Summary
Deze studie geeft een methode voor 3D, bioafbreekbare, schuimachtige cellen steigers basis van biocompatibele zijketen vloeibaar kristal elastomeren (LCEs) te bereiden. Confocale microscopie experimenten tonen aan dat schuimachtige LCEs zorgen voor celhechting, proliferatie en de spontane uitlijning van C2C12s myoblasten.
Abstract
Hier presenteren we een stap-voor-stap de bereiding van een 3D, biologisch afbreekbaar, schuim-achtige cel schavot. Deze skeletten werden bereid door verknoping sterblok copolymeren met eenheden cholesterol zijketen zijgroepen waardoor smectische-A (SMA) met vloeibare kristallen elastomeren (LCEs). Foam-achtige steigers, bereid met behulp van metalen sjablonen, voorzien van onderling verbonden microkanalen, waardoor ze geschikt zijn als 3D-celkweek steigers. De gecombineerde eigenschappen van de vaste structuur van het metaalschuim en het elastomeer resulteren in een 3D cel scaffold dat niet alleen een hogere celproliferatie bevordert vergeleken met gebruikelijke poreuze matrijs films, maar ook een beter beheer van massatransport (dwz voedingsstoffen, gassen, afval etc.). De aard van de metalen matrijs zorgt voor eenvoudige manipulatie schuim vormen (dat wil zeggen, rollen of films) en voor de bereiding van steigers met verschillende poriegrootten voor verschillende celstudies behoud van de interconnectieted poreuze aard van de matrijs. Het etsproces tast de chemie van de elastomeren, behoud van hun biologisch verenigbaar en biologisch afbreekbaar. We tonen aan dat deze smectische LCEs, wanneer ze groeien voor een uitgebreide tijdsperioden, schakelt u de studie van klinisch relevante en complexe weefsel constructies terwijl het bevorderen van de groei en proliferatie van cellen.
Introduction
Er zijn verschillende voorbeelden van biologische en biocompatibele synthetische materialen bestemd voor gebruik in celstudies en weefselregeneratie gericht op celhechting en proliferatie 1, 2, 3, 4, 5. Er zijn enkele voorbeelden van biocompatibele materialen, bekend als vloeibare kristallen elastomeren (LCEs), die kunnen reageren op externe stimuli anisotrope moleculaire bestelling 6, 7 zijn. LCEs zijn stimuli-responsieve materialen die de mechanische en elastische eigenschappen van elastomeren combineren met de optische functionaliteit en moleculaire ordening vloeibaar kristal 8, 9. LCEs kunnen vormveranderingen, mechanische vervorming, elastisch gedrag en optische eigenschappen ervaren in reactie op externe stimuli (bijv., warmte, stress, licht, enz.) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Eerdere studies hebben aangetoond dat vloeibare kristallen (LC) de groei en oriëntatie van cellen 4, 17 kan voelen. Men kan dan veronderstellen dat LCEs geschikt zijn voor biologisch en medisch relevante toepassingen, zoals mobiele steigers en uitlijning zijn. We hebben eerder beschreven de bereiding van smectische biocompatibel, biologisch afbreekbaar, gegoten gegoten en LCEs dunne film van een "type Zwitserse kaas" poreuze morfologie 6, 18. We bereidden ook nematisch biocompatibel LCEs met bolvormige morfologie als steigers voor celgroei 19 <sup>, 20. Ons werk was gericht op het afstemmen van de mechanische eigenschappen van de materialen aan die van het weefsel van belang 21 te passen. Ook zijn deze studies richten zich op het begrijpen van elastomeer-cel interacties, evenals cellulaire reactie wanneer de elastomeren, zijn aan externe stimuli.
De belangrijkste uitdagingen waren gedeeltelijk de porositeit van de LCEs om celhechting en permeatie door de elastomere matrix maat en beter massatransport. De porositeit van deze dunne films 6 liet cell permeatie door de massa van de matrix, maar niet alle poriën waren goed op elkaar en had een regelmatiger (homogene) poriegrootte. Vervolgens hebben we gemeld op biocompatibele nematisch LCE elastomeren met bolvormige morfologie. Deze nematische elastomeren toegestaan voor de hechting en proliferatie van cellen, maar de poriegrootte varieerde slechts 10-30 urn, die voorkomen of beperkt het gebruik van dezeelastomeren met een grotere verscheidenheid van cellijnen 19, 20.
Eerder werk van Kung et al. betreffende de vorming van grafeen schuimen onder gebruikmaking van een "sacrificial" metal template toonden dat de verkregen grafeen schuim had een vaste poreuze morfologie bepaald door de gekozen metalen matrijs 22. Deze methode biedt volledige controle van de porositeit en poriegrootte. Tegelijkertijd de buigzaamheid en de flexibiliteit van de metalen mal maken de vorming van verschillende template vóór schuimbereiding vormen. Andere technieken, zoals het materiaal uitlogen 23, gas templating 24 of elektro-gesponnen vezels 25, 26 bieden ook de mogelijkheid voor de vervaardiging van poreuze materialen, maar ze zijn tijdrovend en, in sommige gevallen, wordt de poriëngrootte beperkt tot slechts enkele micrometers. Schuim-achtige 3D LCEs bereid met metalen templates zorgen voor een hogere celbelasting; een verbeterde proliferatiesnelheid; co-kweken; en, last but not least, beter massatransport beheer (dat wil zeggen, voedingsstoffen, gassen en afval) tot volle ontwikkeling van weefsel 27 te waarborgen. Foam-achtige 3D LCEs lijken ook celuitlijning te verbeteren; Dit is waarschijnlijk ten opzichte van de LC hangers waarnemen celgroei en oriëntatie. De aanwezigheid van LC eenheden binnen het LCE lijkt celuitlijning verbeteren ten opzichte cellocatie in de LCE scaffold. Cellen uitlijnen binnen de stutten LCE, terwijl er geen duidelijke oriëntatie wordt waargenomen wanneer de stutten samen (knooppunten) 27 sluiten.
Algemeen is LCE cel scaffold platform als Celdrager medium biedt mogelijkheden voor het afstemmen het elastomeer morfologie en elastische eigenschappen en specifiek richten van de uitlijning (individueel) celtypen een geordende ruimtelijke arrangementen creëren of cellen vergelijkbaar met levende systemen. Naast het verschaffen van een scaffold staat is tot duurzame en richten langdurige celgroei en proliferatie, LCEs maken ook dynamische experimenten, waarbij celoriëntatie en interacties kunnen worden gewijzigd tijdens de vlucht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De volgende stappen voor de 3D LCE schuimachtige preparaat met de 3-arm sterren blokcopolymeer weergegeven in figuur 1. Voor kernspinresonantie (NMR) karakterisering worden de spectra geregistreerd in gedeutereerd chloroform (CDCI3) bij kamertemperatuur op een Bruker DMX 400 MHz instrument en inwendig gerefereerd resterende pieken bij 7,26. Fourier transformatie infrarood (FT-IR) spectra zijn opgenomen met een Bruker Vector 33 FT-IR spectrometer met behulp verzwakte totale reflectiemodus. Voor elke stap van het volgende protocol, is het belangrijk om geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) dragen.
1. Synthese van α-chloor-ε-caprolacton (monomeer) (volgens de werkwijze van Jérôme et al. 28)
- Voor het begin van de synthese, zuiveren 27 g 3-chloorperbenzoëzuur als volgt:
- In 800 ml gedestilleerd water, voeg 1,28 g natriummonobasisch monohydraat en 8,24 g natriumfosfaat dibasisch heptahydraat. Breng de pH op 7,4 (toepassing van natriumhydroxide of zoutzuur) en reserve 30 ml van deze oplossing; Dit is de bufferoplossing.
- Met behulp van een scheitrechter, Los 3-chloorperbenzoëzuur in 35 ml diethylether. Was de organische oplossing met 10 ml bufferoplossing (bereid in stap 1.1.1.). Herhaal het wassen drie keer.
- Voeg 3 g natriumsulfaat rechtstreeks aan de organische oplossing; dit droogmiddel absorbeert water uit de organische oplossing.
- Filtreer de oplossing om het droogmiddel te verwijderen. Concentreer het filtraat onder verminderde druk onder toepassing van een rotatieverdamper bij 850 mbar en 40 ° C.
- Oplosbaar 18,5 g gezuiverd 3- chloorperbenzoëzuur in 150 ml droog dichloormethaan onder roeren in een ultrasoonbad; Dit proces neemt meestal 20 min. Plaats de oplossing in een scheidtrechter.
- In een twee-hals, rondbodemkolf,los 13,1 g 2-chloorcyclohexanon in 15 ml droge dichloormethaan met een magneetroerder onder stikstofgas. Blijf roeren.
- Breng de scheitrechter met 3-chloorperbenzoëzuur oplossing (uit stap 1.2) aan de tweehalskolf in stap 1.3. Spoelen van het systeem met stikstofgas. Past het openen van de scheitrechter zodat de chloorperbenzoëzuur druppelsgewijs valt in de 2-chloorcyclohexanon oplossing (1 druppel per twee seconden) en zet roeren van het mengsel onder stikstof gedurende 96 uur.
- Koel het reactiemengsel tot -20 ° C gedurende 1 h teneinde de m-chloorbenzoëzuur (m -CBA) bijproduct te precipiteren.
- Filter de m-chloorbenzoëzuur (m -CBA) en was de resterende oplossing met een verzadigde oplossing van natriumthiosulfaat, natriumbicarbonaat en natriumchloride.
- Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een rotatieverdamper bij 850 mbar en 40 ° C. Zuiver het lichtgele, viskeuze vloeibare zeeid door destillatie onder verlaagde druk bij 2,3 mm Hg en 96 ° C.
- Bewaak het succes van het synthesegas met de volgende 1H NMR pieken. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, CH CLCO), 4,37-4,26 (m, 1H, CH2 O), 4,18-4,05 (m, 1H , CH2 O) en 2,06-1,58 (m, 6H, -CH2 -) 6, 27.
2. Synthese van α-driearmige ster blokcopolymeer (SBC-αCl) van Ringopeningsactiviteit Copolymerisatie (Sharma et al. 6 en Amsden et al. 29)
- Voordat synthese silaniseren 20 ml ampul door deze te vullen met een 2% (v / v) oplossing van 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane in tolueen en roeren gedurende ongeveer 24 uur. Spoel met isopropanol en droog door het in een oven bij 140 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeg 30,64 g gedestilleerd ε-caprolacton, 0,5 g α-chloor-ε-caprolacton en 0,25 ml glycerol aan de ampul. Meng met behulp van een vortex gedurende 1 minuut.
- Voeg 4,90 g D, L-lactide de ampul en ontlucht met stikstof. Plaats de ampul in een oven bij 120 ° C aan de D, L-lactide smelt; dit proces duurt typisch ongeveer 2 uur. Meng opnieuw met een vortex om ervoor te zorgen dat alle inhoud goed gemengd en voeg 66 gl tin (II) 2-ethylhexanoaat (Sn (Oct) 2) aan de ampul.
OPMERKING: D, L-lactide zal afkoelen tijdens dit proces en moet opnieuw worden verwarmd in de oven te smelten. - Heftig één keer gemengd met de vortex en spoelen met stikstof.
- Sluit de ampul met een rubberen stop. Plaats een naald verbonden met een zuigbuis (het huisvacuüm is meestal voldoende) door de rubberen stop. Zet de vacuüm en met behulp van een vlam, smelt de lange nek van het glas, draaien langzaam tot de glass op zichzelf inklapt. Wees voorzichtig om niet smelt de rubberen stop. Zodra de ampul dichtgesmolten, plaats het in een zandbad, een oven, of passend verwarmingselement bij 140 ° C gedurende 48 uur.
- Haal de ampul en laat het afkoelen op kamertemperatuur.
- Breek de ampul in de afgedichte markering en los de hoogviskeuze vloeistof door toevoeging van 10 ml dichloormethaan. Breng de oplossing in een scheitrechter.
- Bereid een kolf met 100 ml koude methanol (gekoeld met behulp van een droogijs / acetonbad bij een temperatuur van ongeveer -78 ° C). Bevestig de scheitrechter (stap 2.7) bovenop de kolf. Past het openen van de scheitrechter zodat ongeveer twee druppels per twee seconden (druppelsgewijs) vallen.
- Verzamel het witte neerslag door filtratie (met een papierfilter) en droog in een vacuümoven van 50 tot 60 ° C.
- Bewaak het succes van het synthesegas met de volgende 1H NMR en FT-IR pieken. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COCH CH3), 4,43-4,25 (m, CH Cl), 4,24-4,12 (m, CH2 O), 4,11-4,03 (t, J = 4,6 Hz, CH2 O), 3,80-3,68 (m, CH CH2), 3,09-2,64 (breed, s, OH), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, α- H) en 1,77-1,25 (m, CH2, CH3); FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866 en 735 (m) 6, 27.
Opmerking: Om een hydrofiel 3D LCE bereiden, bereidt een lineair blokcopolymeer (LBC) in plaats van een SBC, na ringopening copolymerisatie (ROP) die hierboven is beschreven.- Voeg 0,3 g polyethyleenglycol (PEG), 3,15 g ε-caprolacton, 1,0 g α-chloor-ε-caprolacton en 5,0 g D, L-lactide de gesilaniseerde flesje mix.
3. Synthetische Modificatie van α-Cl-Drie Arm SBC aN 3 -Three Arm SBC (SBC-aN 3) (Volgens Sharma et al. 6)
- In een rondbodemkolf onder stikstof, los 5 g SBC-αCl in 30 ml droge N, N'-dimethylformamide.
- Voeg 0,22 g natriumazide en laat 's nachts omgezet bij kamertemperatuur.
Voorzichtig: Natriumazide is giftig; Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE). - Verwijder het N, N'-dimethylformamide onder verminderde druk met een rotatieverdamper bij 11 mbar en 40 ° C. Los het mengsel in 30 ml tolueen. Centrifugeer de oplossing driemaal bij 2800 xg gedurende 15 min aan het gevormde zout te verwijderen. Verdamp het tolueen onder verminderde druk met een rotatieverdamper bij 77 mbar en 40 ° C.
- Bewaak het succes van het azide substitutie met gebruikmaking van 1H- NMR en FT-IR pieken.
NOTITIE:
4. Synthese van Cholesteryl 5-Hexynoate (LC rest) (Volgens Sharma et al. 6 en Donaldson et al. 30)
- In een rondbodemkolf, meng 3 g 5-hexynzuur en 130 ml dichloormethaan. Koel tot 0 ° C met een ijsbad.
- In een rondbodemkolf, meng 8,28 g N, N'-dicyclohexylcarbodiimide, 10,3 g cholesterol en 0,2 g 4-dimethylaminopyridine.
- Breng de 5-hexynzuur oplossing druppelsgewijs aan de kolf die het mengsel cholesterol en handhaven van de uiteindelijke mengsel bij 0 ° C gedurende 1 uur.
- Laat het mengsel overnacht opwarmen tot kamertemperatuur. Verwijder het verkregen neerslag dicyclohexylureum door filtratie met een cijfer 415 papieren filter en gooi dit weg.
- Concentreer het filtraat onder verminderde druk met een rotatieverdamper bij 850 mbar en 40 ° C. Los het residu verzameld in 150 ml hexaan.
- Damp het oplosmiddel onder verlaagde druk met een rotatieverdamper bij 335 mbar en 40 ° C. Voeg 350 ml ethanol aan het olieachtige residu aan het eindproduct te verzamelen. Was de gebroken witte vaste stof gevormd met ethanol en droog het vaste product onder vacuüm bij 50 ° C.
- Controleer de synthese met de volgende 1H NMR en FT-IR pieken. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, CH = C), 4,70-4,58 (m, 1H, CH OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, CH2 CO), 2,34 (m, 2H, CH2-CH =), 2,31 (m, 2H, CH2 CH2-COO), 2,28 (s, 1H, HC = C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H2), 2,07-1,06 (m, 2H, CH2, CH), 0,94 (s, 3H, CH3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, CH3 CH) en 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, CH3-CH), 0,67 (s, 3H, CH3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2,830-2,990 (brede en sterke piek), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s) en 667 (s).
5. Synthetische Modificatie van α-N3 -Three Arm SBC tot a-Cholesteryl-Three Arm SBC (SBC-αCLC) via een azide-Acetyleenalkoholen Huisgen cyclo-additiereactie ( "klik" Reaction) Het verkrijgen SBC-Chol (volgens Sharma et al. 6)
- In een rondbodemkolf, los 1 molequivalent SBC-aN 3 (1,5 g) in 100 ml vers gedestilleerd tetrahydrofuran (THF). Voeg 1,2 mol equivalent cholesteryl 5-hexynoate (1,94 g), 0,1 molequivalent koper (I) jodide (0,06 g) en 0,1 molair equivalent triethylamine (0,03 g). Roer het mengsel overnacht bij 35 ° C onder stikstof.
- Damp het oplosmiddel onder verlaagde druk met een rotatieverdamper bij 357 mbar en 40 ° C.
- Los het resterende mengsel in 80 ml dichloormethaan en centrifugeer 5 min bij 2800 xg bij kamertemperatuur om ongereageerde materialen en bijproducten te verwijderen.
- Controleer de synthese met de volgende 1H NMR en FT-IR pieken. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazool), 5,43-5,34 (m, C = CH cholesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH 3), 4,68 -4,55 (m, O-CH cholesterol), 4,24-4,19 (m, CH2 O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, CH2 O), 4,11-4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH 2 O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH2), 2,31-2,25 (m, COCH2), 2,07-1,02 (m, CH2 CH3), 1,05-1,03 (s, CH2, CH3), 0,96-0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH2, CH3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH3) en 0,71-0,68 (s, CH3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 3260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (s) en 668 (s).
6. Synthese van 2,2-bis (1-caprolacton-4-yl) propaan (verknopingsmiddel, BCP) (Volgens Gao et al. 27 en Albertsson et al. 31)
- In een rondbodemkolf, maak een oplossing met 10,8 g 2-bis (4-hydroxycyclohexyl) propaan en 52 ml azijnzuur.
- Bereid een oplossing van 11 g chroomtrioxide in 50 ml azijnzuur en 8 ml gedestilleerd water. Voeg deze oplossing druppelsgewijs aan de oplossing bereid in stap 6.1 onder handhaving van de temperatuur van het mengsel tussen 17 en 20 ° C (bijvoorbeeld in eenwaterbad); Dit druppelsgewijs duurt 2 uur. Wanneer het proces is voltooid, laat de oplossing roeren gedurende ongeveer 30 minuten.
- Voeg 50 ml 2-propanol. Roer de oplossing overnacht bij kamertemperatuur.
- Concentreer de donkerpaarse oplossing onder verlaagde druk met een rotatieverdamper bij 137 mbar en 40 ° C. Voeg 300 mL gedestilleerd water neer te slaan; de neerslag moet licht paars.
- Filtreren van het ruwe product met behulp van een cijfer 415 papieren filter. Spoel de vaste stof met -250 ml gedestilleerd water of totdat de vaste stof wordt wit.
- Los de vaste stof in 15 ml benzeen bij 40 ° C en laat het herkristalliseren bij 25 ° C.
- Voeg 8,34 g droog diketon, opgelost in droog dichloormethaan en een oplossing van 6,0 g 3-chloorperbenzoëzuur in 75 ml dichloormethaan aan de kolf.
- Terugvloeitemperatuur van de oplossing bij 40 ° C gedurende 24 uur.
- Koel het reactiemengsel tot -20 ° C gedurende 10 minuten om de m precipiteren
- Verwijder m-chloorbenzoëzuur afgefiltreerd (met een papierfilter) en concentreer de oplossing onder verminderde druk.
- Was het ruwe product viscose met 200 ml 2-heptanon en droog het precipitaat onder vacuüm bij 50 ° C overnacht.
- Controleer de synthese met de volgende 1H NMR en FT-IR pieken. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, CH2 OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, CH2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, CH2 COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, CH 2 COO), 2,04-1,93 (m, 4H, -CH2 CH2 OC = O), 1,70-1,56 (m, 4 H, -CH2 CH2 COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C (CH3) 2), 0,84 (s, 6H, CH3 C-). 7. Creatie van 3D poreuze elastomeer steiger met behulp van hexamethyleendiisocyanaat (HDI) of 2,2-bis (1-caprolacton-4-yl) propaan (BCP) 27 als verknopingsmiddel (Volgens Gao et al. 27)
- Bereid driearmige elastomeer onder toepassing van 0,75 g SBC-αCLC door 0,25 ml HDI (of 0,45 ml BCP) en 0,24 ml gedestilleerd ε-caprolacton monomeren. Voeg 60 ul van Sn (Oct) 2. Bij gebruik BCP plaats van HDI, gemengd SBC-αCLC en BCP behulp van een vortex en plaats ze in een oven bij 140 ° C totdat het BCP volledig smelt en oplost (deze stap kan tot 2 uur). Zodra de BCP opgelost is, te verwijderen uit de oven en de Sn (Oct) 2 en vortex.
- Bereid een "sacrificial" metaalschuim matrijs door het snijden van een 1 x 4 cm metaaldeel. Rollen van een van de korte uiteinden zodat de uiteindelijke rol is ongeveer 1 x 1 cm metaaldeel (zie figuur 4). <li> Plaats het metaalschuim in een glazen flesje of aluminiumfolie pakket en giet het mengsel bereid in stap 7.1 doorgronden van het schuim gedurende 2 min. Het overtollige mengsel met een Pasteur pipet. Laat het in een oven gedurende de nacht bij 80 ° C.
- Schil van de aluminiumfolie of het glas te breken. Met behulp van een scheermesje scheren elastomeer rond het metaalschuim het nikkelmetaal bloot.
- Bereid 1 M ijzer (III) chloride (FeCl3) opgelost in 100 ml water. Plaats het schuim in een kolf en voeg 70 ml FeCl3-oplossing. Roer gedurende drie dagen bij kamertemperatuur en verander de FeCl3 oplossing elke dag. Vóór elke verandering, roer het schuim met geïoniseerd water gedurende 0,5 uur.
OPMERKING: Het etsproces wordt typisch voltooid na drie dagen. Opdat het etsen is voltooid, voert tactiele drukproeven totdat het schuimen zacht aanvoelen. Schuim weerstand tegen tactiele drukproeven de aanwezigheid van een resterende metalen matrijs. - Spoel de elastomer schuim met ethanol en in een vacuümoven overnacht bij 40 ° C.
- Karakteriseren materialen behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM), differentiële scanning calorimetrie (DSC), drukproeven mechanische en thermische gravimetrische analyse (TGA) 27.
LET OP: Voor het bereiden van een hydrofiele 3D LCE, vervangt u de SBC met LBC (zorg ervoor dat de LBC bevat ook een LC-eenheid) volgens de in stap 7.5 beschreven stappen.
8. Het zaaien van Elastomer Steiger met SH-SY5Y neuroblastomacellen en cultuur met steriele technieken
- Steriliseer de elastomeer door tweemaal te wassen met 1 ml 70% ethanol. Uitvoeren UV-bestraling gedurende 10 minuten en wassen met 1 ml 70% ethanol. Spoel tweemaal met 1 ml steriel water en 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Plaats de elastomeren in 24-putjes.
- Bereid celgroei medium voor SH-SY5Y bevattende 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (Pen-Strep).
- Na het tellen van de cellen onder toepassing van een hematocytometer Bereid 1,5 x 10 5 SH-SY5Y cellen gesuspendeerd in 100 pi groeimedium (kiemoplossing). Voeg de oplossing op de top van de elastomeren, en zorg ervoor dat een druppel te vormen.
- Incubeer de geënte elastomeren bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 uur celadhesie bevorderen. Voeg 0,5 ml groeimedium. Incubeer opnieuw bij 37 ° C met 5% CO2.
- Verander het medium om de andere dag na het wassen met 1 ml PBS.
9. Microscopische Beeldvorming van elastomeer Construct
- Fixeer de cellen gekweekt op elastomeren met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 min. Spoelen met 3 ml PBS driemaal gedurende 5 minuten elk en leg het elastomeer met de gefixeerde cellen in een kweekschaal met een aangrenzende dekglaasje.
Let op: PFA is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermende kleding (PPE). - Stain het vaste monsters met 0,1% 4' , 6-diamino-2-fenylindool (DAPI) in 500 pi PBS gedurende 10 minuten en spoel tweemaal met 1 ml PBS gedurende 5 min.
- Onmiddellijk beeld elastomeren via confocale microscopie met DAPI fluorescentie verkrijgen afbeeldingsstapels dat het monster omvatten.
LET OP: Hier werden image stacks verkregen met behulp van een 20X objectief en een 60X objectief. - Analyseer de afbeelding optische confocale stapels behulp ImageJ 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit rapport toont de bereidingswerkwijze van een poreuze 3D LCE als matrix voor celkweek onder toepassing van een nikkelmetaal template. De verkregen 3D LCE toont een complex onderling kanalennetwerk voor probleemloos celinfiltratie, alsmede geschikter massatransport 27. Er werd gevonden dat cellen volledig kunnen doordringen in de onderling verbonden kanalen netwerken kunnen ook uitlijnen binnen LCE. Hier een metalen metaalschuim (99% Ni, dichtheid 860 g / cm2) werd geselecteerd na een soortgelijke manier als het grafeen schuimbereiding eerder door Kung et al. 22. Het metaalschuim werd gegoten polymeer, alle metalen stutten volledig gedekt. De selectie van het metaalschuim grootte en dichtheid is belangrijk, omdat het verleent de uiteindelijke morfologie van de LCE en kan helpen bij het nabootsen van het weefsel omgeving van belang.
D, L-lactide (figuur 2). Het eindproduct is een hydrofoob 3-arm SBC. SBC met 4 en 6 armen, door vervanging van het glycerol knooppunt pentaerythritol en dipentaerythritol, respectievelijk, zijn eerder beschreven 18. Voor een meer hydrofiele SBC, werd het centrale knooppunt vervangen oligoethyleenoxide (zie protocol toelichting). Echter, vervanging van glycerol met oligoethyleenoxide resulteert in een lineair blokcopolymeer 27. We gebruikten een gemodificeerde synthese van Younes et al. 29. De aangepaste versie maakt het gebruik van een gemodificeerd ε-caprolactone een halogeengroep in twee verschillende standen, alfa- en gamma van de carbonylgroep 6. Zodra de SBC wordt gevormd, de gemodificeerde ε-caprolacton block lijdt een verplaatsing van het halogeenatoom met een azidegroep. De verplaatsing van de halogeengroep van de azidogroep wordt bevestigd door het verschijnen van de 2100 cm - 1-band verzwakte totale reflectie (ATR) FT-IR (figuur 3). De azidegroep wordt later gebruikt om covalent de LC groep (cholesteryl hexynoate) om de ster blokcopolymeer gebruikt alkyn-azide Huisgen's cycloadditiereactie (ook bekend als een "klik reactie"), het verkrijgen van de definitieve ster blokcopolymeer met een kant -keten cholesterol pendant eenheid (SBC-Chol). De vorming van de triazoolring wordt bevestigd door het verdwijnen van de 2100 cm - 1 band en het verschijnen van een singlet waargenomen bij 7,30 ppm in het 1H NMR spectrum (zie figuur3). We hebben onlangs gemeld over het effect van het plaatsen van een halogeengroep alfa- (α-Br) of gamma (γ-Cl) van de carbonylgroep op de gefunctionaliseerde ε -CL 6. Opgemerkt wordt dat de vervanging centraal punt in de SBC copolymeren met 4-arm en 6-arm kernen van invloed is op de mechanische eigenschappen van de verkregen LCEs omdat de centrale knooppunten dienen als zowel initiators en intrinsieke crosslinkers 18 .
Zodra de SBC-Chol is vervaardigd en volledig gekarakteriseerd, het verknopingsproces met een metalen mal is de laatste stap voor schuimbereiding. De SBC-Chol werd met hexamethyleendiisocyanaat (HDI, verknopingsmiddel), ε-caprolacton en Sn (oktober) 2 (ROP katalysator, zie stap 7.1). Het bis-caprolacton (BCP) verknoper werd vervangen HDI, zoals eerder beschreven. Het metaalschuim wordt gesneden en gevormd om de gewenste form (Figuur 4). Twee paden voor schuimbereiding, namelijk de primaire porositeit (LCEF PP) en primaire / secundaire porositeit (P + LCEF SP), zijn eerder beschreven. Hier de LCEF P + SP of "dipping" werkwijze wordt voorgesteld, waarbij het nikkel matrijs snel ondergedompeld in het polymeermengsel. Het metaalschuim wordt geplaatst in een container gemaakt van aluminiumfolie of een scintillatieflesje met het polymeermengsel, met metalen stutten volledig ondergedompeld in het polymeermengsel. De overmaat polymeer mengsel wordt voorzichtig verwijderd. Dit polymeer bedekte nikkel matrijs wordt overnacht geplaatst, nog steeds in de houder in een oven bij 80 ° C. Verknoping wordt uitgevoerd in aanwezigheid van de katalysator gedurende ongeveer 2 uur. Na het verknopingsproces wordt het met polymeer bedekte nikkel template uit de houder verwijderd door afpellen van het aluminiumfolie of breken van de glazen houder. De overmaat polymeer wordt voorzichtig geschoren vanaf het polymeer bedekte nikkel templat de randen van het nikkel matrijs bloot en geplaatst in een houder met een verzadigde oplossing van FeCl3 (Figuur 5). Na een paar uur, het nikkel nagenoeg volledig verwijderd, en alleen de LCE schuim gespoeld met gedeïoniseerd (DI) water tot het nikkel / FeCl3-oplossing te verwijderen. LCE schuim wordt opnieuw geplaatst in een houder met een verzadigde FeCl3-oplossing en gespoeld met gedeïoniseerd water twee keer. Nadat het etsen is voltooid en de totale nikkel matrijs volledig geëlimineerd, LCE schuim toont een onderling verbonden netwerk kanaal met holle schoren (figuur 6). Figuur 6 toont de inwendige LCE schuim morfologie waargenomen onder toepassing van scanning elektronenmicroscopie (SEM). LCE schuim stutten hol, en de totale normale morfologie die afhangt van het metaalschuim template.
Eerder, het gebruik van BCP vereist verschillende stappen om het in solu houdentie (dat wil zeggen gesmolten) omdat BCP begint te herkristalliseren zodra de oplossing afkoelt enkele graden (140 ° C tot kamertemperatuur om de Sn (Oct) 2 toe, zie stap 7.1). Dit maakt de manipulatie van het metaalschuim en polymeermengsel uitdagend voor het verknopen. Het gebruik van HDI als verknopingsmiddel toegestaan voor een snellere verknopingstijd dan wanneer BCP. BCP vast is bij kamertemperatuur, met een smeltpunt van 140 ° C, terwijl HDI vloeibaar is bij kamertemperatuur. De keuze van verknopingsmiddelen rechtstreeks effect op de voorbereidingstijd en, zoals in ons geval, verminderde de verknopingstemperatuur 140-80 ° C, ook verminderen elastomeer preparaat.
LCE schuimen werden getest met compressie-vervorming (Film 1). Een 70% reductie van LCE grootte wordt waargenomen, zonder effect op totale afmetingen. Na de release van de compressie van de LCE, herstelt volledig zijn oorspronkelijke shape en grootte. Gemeend wordt dat de aanwezigheid van het vloeibaar kristal gedeelten in LCE materiaal kritisch, elastomeren onder dezelfde omstandigheden bereid zonder de cholesterol- ε-caprolacton blok herstelden niet hun oorspronkelijke vorm en stortte in zichzelf.
Zodra LCE schuimen werden verkregen, waren ze klaar om te worden geënt met neuroblastoma (SH-SY5Y) gebruik van standaard celkweek technieken. LCE schuimen werden tweemaal in 70% ethanol gewassen en driemaal gespoeld met PBS voorafgaand aan het zaaien van cellen. Binnen 2-3 dagen van de cel zaaien, werden de cellen waargenomen te hechten aan de wanden van de 3D-LCE netwerk. Volledig bestuderen celhechting en groei binnen het LCE netwerk, werden cellen gefixeerd na 30 dagen (Figuur 7). Cellen werden gefixeerd, gekleurd met DAPI, en afgebeeld met behulp van confocale microscopie. De cellen bleken te hebben zich verspreid, bevestigd en uitgebreid om op grote schaal hebben betrekking op de 3D-LCE schavot netwerk. VerderMeer gedetailleerde analyse onthulde celkernen rek, die meestal niet werd beïnvloed door de gekromde delen van de 3D LCE scaffold netwerk. Elongatie kan worden gecorreleerd met celuitlijning en is waarschijnlijk het gevolg van de smectische A-fase karakteristiek LCE gepresenteerd. Dit werd eerder waargenomen in C2C12 cellen gekweekt na 14 dagen 27. In deze studie tonen we aan dat de cellen verder te laten groeien voor meer dan 14 dagen; dit is niet beperkt tot C2C12 cellen alleen. Het gebruik van de LCE schuimen kan worden uitgebreid tot bijna elke cellijn. Cellen groeien op 3D LCE foam-achtige steigers profiteren van hogere massatransport efficiency in vergelijking met 2D steigers. In 2D steigers, cellen groeien gewoonlijk in lagen bovenop elkaar. Cellen die groeien op de bovenste lagen zijn de enigen die volledige toegang tot alle voedingsstoffen, gas, en de verwijdering van afval (massatransport) te hebben. Cellen in de onderste lagen geen toegang tot voedingsmiddelen, en er is een hogere mate van cel death in dit geval. In 3D draagstructuren, cellen een efficiëntere (vergeleken met 2D scaffolds) toegang tot nutriënten, groeifactoren en gassen, waardoor langdurige cel- en weefselregeneratie studies. -management-cel afval (verwijdering van afval) met behulp van de 3D-LCE foam-achtige steigers is ook effectiever dan in de 2D-steigers. De porositeit (en / of andere structurele eigenschappen) van de LCEs zorgt voor een snelle massatransport en een verhoogde celbelasting tegenover minder poreus (of andere) matrices, waardoor media en cellulaire toegang tot de centrale gebieden van de matrix. Dit LCE platform is instelbaar om de groei van vele soorten van primaire en onsterfelijk gemaakte cellijnen die, met inbegrip van de spieren, zenuwen, en de huid, onder andere, evenals meercellige kweeksystemen ondersteunen. In wezen, dit is een van de voordelen van het platform, omdat het kan worden gebruikt om te groeien veel verschillende soorten cellen en systemen voor langere perioden. Daarnaast is de mogelijkheid om meerdere lagen cellen groeien in het construct nauwer emulates natuurlijke omgevingen.
Figuur 1: Algemene procedure beschrijft de stap voor stap bereiding en karakterisering van LCE schuimen. Zie het protocol voor details. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Verknoping schema van 3-arm SBC. De verknoping schema van de 3-arm SBC behulp biscaprolactone of HDI als verknopingsmiddelen bij aanwezigheid van een nikkelmetaal template voor het bereiden van schuimvormig LCEs weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze Figu bekijkenopnieuw.
Figuur 3: Schema 1,2,3-triazool formatie (succesvol "klik" reactie) gevolgd door 1H-NMR en FT-IR. De verplaatsing van de halogeengroep van de azidogroep wordt bevestigd door het verschijnen van de 2100 cm - 1-band verzwakte totale reflectie (ATR) FT-IR. De vorming van de triazoolring wordt bevestigd door het verdwijnen van de 2100 cm - 1 band en het verschijnen van een singlet, waargenomen bij 7,30 ppm in het 1H NMR spectrum. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: optische beeldendiverse schuim vormen voor het verknopen. Het metaalschuim wordt gesneden en gevormd tot de gewenste vorm, zoals afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Nikkel schuim vóór (A) en na (B) het verknopen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: LCE schuim morfologie waargenomen onder toepassing van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Representatieve SEM beelden van LCE schuim op SBC-gebaseerde (a en b) en LBC-gebaseerde (c d) elastomeren met behulp van Ni-860 als metalen matrijs getoond. Pijlen geven uitgeholde stutten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Confocale microfoto tonen DAPI gekleurde kernen van SH-SY5Y-cellen 30 dagen na het zaaien bevestigd aan het elastomeer schuim. 2D-beelden werden gestapeld in de z-richting en dwarsdoorsnede afbeeldingen in het xz - yz en -Vliegtuigen gecreëerd. De beelden tonen aan dat SH-SY5Y cellen (lichte vlekken) bevestigd en uitgebreid in de wanden van de holle kanalen in het elastomeer schuim. De cellen ruimtelijk uitgebreid naar meerdere lagen en strekt zich uit over 100 urn door het construct (zie het xz - yz en het -vlak kruis secties). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Film 1: Video beelden van de vervorming en het herstel van een LCE roll. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vloeibaar kristallijne elastomeren zijn onlangs bestudeerd als biocompatibel cel steigers vanwege hun stimuli responsiviteit. Zij hebben bewezen dat ideaal platforms zoals mobiele steigers zijn. Echter, een belangrijke factor in gedachten te houden bij de voorbereiding van en het ontwerpen van een nieuwe LCE schavot is porositeit. De opname van uitloogbare vaste stoffen of gassen 23 niet altijd tot homogene poreusheid of volledig onderling verbonden poriën. Het gebruik van een metalen mal die geëtst kan worden uitgevoerd biedt niet alleen de mogelijkheid om een meer georganiseerde en regelmatige interne structuur, maar maakt het ook mogelijk voor de selectie van porie grootte en dichtheid. Dit is direct gerelateerd aan de metalen matrijs eerder voor de bereiding van schuimen grafeen 22. Metal templates bieden ook de mogelijkheid om vormen te vormen voorafgaand aan de LCE verknopen, waardoor een breed scala aan mogelijkheden om geavanceerde en complexe architecturen met regelmatige porositeit de maakondertekend om nauw samen te lijken endogene omgevingen. LCEs schuim bereid met deze werkwijze maken de verbeterde studie van celmateriaal en, nog belangrijker, ruimtelijke cel-cel interacties, prestatie onmogelijk is tweedimensionaal (2D) omgevingen. 2D cell scaffolds niet toestaan dat de cellen vrij te communiceren met naburige cellen. Bovendien, de cellen kenmerkend groeien in monolagen (of direct op elkaar), zonder volledige toegang tot de ruimte voor groei en, nog belangrijker, voor interactie. Specifieke ruimtelijke interactie celtypen, zoals neuronen en gliacellen, zijn van het grootste belang bij het ontwerpen van constructen als potentiële implantaten of langdurige experimentele platforms ontworpen om levende systemen weerspiegelen.
Modulaire oplosmiddelvrije LCE synthese met behulp van een metalen mal, afgesloten, voor het aanpassen celadhesie door het afstemmen van de hydrofobe / hydrofiele balans door het kiezen van de juiste centrale knooppunt en van de monomeren 7
De beperkingen van dit protocol zijn: (1) het beperkte aantal commercieel verkrijgbare metaal (nikkel) schuimen en hun beperkte bereik in afmetingen schoor, (2)eis dat de LCE of een ander polymeer / elastomeer materiaal chemisch aan de voorwaarden van de metaaletsen (hier, een FeCl3 ets) moeten weerstaan, en (3) dat celuitlijning lijkt beperkt te zijn tot het vloeibaar kristal gemodificeerde elastomeren hier gerapporteerd (de ouder niet-LCE elastomeren geen merkbare celuitlijning tonen).
Samenvattend heeft eerder aangetoond dat SmA LCEs kunnen worden bereid met modulaire syntheseprocedure. Aanvullende biocompatibele LC groepen kunnen worden opgenomen om de mechanische eigenschappen en nieuwe vloeibaar kristallijne effecten op celproliferatie en vooral celuitlijning verkennen. Het is bekend dat de mechanische eigenschappen, met name moduli waarden Young's, zijn van cruciaal belang voor cel adhesie, proliferatie en celuitlijning. De resultaten hier blijkt dat de porositeit van SmA LCEs kunnen worden afgestemd met behulp van een metalen mal een effectieve manier om de poriegrootte beheersen en LCE maatvorm (dat wil zeggen, totale morfologie). Dompelen van de Ni matrijs in de SCB polymeermengsel, gevolgd door etsen van de Ni template biedt een eenvoudige benadering van nieuwe LCE morfologieën. De schuimachtige LCEs beschreven verschaffen cellen (hier, SH-SY5Y, een standaard celmodel neuronale functie te bestuderen) met een realistischer 3D-omgeving voor groei en interactie. Het toestaan van meerdere celtypen te groeien in meerdere lagen verspreid over het elastomeer nabootst endogene neurale omgevingen en biedt de intrigerende mogelijkheid van meer geavanceerde 3D-weefselkweek experimenten. Het gebruik van instelbare en dynamische LCEs inheemse architecturen na te bootsen maakt de weg vrij voor de volgende generatie mobiele modellen voor langs- en klinisch relevante cel studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag bedanken Kent State University (collaboratief onderzoek te verlenen en steun voor de Regenerative Medicine Initiative aan de Kent State - ReMedIKS) voor de financiële ondersteuning van dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane | Alfa Aesar | L16606 | Silanizing agent |
| 2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane | TCI | B0928 | Reagent |
| 2-chlorohexanone | Alfa Aesar | A18613 | Reagent |
| 2-heptanone | Sigma Aldrich | W254401 | Solvent |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | 278475 | Solvent |
| 3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA | Sigma Aldrich | 273031 | Reagent |
| 4-dimethylaminopyridine | Alfa Aesar | A13016 | Reagent |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI | Invitrogen | D1306 | Nuclear Stain |
| 5-hexynoic acid | Alfa Aesar | B25132-06 | Reagent |
| Acetic acid | VWR | 36289 | Solvent |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850 | Solvent |
| Alcohol 200 proof ACS Grade | VWR | 71001-866 | Reagent |
| Benzene | Alfa Aesar | AA33290 | Solvent |
| ε-caprolactone | Alfa Aesar | A10299-0E | Reagent |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | Solvent |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8503 | Reagent |
| Chromium(VI) oxide | Sigma Aldrich | 232653 | Reagent |
| Copper(I) iodide | Strem Chemicals | 100211-060 | Reagent |
| D,L-Lactide | Alfa Aesar | L09026 | Reagent |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | Solvent |
| Diethyl ether | Emd Millipore | EX0190 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME | CORNING Cellgo | 10-013 | Cell Media |
| Ethanol | Alfa Aesar | 33361 | Solvent |
| Formaldehyde | SIGMA Life Science | F8775 | Fixative |
| Fetal bovine serum, FBS | HyClone | SH30071.01 | Media Component |
| Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe | VWR | 28320 | Filtration |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Central node (3-arm) |
| Hexamethylene diisocyanate, HDI | Sigma Aldrich | 52649 | Crosslinker |
| Iron(III) chloride | Alfa Aesar | 12357 | Etching agent |
| Isopropyl alcohol | VWR | BDH1133 | Solvent |
| Methanol | Alfa Aesar | L13255 | Solvent |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Aldrich | D80002 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Nickel metal template | American Elements | Ni-860 | Foam template |
| Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) | ATCC | CRL-2266 | Cell line |
| Penicillin streptomycin | Thermo SCIENTIFIC | 15140122 | Antibiotics |
| Polyethylene glycol 2000, PEG | Alfa Aesar | B22181 | Reagent |
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | Reagent |
| Sodium bicarbonate | AMRESCO | 865 | Drying salt |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | Drying salt |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S-374 | Drying salt |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma Aldrich | S9638 | Drying salt |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | Drying salt |
| Tetrahydrofuran | Alfa Aesar | 41819 | Solvent |
| Thiosulfate de sodium | AMRESCO | 393 | Drying salt |
| Tin(II) 2-ethylhexanoate | Aldrich | S3252 | Reagent |
| Toluene | Alfa Aesar | 22903 | Solvent |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 471283 | Reagent |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | Cell Detachment |
| Olympus FV1000 |
References
- Khor, E., Lim, L. Y.
- Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
- Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
- Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
- Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
- Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
- Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
- deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
- Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
- Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
- Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
- Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
- Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
- Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
- Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
- Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
- Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
- Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
- Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
- Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
- McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
- Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
- Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
- Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
- Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
- Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9 (2009).
- Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
- Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
- Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
- Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
- Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).
