBC-αCl की 5 ग्राम भंग।
    2. सोडियम azide के 0.22 छ जोड़ें और कमरे के तापमान पर रात भर प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देते हैं।
      सावधानी: सोडियम azide विषैला होता है; उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक कपड़े (पीपीई) पहनते हैं।
    3. एन, कम दबाव में एन '-dimethylformamide 11 मिलीबार और 40 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर निकालें। टोल्यूनि के 30 एमएल में मिश्रण भंग। समाधान नमक का गठन दूर करने के लिए 15 मिनट के लिए 2800 XG पर तीन बार अपकेंद्रित्र। 77 मिलीबार और 40 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में टोल्यूनि लुप्त हो।
    4. 1 एच एनएमआर और एफटी आईआर चोटियों का उपयोग कर azide प्रतिस्थापन की सफलता की निगरानी करें।
      ध्यान दें: -1]): 2,928, 2,108 (रों, azide), 1,754 (s), 1450 (s), 960 (एम), 865 (s), 733 (रों), और 696 (एम)।

    4. Cholesteryl के संश्लेषण 5-Hexynoate (नियंत्रण रेखा आधा भाग) (शर्मा एट अल। 6 और डोनाल्डसन एट अल के अनुसार। 30)

    1. एक गोल पेंदी वाले फ्लास्क में, मिश्रण 5-hexynoic एसिड की 3 जी और dichloromethane के 130 एमएल। 0 डिग्री सेल्सियस के कूल एक बर्फ स्नान का उपयोग।
    2. दूसरे दौर नीचे कुप्पी में, मिश्रण एन, एन '-dicyclohexylcarbodiimide की 8.28 ग्राम, कोलेस्ट्रॉल के 10.3 ग्राम, और 4-dimethylaminopyridine का 0.2 जी।
    3. 1 घंटे के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर कोलेस्ट्रॉल मिश्रण युक्त कुप्पी के लिए 5-hexynoic एसिड समाधान dropwise स्थानांतरण और अंतिम मिश्रण बनाए रखें।
    4. मिश्रण रात भर कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति दें। एक ग्रेड 415 कागज फिल्टर का उपयोग कर निस्पंदन द्वारा जिसके परिणामस्वरूप dicyclohexylurea तलछट निकालें और इसे त्यागें।
    5. 850 मिलीबार और 40 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में छानना ध्यान लगाओ। हेक्सेन के 150 एमएल में एकत्र अवशेषों भंग।
    6. 335 मिलीबार और 40 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में विलायक लुप्त हो। इथेनॉल के 350 एमएल तेल अवशेषों में जोड़े अंतिम उत्पाद लेने के लिए। धो सफेद ठोस इथेनॉल के साथ गठन किया गया और 50 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम के तहत ठोस उत्पाद सूखी।
    7. निम्नलिखित 1 एच एनएमआर और एफटी आईआर चोटियों का उपयोग कर संश्लेषण की निगरानी करें। 1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, CDCl 3, δ [पीपीएम]): 5.39 (घ, जे = 4.7 हर्ट्ज, 1H, सी एच = सी), 4.70-4.58 (एम, 1H, सी एच OCO), 2.44 (टी, जम्मू = 2.5 हर्ट्ज, 2H, सी एच 2 सीओ), 2.34 (एम, 2H, सी एच 2 -सी एच =), 2.31 (एम, 2H, सी एच 2 सी एच 2 -COO), 2.28 (रों, 1H, एचC≡C), 2.27 (घ, जम्मू = 2.3 हर्ट्ज, 2H, ≡CC एच 2), 2.07-1.06 (एम, 2H, सी एच 2, सी एच), 0.94 (रों, 3H, सी एच 3), 0.89 (घ, जम्मू = 1.8 हर्ट्ज, 3H, सी एच 3 सी एच), और 0.88 (घ, जम्मू = 1.8 हर्ट्ज, 6H, सी एच 3 -सी एच), 0.67 (रों, 3H, सी एच 3)। एफटी आईआर (1 / λ [सेमी -1]): 2,830-2,990 (व्यापक और मजबूत चोटी), 2,104 (एम), 1695 (s), 1,428 (एम), 1,135 (एम), 999 (s), 798 (रों), और 667 (रों)।

    5. का सिंथेटिक संशोधन α-एन 3: तीन शैली शाखा SBC अ-Cholesteryl-तीन शाखा एसबीसी (SBC-αCLC) एक अब्द-alkyne Huisgen साइक्लो-अलावा रिएक्शन के माध्यम से ( "क्लिक" रिएक्शन) प्राप्त करने के लिए SBC-चोल (के अनुसार शर्मा एट अल। 6)

    1. एक गोल पेंदी वाले फ्लास्क में, ताजा आसुत tetrahydrofuran की 100 एमएल (THF) में की SBC-αN 3 (1.5 ग्राम) 1 दाढ़ बराबर भंग। 1.2 दाढ़ equivalen जोड़ेcholesteryl 5-hexynoate (1.94 छ), तांबा (आई) के 0.1 दाढ़ बराबर आयोडाइड (0.06 छ) के टी, और triethylamine के 0.1 दाढ़ समकक्ष (0.03 छ)। नाइट्रोजन के तहत 35 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात मिश्रण हलचल।
    2. 357 मिलीबार और 40 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर कम दबाव में विलायक लुप्त हो।
    3. unreacted सामग्री और पक्ष उत्पादों को दूर करने के कमरे के तापमान पर 2800 XG पर क्लोराइड और 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के 80 एमएल में अवशिष्ट मिश्रण भंग।
    4. निम्नलिखित 1 एच एनएमआर और एफटी आईआर चोटियों का उपयोग कर संश्लेषण की निगरानी करें। 1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, CDCl 3, δ [पीपीएम]): 7.54 (रों, सीएच = सी triazole), 5.43-5.34 (एम, सी = सीएच कोलेस्ट्रॉल), 5.10-5.06 (एम, COCHCH 3), 4.68 -4.55 (एम, हे-CH कोलेस्ट्रॉल), 4.24-4.19 (एम, सीएच 2 ओ), 4.18-4.13 (टी, जम्मू = 5.0 हर्ट्ज, सीएच 2 ओ), 4.11-4.05 (टी, जम्मू = 4.4 हर्ट्ज, सीएच 2 ओ), 2.47-2.41 (टी, जम्मू = 4.9 हर्ट्ज, Coch 2), 2.31-2.25 (एम, Coch 2), 2.07-1.02 (एम, सीएच 2 3), 1.05-1.03 (रों, सीएच 2, सीएच 3), 0.96-0.92 (घ, जम्मू = 3.3 हर्ट्ज, सीएच 2, सीएच 3), 0.91-0.87 (दिन, जे = 1.9 हर्ट्ज, जम्मू = 1.8 हर्ट्ज, सीएच 3), और 0.71-0.68 (रों, सीएच 3)। एफटी आईआर (1 / λ [सेमी -1]): 3,260 (s), 2,920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1,370 (s), 1,240 (एम), 1,190 (s), 733 (रों), और 668 (रों)।

    6. 2,2-बीआईएस (1-caprolactone-4-yl) प्रोपेन (crosslinker, बीसीपी) के संश्लेषण (गाओ एट अल। 27 और Albertsson एट अल के अनुसार। 31)

    1. एक गोल पेंदी वाले फ्लास्क में, एक समाधान 2-बिस (4-हाइड्रोक्सी-cyclohexyl) प्रोपेन और एसिटिक एसिड के 52 एमएल के 10.8 ग्राम युक्त तैयार करते हैं।
    2. एसिटिक एसिड के 50 एमएल और आसुत जल के 8 एमएल में एक समाधान क्रोमियम त्रिओक्षिदे की 11 ग्राम युक्त तैयार करें। जबकि, 17 और 20 डिग्री सेल्सियस (जैसे के बीच मिश्रण तापमान को बनाए रखने के लिए एक में कदम 6.1 में तैयार समाधान के लिए इस समाधान dropwise जोड़ेंपानी स्नान); इस dropwise प्रक्रिया 2 घंटे लग जाते हैं। एक बार प्रक्रिया पूरी हो चुकी है, समाधान के बारे में 30 मिनट के लिए हलचल करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. 2-propanol के 50 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर समाधान रातोंरात हलचल।
    4. कम दबाव में गहरा बैंगनी समाधान 137 मिलीबार और 40 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी वाष्पक का उपयोग कर ध्यान लगाओ। आसुत जल तलछट के 300 एमएल जोड़ें; तलछट प्रकाश बैंगनी होना चाहिए।
    5. कच्चे तेल उत्पाद एक ग्रेड 415 कागज फिल्टर का उपयोग कर छानना। आसुत जल के ~ 250 एमएल के साथ या जब तक ठोस सफेद हो जाता है ठोस पदार्थ को धो लें।
    6. 40 डिग्री सेल्सियस पर बेंजीन के 15 एमएल में ठोस पदार्थ भंग और यह 25 डिग्री सेल्सियस पर recrystallize करते हैं।
    7. सूखी क्लोराइड और एक समाधान कुप्पी को dichloromethane के 75 एमएल में 3-chloroperbenzoic एसिड की 6.0 ग्राम युक्त में भंग सूखी diketone की 8.34 ग्राम जोड़ें।
    8. 24 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर समाधान भाटा।
    9. मीटर तलछट 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण कूल
    10. निस्पंदन (एक कागज फिल्टर का प्रयोग करके) द्वारा मीटर -chlorobenzoic एसिड निकालें और कम दबाव में समाधान ध्यान केंद्रित।
    11. 2-heptanone के 200 एमएल के साथ विस्कोस कच्चे उत्पाद धो लें और रात भर में 50 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम के तहत तलछट सूखी।
    12. निम्नलिखित 1 एच एनएमआर और एफटी आईआर चोटियों का उपयोग कर संश्लेषण की निगरानी करें। 1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, CDCl 3, δ [पीपीएम]): 4.42-4.37 (दिन, जे = 14.2, 7.4 हर्ट्ज, 2H, सी एच 2 OC = O), 4.21-4.15 (टी, 2H, जे = 11.3 हर्ट्ज, सी एच 2 OC = O), 2.80-2.75 (डीडीटी, जे = 14.3, 6.5, 1.6 हर्ट्ज, 2H, सी एच 2 सीओओ), 2.63-2.57 (टीटी, जे = 13.3, 2.1 हर्ट्ज, 2H, सी एच 2 सीओओ), 2.04-1.93 (एम, 4H, -सी एच 2 सीएच 2 OC = O), 1.70-1.56 (एम, 4H, -सी एच 2 सी एच 2 सीओओ), 1.48-1.38 (एम, 2H, - सी एच सी (सीएच 3) 2), और 0.84 (रों, 6H, सी एच 3 सी)।
      13. 7. पोरस 3 डी Elastomer मचान का निर्माण या तो hexamethylene diisocyanate (एचडीआई) या 2,2-बीआईएस (1-caprolactone-4-yl) प्रोपेन (बीसीपी) 27 का उपयोग करते हुए crosslinkers (गाओ के अनुसार एट अल। 27) के रूप में

      1. तीन हाथ के elastomer मानव विकास सूचकांक के 0.25 एमएल (या BCP के 0.45 एमएल) जोड़कर SBC-αCLC की 0.75 ग्राम का उपयोग कर मिश्रण और आसुत ε-caprolactone मोनोमर की 0.24 एमएल तैयार करें। Sn (अक्टूबर) 2 के 60 μL जोड़ें। मानव विकास सूचकांक के बजाय बीसीपी का उपयोग कर रहे हैं, तो एक भंवर का उपयोग कर SBC-αCLC और BCP मिश्रण और (यह चरण 2 घंटे तक का समय लग सकता है) जब तक पूरी तरह से बीसीपी पिघला देता है और घुल 140 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रख दें। एक बार जब बीसीपी भंग कर दिया गया है, यह ओवन से बाहर, Sn (अक्टूबर) 2, और भंवर लेने के लिए और।
      2. एक 1 x 4 सेमी धातु टुकड़ा काट कर एक "बलि" निकल फोम टेम्पलेट तैयार करें। कम किसी एक सिरे से यह रोल ताकि अंतिम रोल लगभग एक 1 x 1 सेमी धातु टुकड़ा है (चित्रा 4 देखें)।
        3. <li> एक गिलास शीशी या एल्यूमीनियम पन्नी पैक में निकल फोम रखो और कदम 7.1 में तैयार पूरी तरह से 2 मिनट के लिए फोम कवर करने के लिए मिश्रण डालना। एक पाश्चर pipet के साथ अतिरिक्त मिश्रण निकालें। 80 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रात भर में यह छोड़ दें।
      3. एल्यूमीनियम पन्नी बंद छील या कांच टूट गया। एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, निकल धातु का पर्दाफाश करने के धातु फोम चारों ओर elastomer दाढ़ी।
      4. 1 एम आयरन (III) क्लोराइड (FeCl 3) पानी की 100 एमएल में समाधान तैयार करें। एक फ्लास्क में फोम रखें और FeCl 3 समाधान के 70 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर तीन दिनों के लिए हलचल और हर दिन बदल FeCl 3 समाधान। प्रत्येक परिवर्तन करने से पहले, 0.5 घंटा के लिए आयनित पानी के साथ फोम हलचल।
        नोट: एचिंग की प्रक्रिया आम तौर पर तीन दिनों के बाद पूरा हो गया है। जब तक फोम नरम महसूस यह सुनिश्चित करने के एचिंग की प्रक्रिया को पूरा हो गया है, स्पर्श संपीड़न परीक्षण प्रदर्शन करते हैं। स्पर्श संपीड़न परीक्षण करने के लिए फोम प्रतिरोध एक अवशिष्ट धातु टेम्पलेट की उपस्थिति का संकेत।
      5. ELAST कुल्लाइथेनॉल और एक निर्वात में जगह के साथ ओमर फोम ओवन रातोंरात 40 डिग्री सेल्सियस पर।
      6. सामग्री स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM), अंतर स्कैनिंग calorimetry (डीएससी), यांत्रिक संपीड़न परीक्षण, और थर्मल gravimetric विश्लेषण (TGA) 27 का उपयोग कर की विशेषताएँ हैं।
        नोट: एक और अधिक हाइड्रोफिलिक 3 डी एलसीई की तैयारी के लिए, एलबीसी कदम 7.5 में वर्णित चरणों का पालन (सुनिश्चित करें कि एलबीसी भी एक नियंत्रण रेखा आधा भाग होता है बनाने) के साथ एसबीसी की जगह।

      एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं के साथ इलास्टोमेर मचान की 8. सीडिंग और संस्कृति स्टेराइल तकनीकों का उपयोग करते हुए

      1. इसे दो बार धोने के 70% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ द्वारा elastomer नसबंदी। 10 मिनट के लिए यूवी विकिरण प्रदर्शन और 70% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ धोएं। इसे दो बार कुल्ला बाँझ पानी का 1 एमएल और फॉस्फेट बफर खारा के 1 एमएल (पीबीएस) के साथ। 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में इलास्टोमर रखें।
      2. एसएच SY5Y युक्त 90% Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) supplem के लिए कोशिकाओं की वृद्धि मध्यम तैयार करें10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (कलम strep) के साथ ented।
      3. एक hematocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती के बाद, 1.5 x 10 5 एसएच SY5Y कोशिकाओं विकास का माध्यम के 100 μL (बीज समाधान) में निलंबित कर दिया तैयार करते हैं। एक बूंद के रूप में यह सुनिश्चित करने के इलास्टोमर की चोटी पर समाधान जोड़ें।
      4. कोशिका आसंजन को बढ़ावा देने के 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर वरीयता प्राप्त इलास्टोमर सेते हैं। विकास का माध्यम के 0.5 एमएल जोड़ें। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर से सेते हैं।
      5. मध्यम पीबीएस के 1 एमएल के साथ धोने के बाद हर दूसरे दिन बदलें।

      9. Elastomer निर्माण का सूक्ष्म इमेजिंग

      1. कोशिकाओं 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ इलास्टोमर पर उगाया को ठीक करें। 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में तीन बार के 3 एमएल से रिंस और एक संलग्न coverslip के साथ एक संस्कृति डिश में तय हो गई कोशिकाओं के साथ elastomer जगह।
        सावधानी: पीएफए ​​विषैला होता है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक कपड़े (पीपीई) पहनें।
      2. स्टेडियम4 ', 10 मिनट के लिए पीबीएस के 500 μL में 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के 0.1% के साथ तय हो गई नमूनों में और 5 मिनट के लिए पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार कुल्ला।
      3. इसके तत्काल बाद छवि इलास्टोमर DAPI प्रतिदीप्ति साथ confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, छवि के ढेर है कि नमूना अवधि प्राप्त करने।
        नोट: यहाँ, छवि के ढेर एक 20X उद्देश्य और एक 60x उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त हुए थे।
      4. ऑप्टिकल कोंफोकल छवि ImageJ 32 का उपयोग कर के ढेर का विश्लेषण करें।

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Representative Results

इस रिपोर्ट में एक निकेल धातु टेम्पलेट का उपयोग कर सेल संस्कृति के लिए एक पाड़ के रूप में एक झरझरा 3 डी एलसीई की तैयारी विधि को दर्शाता है। प्राप्त 3 डी एलसीई एक जटिल परस्पर चैनल नेटवर्क इतना आसान सेल घुसपैठ के लिए अनुमति देता है, साथ ही अधिक उपयुक्त जन परिवहन 27 को दर्शाता है। यह पाया गया कि कोशिकाओं को पूरी तरह से परस्पर चैनल नेटवर्क घुसना करने में सक्षम हैं और यह भी एलसीई भीतर संरेखित करने के लिए सक्षम हैं। इधर, एक धातु निकल फोम (99% नी, 860 का घनत्व ग्राम / सेमी 2) ग्राफीन फोम तैयारी पहले से कुंग एट अल द्वारा रिपोर्ट करने के लिए एक समान दृष्टिकोण निम्नलिखित चुना गया था। 22। धातु फोम बहुलक पूरी तरह से कवर किया सभी धातु struts के साथ, casted था। धातु फोम आकार और घनत्व के चयन महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एलसीई के अंतिम आकृति विज्ञान प्रदान और ब्याज की ऊतक वातावरण नकल उतार में मदद कर सकते हैं,।

डी, एल lactide (चित्रा 2) कर रहे हैं। अंतिम उत्पाद एक हाइड्रोफोबिक 3-हाथ SBC है। 4 और 6 हथियार, pentaerythritol और dipentaerythritol साथ ग्लिसरॉल नोड की जगह द्वारा किए गए के साथ SBCs क्रमश: पहले से 18 सूचित किया गया है। एक और अधिक हाइड्रोफिलिक एसबीसी के लिए, केंद्रीय नोड (प्रोटोकॉल नोट देखें) oligoethylene ऑक्साइड से बदला गया। हालांकि, एक रेखीय ब्लॉक copolymer 27 में oligoethylene ऑक्साइड परिणामों के साथ ग्लिसरॉल की जगह। हम योन्स एट अल से एक संशोधित संश्लेषण का इस्तेमाल किया। 29। संशोधित संस्करण एक संशोधित ε-सीए के उपयोग के लिए अनुमति देता हैदो अलग अलग स्थानों, अल्फा और गामा कार्बोनिल से 6 में एक हलोजन समूह के साथ prolactone। एक बार जब एसबीसी बनाई है, संशोधित ε-caprolactone ब्लॉक एक azide समूह के साथ हलोजन परमाणु के विस्थापन ग्रस्त है। Azide समूह द्वारा हलोजन समूह के विस्थापन 2,100 सेमी की उपस्थिति के द्वारा की पुष्टि की है - 1 बैंड तनु कुल परावर्तन का उपयोग कर (एटीआर) एफटी आईआर (चित्रा 3)। azide समूह बाद में एक पक्ष के साथ अंतिम स्टार ब्लॉक copolymer प्राप्त करने, सहसंयोजक स्टार ब्लॉक alkyne-azide Huisgen के cycloaddition प्रतिक्रिया (यह भी एक "क्लिक प्रतिक्रिया" के रूप में जाना जाता है) का उपयोग कर copolymer के लिए नियंत्रण रेखा आधा भाग (cholesteryl hexynoate) संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है -chain कोलेस्ट्रॉल पेंडेंट इकाई (SBC-चोल)। Triazole अंगूठी के गठन 2100 सेमी के लापता होने से इसकी पुष्टि कर रहा है - 1 बैंड और एक सिंग्लेट 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा में 7.30 पीपीएम पर मनाया की उपस्थिति (चित्रा देखना3)। हमने हाल ही में क्रियाशील ε -CL 6 पर कार्बोनिल करने के लिए एक हलोजन समूह या तो अल्फा की नियुक्ति के प्रभाव (α -Br) या गामा (γ-क्लोरीन) पर सूचना दी है। यह ध्यान देने योग्य है कि 4-हाथ और 6 हाथ के केंद्रीय कोर के साथ एसबीसी सह पॉलिमर में केंद्रीय नोड की जगह प्राप्त LCEs यांत्रिक गुणों पर एक प्रभाव है, क्योंकि केंद्रीय नोड्स दोनों आरंभकर्ताओं और आंतरिक पार linkers 18 के रूप में सेवा ।

एक बार जब SBC-चोल तैयार किया गया है और पूरी तरह से विशेषता, तिर्यक एक धातु टेम्पलेट का उपयोग कर प्रक्रिया फोम तैयारी को अंतिम चरण में है। SBC-चोल hexamethylene diisocyanate (एचडीआई, crosslinker), ε-caprolactone, और Sn (OCT) 2 के साथ मिश्रित किया गया था (ROP उत्प्रेरक, कदम 7.1 देखें)। बिस-caprolactone (बीसीपी) crosslinker, मानव विकास सूचकांक के साथ बदल दिया गया था जैसा कि पहले की सूचना दी। धातु फोम में कटौती करने और वांछित च के आकार का हैORM (चित्रा 4)। फोम तैयारी, अर्थात् प्राथमिक सरंध्रता (LCEF पीपी) और प्राथमिक / माध्यमिक सरंध्रता (LCEF पी + सपा) के लिए दो रास्ते हैं, पहले से सूचित किया गया है। इधर, LCEF पी + सपा, या "डुबकी" विधि, प्रस्तुत किया जाता है, जहां निकल टेम्पलेट जल्दी से बहुलक मिश्रण में डूबा हुआ है। धातु फोम सभी धातु struts पूरी तरह से बहुलक मिश्रण में डूब के साथ एल्यूमीनियम पन्नी या एक सिंटिलेशन बहुलक मिश्रण युक्त शीशी से बना एक कंटेनर के अंदर रखा गया है,। अतिरिक्त बहुलक मिश्रण ध्यान से हटा दिया है। इस बहुलक से ढके निकल टेम्पलेट 80 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रात भर रखा गया है, अभी भी कंटेनर के अंदर,। तिर्यक के बारे में 2 घंटे के लिए उत्प्रेरक की उपस्थिति में किया जाता है। तिर्यक प्रक्रिया के बाद, बहुलक से ढके निकल टेम्पलेट एल्यूमीनियम पन्नी बंद छीलने या कांच कंटेनर तोड़ कर अपने कंटेनर से हटा दिया है। अतिरिक्त बहुलक ध्यान से बहुलक से ढके निकल templ से मुंडा हैनिकल टेम्पलेट के किनारों को बेनकाब करने के खाया और एक संतृप्त FeCl 3 समाधान (चित्रा 5) के साथ एक कंटेनर के अंदर रखा। कुछ ही घंटों के बाद, निकल लगभग पूरी तरह से हटा दिया जाता है, और केवल एलसीई फोम विआयनीकृत (डीआई) पानी निकल / FeCl 3 समाधान को खत्म करने के साथ rinsed है। एलसीई फोम फिर से एक संतृप्त FeCl 3 समाधान के साथ एक कंटेनर के अंदर रखा और दो बार डि पानी से rinsed है। बाद एचिंग की प्रक्रिया को पूरा हो गया है और पूरे निकल टेम्पलेट पूरी तरह से निकाल दिया जाता है, एलसीई फोम खोखले struts (चित्रा 6) के साथ एक परस्पर चैनल नेटवर्क को दर्शाता है। चित्रा 6 आंतरिक एलसीई फोम आकृति विज्ञान स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग कर मनाया को दर्शाता है। एलसीई फोम struts खोखला कर रहे हैं, और कुल मिलाकर नियमित रूप से आकृति विज्ञान निकल फोम टेम्पलेट पर निर्भर है।

इससे पहले, बीसीपी के उपयोग के कई चरणों की आवश्यकता समाधान में रखने के लिएtion (यानी, पिघल), क्योंकि बीसीपी के रूप में समाधान कुछ डिग्री से ठंडा जैसे ही recrystallize शुरू होता है (140 डिग्री सेल्सियस से कमरे के तापमान को Sn (अक्टूबर) 2 जोड़ने के लिए, कदम 7.1 देखें)। इस धातु फोम और बहुलक मिश्रण तिर्यक से पहले चुनौती देने के हेरफेर में आता है। एक crosslinker जब बीसीपी का उपयोग करने से एक तेजी से crosslinking समय के लिए अनुमति दी के रूप में मानव विकास सूचकांक के उपयोग। जबकि मानव विकास सूचकांक कमरे के तापमान पर एक तरल है बीसीपी, कमरे के तापमान पर एक ठोस है, 140 डिग्री सेल्सियस के गलनांक साथ। crosslinkers के चुनाव सीधे, तैयारी के समय को प्रभावित करता है और हमारे मामले में, 140 से 80 डिग्री सेल्सियस तक तापमान कम तिर्यक, यह भी elastomer तैयारी को कम करने।

एलसीई फोम संपीड़न विरूपण (मूवी 1) का उपयोग कर परीक्षण किया गया। एलसीई आकार में एक 70% कमी समग्र आयामों पर कोई प्रभाव नहीं के साथ मनाया जाता है। एलसीई से संपीड़न के जारी होने पर यह पूरी तरह से अपने मूल रों ठीक होhape और आकार। माना जाता है कि एलसीई सामग्री में लिक्विड क्रिस्टल moieties की उपस्थिति महत्वपूर्ण, इलास्टोमर कोलेस्ट्रॉल ε -caprolactone ब्लॉक के बिना एक ही शर्त के तहत तैयार अपने मूल आकार उबर नहीं पाया है और खुद में ढह के रूप में है।

एक बार जब एलसीई फोम प्राप्त किया गया है, वे neuroblastomas (एसएच SY5Y) मानक सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग के साथ वरीयता प्राप्त होने के लिए तैयार थे। एलसीई फोम 70% इथेनॉल में दो बार धोया और सेल बोने से पहले पीबीएस के साथ तीन बार rinsed थे। सेल बोने के 2-3 दिनों के भीतर, कोशिकाओं 3 डी एलसीई नेटवर्क की दीवारों से संलग्न करने के लिए देखा गया। पूरी तरह से सेल लगाव और विस्तार एलसीई नेटवर्क के भीतर का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं 30 दिनों (चित्रा 7) के बाद तय किया गया था। प्रकोष्ठों नियत ना DAPI के साथ दाग, और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged। कोशिकाओं, प्रचूर मात्रा में पाए से जुड़ी है, और बड़े पैमाने पर 3 डी एलसीई पाड़ नेटवर्क को कवर करने के लिए विस्तारित पाए गए। आगे कीअधिक, विस्तृत विश्लेषण सेल नाभिक बढ़ाव, जो ज्यादातर मामलों में 3 डी एलसीई पाड़ नेटवर्क के घुमावदार वर्गों से प्रभावित नहीं था पता चला। सेल बढ़ाव भी सेल का मिलान करने के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है और सबसे अधिक संभावना प्रस्तुत एलसीई की smectic-ए चरण विशेषता का परिणाम है। यह पहले से C2C12 कोशिकाओं 14 दिनों के 27 के बाद से वृद्धि हुई में मनाया गया। इस अध्ययन में, हम चाहते हैं कि कोशिकाओं 14 दिन से अधिक के लिए पैदा करना जारी रखने के लिए दिखाने; इस अकेले C2C12 कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है। एलसीई फोम के उपयोग के लगभग किसी भी सेल लाइन का विस्तार किया जा सकता है। 3 डी एलसीई फोम की तरह मचानों पर बढ़ कोशिकाओं 2 डी scaffolds की तुलना में अधिक बड़े पैमाने पर परिवहन क्षमता से लाभ। 2 डी scaffolds में, कोशिकाओं को आमतौर पर परतों में बड़े होते हैं, एक दूसरे के ऊपर। ऊपरी परतों पर बढ़ कोशिकाओं केवल जो कि सभी पोषक तत्वों के लिए पूरा उपयोग, गैस, और अपशिष्ट हटाने (मास परिवहन) होती है। निचली परतों के भीतर कोशिकाओं को पोषक तत्वों का उपयोग करने में असमर्थ हैं, और वहाँ सेल घ के एक उच्च डिग्री हैइस मामले में Eath। 3 डी scaffolds के भीतर, कोशिकाओं लंबी अवधि के सेल और ऊतक उत्थान के अध्ययन की अनुमति, एक अधिक कुशल (2 डी scaffolds की तुलना में) पोषक तत्वों, विकास कारकों और गैसों की पहुंच है। सेल कचरा प्रबंधन (अपशिष्ट को हटाने के) 3 डी एलसीई फोम की तरह मचान का उपयोग कर भी 2 डी scaffolds की तुलना में अधिक प्रभावी है। LCEs की सरंध्रता (और / या अन्य संरचनात्मक गुणों) तेजी से बड़े पैमाने पर परिवहन और सेल लोड हो रहा है वृद्धि हुई कम झरझरा (या अन्य) मैट्रिक्स, मीडिया की इजाजत दी और मैट्रिक्स के मध्य क्षेत्रों के लिए सेलुलर पहुँच की तुलना के लिए अनुमति देता है। यह एलसीई मंच ट्यूनेबल प्राथमिक और अमर सेल लाइनों के कई प्रकार, मांसपेशियों, तंत्रिका, और त्वचा, दूसरों के बीच सहित के विकास, साथ ही बहु सेलुलर संस्कृति सिस्टम का समर्थन करने के लिए है। अनिवार्य रूप से, इस मंच के लाभों में से एक के बाद से यह विस्तारित अवधि के लिए कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं और प्रणालियों को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, क्षमता और अधिक बारीकी से emul निर्माण में कोशिकाओं की कई परतों विकसित करने के लिएआटेस प्राकृतिक वातावरण।

आकृति 1
चित्रा 1: सामान्य प्रक्रिया कदम-दर-कदम तैयारी और एलसीई फोम के लक्षण वर्णन का वर्णन। जानकारी के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: 3 हाथ के एसबीसी की Crosslinking योजना। फोम की तरह LCEs की तैयारी के लिए एक निकल धातु टेम्पलेट की उपस्थिति में पार linkers के रूप में biscaprolactone या मानव विकास सूचकांक का उपयोग कर 3-हाथ एसबीसी का तिर्यक योजना दिखाया गया है। इस figu का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंकर रहे हैं।

चित्र तीन
चित्र 3: 1,2,3-triazole गठन (सफल "क्लिक" प्रतिक्रिया) 1 एच एनएमआर और एफटी आईआर के बाद की योजना। Azide समूह द्वारा हलोजन समूह के विस्थापन 2,100 सेमी की उपस्थिति के द्वारा की पुष्टि की है - 1 बैंड का उपयोग तनु कुल परावर्तन (एटीआर) एफटी आईआर। 1 बैंड और एक सिंग्लेट की उपस्थिति, 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा में 7.30 पीपीएम पर मनाया - triazole अंगूठी के गठन 2100 सेमी के लापता होने से पुष्टि की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: ऑप्टिकल छवियोंतिर्यक करने से पहले विभिन्न फोम आकार के। धातु फोम कटौती और वांछनीय फार्म के लिए आकार का, जैसा कि दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: से पहले (ए) और के बाद (बी) तिर्यक निकल फोम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्र 6: एलसीई फोम आकृति विज्ञान स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग करते हुए मनाया। पर SBC आधारित (ए और बी) और एलबीसी आधारित (ग एलसीई फोम के प्रतिनिधि SEM छवियाँ घ) नी-860 धातु टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए इलास्टोमर दिखाए जाते हैं। तीर खोखले struts संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्र 7: Confocal micrographs एसएच SY5Y 30 दिनों बोने के बाद elastomer फोम से जुड़ी कोशिकाओं के DAPI से सना हुआ नाभिक प्रदर्शित। 2 डी छवियों z -direction में खड़ी कर रहे थे, और XZ में पार अनुभाग छवियों - और YZ -planes बनाये गये थे। छवियों चलता है कि एसएच SY5Y कोशिकाओं (चमकदार धब्बे) जुड़ा हुआ है और elastomer फोम में खोखले चैनलों की दीवारों के भीतर का विस्तार किया। कोशिकाओं स्थानिक कई परतों में विस्तार और (के रूप में XZ में दिखाया गया है निर्माण के माध्यम से 100 सुक्ष्ममापी से अधिक बढ़ाया है - और YZ विमान छवि पार सेकंडमाहौल)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1
मूवी 1: विरूपण और एक एलसीई रोल की वसूली की वीडियो छवियों। यह वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

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Discussion

तरल क्रिस्टलीय इलास्टोमर हाल ही में अपने उत्तेजनाओं जवाबदेही के कारण biocompatible सेल scaffolds के रूप में अध्ययन किया गया है। वे सेल scaffolds के रूप में आदर्श प्लेटफॉर्म साबित हो गया है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण कारक है जब की तैयारी कर रहा है और एक नया एलसीई पाड़ को डिजाइन को ध्यान में रखना सरंध्रता है। Leachable ठोस 23 या गैसों के समावेश हमेशा सजातीय सरंध्रता या पूरी तरह से जुड़े छिद्रों में परिणाम नहीं करता है। कि बाहर etched जा सकता है एक धातु टेम्पलेट का उपयोग न केवल एक और अधिक संगठित और नियमित रूप से आंतरिक संरचना के लिए अवसर प्रदान करता है, लेकिन यह भी छेद के आकार और घनत्व के चयन के लिए अनुमति देता है। यह सीधे पहले से ग्राफीन फोम 22 की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया धातु टेम्पलेट से संबंधित है। धातु टेम्पलेट्स भी आकार बनाने के लिए अवसर पहले एलसीई तिर्यक के लिए, संभावनाओं की एक विशाल सरणी की अनुमति नियमित सरंध्रता डी के साथ परिष्कृत और जटिल आर्किटेक्चर बनाने के लिए प्रदान करते हैंबारीकी से अंतर्जात वातावरण सदृश पर हस्ताक्षर किए। फोम LCEs इस पद्धति का उपयोग कर तैयार सेल सामग्री का बेहतर अध्ययन और, अधिक महत्वपूर्ण के लिए अनुमति देते हैं, स्थानिक सेल सेल बातचीत, एक उपलब्धि दो आयामी (2 डी) के वातावरण के भीतर संभव नहीं। 2 डी सेल scaffolds कोशिकाओं स्वतंत्र रूप से पड़ोसी कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की अनुमति नहीं देते। इसके अलावा, कोशिकाओं आम तौर पर monolayers में (या सीधे एक दूसरे के ऊपर पर), बढ़ने, विकास के लिए अंतरिक्ष और, अधिक महत्वपूर्ण के लिए पूरा उपयोग के बिना बातचीत के लिए। इस तरह के न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के रूप में विशिष्ट स्थानिक बातचीत प्रकार की कोशिकाओं,, जब संभावित प्रत्यारोपण या लंबी अवधि के प्रयोगात्मक रहने वाले सिस्टम को प्रतिबिंबित करने के लिए बनाया प्लेटफॉर्म के रूप में निर्माणों को डिजाइन करने महत्व सर्वोपरि है।

हमारे मॉड्यूलर, विलायक मुक्त एलसीई संश्लेषण एक धातु टेम्पलेट का उपयोग कर, यहाँ प्रस्तुत, उचित केंद्रीय नोड और मोनोमर 7 के अनुपात का चयन करके हाइड्रोफोबिक / हाइड्रोफिलिक संतुलन ट्यूनिंग द्वारा कोशिका आसंजन को समायोजित करने में मदद करता 27। यह आदेश एक अतिरिक्त कदम है कि एक Matrigel परत जोड़ा जाना शामिल से बचने के लिए सेल बोने के लिए प्रासंगिक है, आम तौर पर सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए किया। राशि और केंद्रीय नोड के आकार, साथ ही crosslinker, अंतिम एलसीई में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते के रूप में वे नियंत्रण रेखा इलास्टोमर के थर्मल और यांत्रिक गुणों को प्रभावित। इसके अलावा, यह भी biodegradability दरों की ट्यूनिंग, के रूप में पहले प्रस्तुत किया, के रूप में एलसीई खराब 6 ऊतक से भरा उत्थान फिट करने के लिए अनुमति देता है। वर्तमान में, हम जांच कर रही है कि कैसे पार लिंकर, केंद्रीय कोर, और डी के प्रतिस्थापन के प्रकार, एल -lactide के लिए एल -lactide लोचदार संपत्तियों, कोशिका आसंजन, प्रसार, और सेल संरेखण को प्रभावित करता है पर ध्यान केंद्रित कर चल रहे प्रयोगों की है।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं: (1) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धातु (निकल) फोम और अकड़ आयामों में अपने सीमित रेंज के सीमित किस्म है, (2)आवश्यकता है कि एलसीई या किसी अन्य बहुलक / elastomer सामग्री रासायनिक तौर पर ठोस खोदना (यहाँ, एक FeCl 3 खोदना) की शर्तों का सामना करना होता है, और (3) तथ्य यह है कि सेल का मिलान भी लिक्विड क्रिस्टल संशोधित इलास्टोमर यहां सूचना तक ही सीमित होना प्रतीत होता है (मूल गैर एलसीई इलास्टोमर किसी भी सराहनीय सेल का मिलान नहीं दिखाया जा सका)।

अंत में, यह पहले से दिखाया गया है कि SMA LCEs हमारे मॉड्यूलर संश्लेषण प्रक्रिया का उपयोग कर तैयार किया जा सकता। अतिरिक्त biocompatible नियंत्रण रेखा moieties उनके यांत्रिक गुणों और सेल प्रसार और, विशेष रूप से, सेल संरेखण पर नई तरल क्रिस्टलीय प्रभाव का पता लगाने के शामिल किया जा सकता। यह ज्ञात है कि यांत्रिक गुणों, विशेष रूप से यंग moduli मूल्यों, कोशिका आसंजन, प्रसार, और सेल संरेखण के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहाँ परिणाम बताते हैं कि SMA LCEs की सरंध्रता छेद के आकार को नियंत्रित करने के लिए एक प्रभावी तरीके प्रदान करने के लिए और एलसीई अनुरूप बनाने के लिए एक धातु टेम्पलेट के उपयोग के माध्यम नियोजित किया जा सकताआकार (यानी, कुल मिलाकर आकृति विज्ञान)। एससीबी बहुलक मिश्रण में नी टेम्पलेट, नी टेम्पलेट नक़्क़ाशी के बाद डुबकी नई एलसीई morphologies के लिए एक आसान दृष्टिकोण प्रदान करता है। फोम की तरह LCEs यहाँ वर्णित कोशिकाओं प्रदान (यहाँ, एसएच SY5Y, न्यूरोनल समारोह का अध्ययन करने के लिए एक मानक सेल मॉडल) विकास और बातचीत के लिए एक और अधिक यथार्थवादी, 3D पर्यावरण के साथ। की अनुमति दे कई प्रकार की कोशिकाओं छितरी भर elastomer बारीकी से अंतर्जात तंत्रिका वातावरण की नकल करता है और अधिक परिष्कृत 3 डी टिशू कल्चर प्रयोगों की साज़िश संभावना प्रदान करता है कई परतों में विकसित करने के लिए। ट्यूनेबल और गतिशील LCEs के उपयोग देशी आर्किटेक्चर की नकल करने के अनुदैर्ध्य और नैदानिक ​​प्रासंगिक सेल के अध्ययन के लिए अगली पीढ़ी के सेल मॉडल के लिए मार्ग प्रशस्त।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना की वित्तीय सहायता के लिए - लेखक केंट स्टेट यूनिवर्सिटी (ReMedIKS सहयोगात्मक अनुसंधान अनुदान और केंट स्टेट में पुनर्योजी चिकित्सा पहल के लिए समर्थन) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane Alfa Aesar L16606 Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane TCI B0928 Reagent
2-chlorohexanone  Alfa Aesar A18613 Reagent
2-heptanone  Sigma Aldrich W254401 Solvent
2-propanol  Sigma Aldrich 278475 Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA Sigma Aldrich 273031 Reagent
4-dimethylaminopyridine Alfa Aesar A13016 Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI  Invitrogen D1306 Nuclear Stain
5-hexynoic acid  Alfa Aesar B25132-06 Reagent
Acetic acid VWR 36289 Solvent
Acetone Sigma Aldrich 34850 Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade  VWR 71001-866 Reagent
Benzene Alfa Aesar AA33290 Solvent
ε-caprolactone  Alfa Aesar A10299-0E Reagent
Chloroform VWR BDH1109 Solvent
Cholesterol Sigma Aldrich C8503 Reagent
Chromium(VI) oxide Sigma Aldrich 232653 Reagent
Copper(I) iodide Strem Chemicals 100211-060 Reagent
D,L-Lactide  Alfa Aesar L09026 Reagent
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Solvent
Diethyl ether  Emd Millipore EX0190 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME  CORNING Cellgo 10-013 Cell Media
Ethanol Alfa Aesar 33361 Solvent
Formaldehyde  SIGMA Life Science F8775 Fixative
Fetal bovine serum, FBS  HyClone SH30071.01 Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe VWR 28320 Filtration
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI Sigma Aldrich 52649 Crosslinker
Iron(III) chloride  Alfa Aesar 12357 Etching agent
Isopropyl alcohol VWR BDH1133 Solvent
Methanol Alfa Aesar L13255 Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Aldrich D80002 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Nickel metal template American Elements Ni-860 Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) ATCC CRL-2266 Cell line
Penicillin streptomycin  Thermo SCIENTIFIC 15140122 Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG Alfa Aesar B22181 Reagent
Sodium azide  VWR 97064-646 Reagent
Sodium bicarbonate AMRESCO 865 Drying salt
Sodium chloride BDH BDH9286 Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S-374 Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma Aldrich S9638 Drying salt
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313 Drying salt
Tetrahydrofuran Alfa Aesar 41819 Solvent
Thiosulfate de sodium AMRESCO 393 Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate Aldrich S3252 Reagent
Toluene Alfa Aesar 22903 Solvent
Triethylamine Sigma Aldrich 471283 Reagent
Trypsin HyClone SH30042.01 Cell Detachment
Olympus FV1000

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जैव अभियांत्रिकी अंक 122 लिक्विड क्रिस्टल Elastomers 3 डी पोरस Scaffolds सेल Scaffolds सेल संरेखण सेल दिशात्मकता Biocompatible
3 डी स्थानिक सेल संस्कृतियों के लिए सेल Scaffolds के रूप में Biocompatible लिक्विड क्रिस्टल Elastomer Foams का संश्लेषण
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