Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/55452
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 3, 3, 1
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

Summary

מחקר זה מציג מתודולוגיה להכין 3D, מתכלים, פיגומי תא דמוי קצף המבוססים על אלסטומרים גביש נוזלי ביולוגיים בצד שרשרת (LCEs). ניסויי מיקרוסקופיה Confocal מראים כי LCEs דמוי קצף לאפשר התקשרות תא, התפשטות, ואת היישור הספונטני של myoblasts C2C12s.

Abstract

כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד בהכנת פיגום תא 3D, מתכלה, כמו קצף. פיגומים אלה הוכנו על ידי גוש כוכב cross-linking שיתוף פולימרים שמציעות יחידות כולסטרול כמו קבוצה צדדית צד-שרשרת, וכתוצאה מכך-A smectic (SMA) אלסטומרים גביש נוזלי (LCEs). קצף דמוי פיגומים, שהוכנו באמצעות תבניות מתכת, וכוללים microchannels ביניהם, מה שהופך אותם למתאימים כמו פיגומי תרבית תאי 3D. המאפיינים המשותפים של המבנה הרגיל של קצף המתכת של תוצאת אלסטומר ב פיגום תא 3D מקדם לא רק התפשטות תאים גבוהה בהשוואה לסרטי templated הקונבנציונליים נקבוביים, אלא גם לניהול טוב יותר של תחבורה המונית (כלומר, מזינים, גזים, פסולת , וכו '). האופי של תבנית המתכת מאפשר מניפולציה הקלה של צורות קצף (כלומר, לחמניות או סרטים) ועל הכנת הפיגומים בגדלים נקבוביים שונים ללימודי תאים שונים תוך שמירה על interconnecטבע נקבובי טד מהתבנית. תהליך התחריט אינו משפיע על הכימיה של אלסטומרים, שימור הטבע הביולוגי מתכלה שלהם. אנו מראים כי LCEs smectic אלה, כאשר גדלו במשך תקופות זמן נרחבות, לאפשר לימוד בונת רקמות רלוונטית ומורכבת קליניים תוך קידום הצמיחה וההתפשטות של תאי.

Introduction

ישנן מספר דוגמאות של חומרים סינטטיים ביולוגיים ביולוגיים מיועדים ליישום במחקרי תא לשחזור רקמות המכוונים מצורף תא התפשטות 1, 2, 3, 4, 5. היו כמה דוגמאות של חומרים ביולוגיים, המכונים אלסטומרים גביש נוזליים (LCEs), שיכול להגיב לגירויים חיצוניים עם אנאיזוטרופיות מולקולרי מזמין 6, 7. LCEs הם חומרי גירויים-היענות המשלבים את התכונות המכאניות אלסטי של אלסטומרים עם פונקציונליות האופטית והזמנה מולקולרית של גבישים נוזליים 8, 9. LCEs יכול לחוות שינויים בכושר, עיוות מכאנית, התנהגות אלסטית, ואת תכונות אופטיות בתגובת Stim החיצוניUli (כלומר., חום, מתח, אור, וכו ') 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. מחקרים קודמים הראו כי גבישים נוזליים (LCS) יכולים לחוש את הצמיחה ואת הנטייה של תאים 4, 17. יתכן ואז להניח LCEs עשוי להיות מתאים ליישומים ביולוגיים רפואיים רלוונטיים, כוללים תא פיגומים ויישור. דיווחנו בעבר בהכנת הסרטים ביולוגי, מתכלה, יצוק יצוק, ורזה LCEs smectic שמציעה "סוג שוויצרי-גבינה" מורפולוגיה נקבובית 6, 18. גם הכנו LCEs הביולוגית Nematic עם מורפולוגיה כדורית כמו פיגומי צמיחת תאים 19 <sup>, 20. העבודה שלנו נועדה כוונון התכונות המכאניות של חומרים כדי להתאים לאל של הרקמה של עניין 21. כמו כן, מחקרים אלה מתמקדים בהבנת אינטראקציות תא אלסטומר, כמו גם תגובה תאית כאשר אלסטומרים כפופים גירויים חיצוניים.

האתגרים העיקריים היו בחלקם להתאים את נקבוביות של LCEs כדי לאפשר התקשרות תא חלחול דרך המטריצה ​​אלסטומר ועבור להסעת המונים יותר. הנקבובי של שכבות דקות אלה 6 מותר חלחול תא דרך הארי של מטריקס, אבל לא כל הנקבוביות היו מחוברות באופן מלא או היה גודל הנקבוביות קבוע יותר (הומוגנית). אז דיווחנו לאלסטומרים LCE Nematic הביולוגיים עם מורפולוגיות כדוריות. אלסטומרים Nematic אלה שאפשרו את הקובץ המצורף ושגשוגם של תאים, אך הגודל הנקבובי נע רק 10-30 מיקרומטר, אשר מנע או הגבילו את השימוש הללואלסטומרים עם מגוון רחב יותר של שורות תאים 19, 20.

עבודות קודמות של ואח קונג. בנוגע להיווצרות קצף גרפן באמצעות תבנית מתכת "הקרבה" הראה כי קצף גרפן שהיה מתקבל אילו מורפולוגיה נקבובית סדירה מאוד מוכתבת על ידי תבנית המתכת נבחרה 22. מתודולוגיה זו מציעה שליטה מלאה על גודל הנקבובי הנקבובי. במקביל, הסגילות וגמישות של תבנית מתכת לאפשר היווצרות של תבנית שונה המעצב לפני הכנת קצף. טכניקות אחרות, כגון שטיפת חומר 23, בניית תבנית גז 24, או סיבים סובבים אלקטרו 25, 26 מציעות גם הפוטנציאל להכנת חומרים נקבוביים, אבל הם יותר זמן רב, במקרים מסוימים, את הגודל הנקבובי מוגבל רק כמה מיקרומטרים. קֶצֶף-כמו LCEs 3D מוכן באמצעות תבניות מתכת לאפשר עומס תא גבוה; שיעור התפשטות משופר; שיתוף culturing; ו, ואחרון אחרון חביב, ניהול תחבורה המונית טוב יותר (כלומר, מזינים, גזים, ופסולת) כדי להבטיח התפתחות מלאה רקמות 27. קצף דמוי LCEs 3D להופיע גם לשפר יישור התא; זהו ככל הנראה ביחס תליוני LC חישת צמיחת תאים וכיוון תא. הנוכחות של moieties LC בתוך LCE מופיע כדי לשפר יישור התא ביחס למיקום התא בתוך הפיגום LCE. תאים ליישר בתוך תמוכות של LCE, בעוד שום אוריינטציה ברורה שנצפה בהם תמוכות להצטרף יחד (צמתים) 27.

בסך הכל, פלטפורמת פיגום תא LCE שלנו כמדיום תמיכת תא מציעה הזדמנויות לכוון את מורפולוגיה אלסטומר ואת תכונות אלסטיות כדי במיוחד לכוון את היישור (בודדים) סוגי תאים ליצור הורה, סידורים מרחביים oF תא דומה למערכות חיים. מלבד מתן פיגום מסוגל לתמוך ולכוון לצמיחת תרבות תאים לטווח ארוך, LCEs גם לבצע ניסיונות דינמיים, שבו נטייה ואינטראקציות תא ניתן לשנות על לטוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: השלבים הבאים להכנת קצף דמוי LCE 3D באמצעות קופולימר לחסום כוכב 3-זרוע מוצגות באיור 1. עבור תהודה מגנטית גרעינית (NMR) אפיון, ספקטרה נרשמות כלורופורם deuterated (CDCl 3) בטמפרטורת החדר על מכשיר ברוקר DMX 400-MHz ו פנימי הפניה פסגות שיורי ב 7.26. התמר ספקטרום אינפרא אדום (FT-IR) נרשמים באמצעות ספקטרומטר Bruker וקטור 33 FT-IR באמצעות מצב החזרה הכולל מוחלש. לכל שלב של הפרוטוקול הבא, חשוב ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים (PPE).

1. סינתזה של α-כלורו-ε-caprolactone (מונומר) (על פי נוהל באל ז'רום et. 28)

  1. לפני תחילת הסינתזה, לטהר 27 גרם של חומצה 3-chloroperbenzoic כדלקמן:
    1. בשנת 800 מ"ל של מים מזוקקים, להוסיף 1.28 גרם של נתרןמונוהידראט monobasic פוספט ו 8.24 גרם של heptahydrate dibasic פוספט נתרן. התאם את ה- pH 7.4 (באמצעות נתרן הידרוקסידי או חומצה הידרוכלורית) ושמור 30 מיליליטר של פתרון זה; זהו פתרון החיץ.
    2. באמצעות משפך separatory, לפזר חומצה 3-chloroperbenzoic ב 35 מ"ל של אתר diethyl. לשטוף את הפתרון אורגני עם 10 מ"ל של תמיסת חיץ (מוכן בשלב 1.1.1.). חזור על לשטוף שלוש פעמים.
    3. להוסיף 3 גרם של נתרן גופרתי ישירות הפתרון האורגני; סוכן ייבוש זה סופג מים מן הפתרון האורגני.
    4. סנן הפתרון להסיר את סוכן ייבוש. תתרכז התסנין בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 850 mbar ו 40 מעלות צלזיוס.
  2. Solubilize 18.5 גרם של חומצה 3-chloroperbenzoic מטוהרים ב 150 מ"ל של dichloromethane יבש ידי ערבוב באמבטיה קולי; תהליך זה בדרך כלל לוקח 20 דקות. מניח את הפתרון בתוך משפך separatory.
  3. בתוך בקבוק שני-צוואר, מסביב לתחתית,להתמוסס 13.1 גרם של 2-chlorocyclohexanone ב 15 מ"ל של dichloromethane יבש באמצעות בוחש מגנטי תחת גז חנקן. שמור בחישה.
  4. התאימו את המשפך separatory המכיל פתרון חומצה 3-chloroperbenzoic (משלב 1.2) על הבקבוק שני-צוואר בשלב 1.3. לרוקן את המערכת עם גז חנקן. התאם את הפתיחה של משפך separatory כך שפתרון חומצת chloroperbenzoic נופל dropwise לתוך פתרון 2-chlorocyclohexanone (1 טיפה בכל שנייה אחרת) וממשיך לבחוש את התערובת תחת גז חנקן עבור 96 h.
  5. מצננים את תערובת התגובה ל- C ° -20 עבור 1 h כדי לזרז את חומצת מ -chlorobenzoic תוצר לוואי (מ -CBA).
  6. סנן את החומצה מ -chlorobenzoic (-CBA מ ') ולשטוף את הפתרון נותר עם פתרונות רוויים של נתרן תיוסולפט, סודיום ביקרבונט, ומלח.
  7. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 850 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. לטהר את לסבון נוזלי צהוב, צמיג חיוורid ידי זיקוק בלחץ מופחת ב 2.3 Torr ו 96 מעלות צלזיוס.
  8. מעקב אחר הצליחו הסינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR הבא. 1 H NMR (400 MHz, 3 CDCl, [ppm] δ): 4.75-4.68 (מ ', 1H, C H ClCO), 4.37-4.26 (מ', 1H, C H 2 O), 4.18-4.05 (מ ', 1H , O C H 2), ו 2.06-1.58 (מ ', 6 שעות, -C H 2 -) 6, 27.

2. סינתזה של α-שלושה זרוע קופולימר בלוק סטאר (SBC-αCl) על ידי copolymerization פתיחה רינג (שארמה et al. 6 ו Amsden et al. 29)

  1. לפני הסינתזה, silanize כמוסת 20 מ"ל במילויו פתרון 2% (v / v) של 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane ב טולואן ערבוב במשך כ 24 שעות. לשטוף עם אלכוהול איזופרופיל ולייבש אותו על ידי הצבתו בתנור על 140 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. להוסיף 30.64 גרם של ε-caprolactone מזוקקים, 0.5 גרם של α-כלורו-ε-caprolactone, ו 0.25 מ"ל של גליצרול כדי אמפולה. מערבבים בעזרת מערבולת עבור 1 דקות.
  3. מוסיפים 4.90 גרם של D, L -lactide אל אמפולה ולטהר אותו עם חנקן. מניחים את אמפולה בתנור על 120 מעלות צלזיוס כדי להמיס את -lactide D, L; תהליך זה בדרך כלל לוקח בערך 2 h. מערבבים שוב בעזרת מערבולת לוודא שכל התוכן הם גם מעורבים ולהוסיף 66 μL של פח (II) 2-ethylhexanoate (SN (אוקטובר) 2) אל אמפולה.
    הערה: D, L -lactide יהיה להתקרר במהלך תהליך זה יהיה צורך מחדש מחומם בתנור להינמס.
  4. בתוקף לערבב בפעם האחרונה באמצעות מערבולת ולשטוף עם חנקן.
  5. סגור את אמפולה עם פקק גומי. מניח מחט המחוברת צינור ואקום (ריק הבית הוא בדרך כלל מספיק) באמצעות פקק הגומי. הפעילו את הוואקום, באמצעות להבה, להמיס את הצוואר הארוך של הזכוכית, מסובב לאט עד gנַעֲרָה מתמוטטת על עצמו. היזהר שלא להמיס את פקק גומי. לאחר אמפולה היא להבה-אטום, ולמקם אותו באמבט חול, תנור, או גוף חימום מתאים ב 140 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  6. קח את אמפולה ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר.
  7. לשבור את האמפולה על הסימן האטום ו לפזר את הנוזל צמיג מאוד על ידי הוספת 10 מיליליטר של dichloromethane. עבר פתרון משפך separatory.
  8. הכן בקבוק המכיל 100 מ"ל של מתנול קר (מקורר באמצעות אמבטיית קרח יבש / אצטון בטמפרטורה סביב -78 ° C). תקן את המשפך separatory (שלב 2.7) על גבי הבקבוק. התאם את הפתיחה של משפך separatory כך כשתי טיפות נופלות כל (dropwise) השני אחר.
  9. אסוף את המשקע הלבן על ידי סינון (באמצעות מסנן נייר) ומייבשים אותו בתנור ואקום בין C 50 ו 60 מעלות.
  10. מעקב אחר הצלחת סינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR ו- FT-IR הבאים. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3, [Ppm] δ): 5.29-5.03 (מ ', COC H C H 3), 4.43-4.25 (מ', ג H Cl), 4.24-4.12 (m, O C H 2), 4.11-4.03 (t, J = 4.6 הרץ, C H 2 O), 3.80-3.68 (מ ', ג H C H 2), 3.09-2.64 (רחבה, s, O H), 2.39 (t, J = 4.5 הרץ, H α-), 2.33 (t, J = 5.1 הרץ, H α-), ו 1.77-1.25 (מ ', ג H 2, C H 3); FT-IR (1 / λ [ס"מ -1]): 2932 (ים), 2869 (מ '), 1741 (ים), 961 (ים), 866, ו 735 (מ') 6, 27.
    הערה: כדי להכין LCE 3D הידרופילי יותר, להכין קופולימר גוש ליניארי (LBC) במקום SBC, בעקבות copolymerization פתיחת הטבעת (ROP) ההליך המתואר לעיל.
    1. להוסיף 0.3 גרם של פוליאתילן גליקול (PEG), 3.15 גרם ε-caprolactone, 1.0 גרם של α-כלורו-ε-caprolactone, ו 5.0 גרם של D, L-lactide לתערובת בקבוקון silanized.

    3. שינוי סינטטי של α-Cl-שלוש זרועות SBC כדי αN 3 -Three זרוע SBC (SBC-αN 3) (על פי שתרמה et al. 6)

    1. בבקבוק מסביב לתחתית ותחת חנקן, לפזר 5 גרם של SBC-αCl ב 30 מ"ל של יבש N, -dimethylformamide "N.
    2. מוסיפים 0.22 גרם של אזיד הנתרן ולאפשר להגיב הלילה בטמפרטורת החדר.
      זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל; ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים (PPE).
    3. הסר את N, -dimethylformamide "N בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 11 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. ממיסים את תערובת ב 30 מ"ל של טולואן. צנטריפוגה הפתרון שלוש פעמים ב 2800 XG במשך 15 דקות כדי להסיר את המלח יצר. לאדות את טולואן בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 77 mbar ו 40 מעלות צלזיוס.
    4. לעקוב אחר הצלחת ההחלפה תזיד באמצעות 1 H NMR ופסגות FT-IR.
      הערה: -1]): 2928, 2108 (ים, אזיד), 1754 (ים), 1450 (ים), 960 (מ '), 865 (ים), 733 (s), ו 696 (M).

    4. סינתזה של cholesteryl 5-Hexynoate (LC מחצית) (על פי שארמה et al. 6 ו דונלדסון et al. 30)

    1. בבקבוק מסביב לתחתית, לערבב 3 גרם של חומצה 5-hexynoic ו 130 מ"ל של dichloromethane. מצננים 0 ° C באמצעות אמבט קרח.
    2. בעוד בקבוק מסביב לתחתית, לערבב 8.28 גרם של N, -dicyclohexylcarbodiimide "N, 10.3 גרם של כולסטרול, ו 0.2 גרם של 4-dimethylaminopyridine.
    3. העברת dropwise פתרון חומצה 5-hexynoic הבקבוק המכיל את תערובת הכולסטרול ולשמור את התערובת הסופית על 0 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
    4. אפשר לתערובת להתחמם לטמפרטורת החדר למשך הלילה. הסר את משקע dicyclohexylurea וכתוצאה ידי סינון באמצעות מסנן נייר כיתת 415 וזורק אותו.
    5. תתרכז התסנין בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 850 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. ממיסים את שאריות שנאספו 150 מ"ל של הקסאן.
    6. לאדות את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 335 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. מוסיפים 350 מ"ל של אתנול שאריות שמן כדי לאסוף את המוצר הסופי. שטוף את יצר מחוץ לבן מוצק עם אתנול ולייבש המוצר המוצק תחת ואקום ב 50 מעלות צלזיוס.
    7. צג את הסינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR ו- FT-IR הבאים. 1 H NMR (400 MHz, 3 CDCl, [ppm] δ): 5.39 (ד, י = הרץ 4.7, 1H, C H = C), 4.70-4.58 (מ ', 1H, C H OCO), 2.44 (t, J = 2.5 הרץ, 2H, C H 2 CO), 2.34 (מ ', 2H, C H 2 -C H =), 2.31 (מ', 2H, C H 2 C H 2 -COO), 2.28 (ים, 1H, HC≡C), 2.27 (ד, י = 2.3 הרץ, 2H, ≡CC H 2), 2.07-1.06 (מ ', 2H, 2 C H, C H), 0.94 (ים, 3H, C H 3), 0.89 (ד, י = 1.8 הרץ, 3H, C H 3 C H), ו 0.88 (ד, י = 1.8 הרץ, 6H, C H 3 -C H), 0.67 (ים, 3H, C H 3). FT-IR (1 / λ [ס"מ -1]): 2,830-2,990 (רחבה השיא חזק), 2104 (מ '), 1695 (ים), 1428 (מ'), 1135 (מ '), 999 (ים), 798 (ים), ו 667 (ים).

    5. שינוי סינטטי של α-N 3 SBC זרוע -Three כדי אלפא-cholesteryl-שלוש זרועות SBC (SBC-αCLC) באמצעות תגובה תזיד-אלקין Huisgen סקל-כן ( "לחץ" תגובה) כדי להשיג SBC-צ'ול (פי שארמה et al. 6)

    1. בבקבוק מסביב לתחתית, לפזר 1 שווה טוחנת של 3 SBC-αN (1.5 גרם) ב 100 מ"ל של tetrahydrofuran מזוקקים טרי (THF). להוסיף 1.2 equivalen טוחנתt של cholesteryl 5-hexynoate (1.94 גר '), 0.1 שווה ערך טוחן של הנחושת (I) יודיד (0.06 גרם), ו 0.1 מקבילה טוחנת של triethylamine (0.03 גר'). מערבבים את התערובת לילה בשעה 35 ° C תחת חנקן.
    2. לאדות את הממס בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 357 mbar ו 40 מעלות צלזיוס.
    3. ממיסים את תערובת שיורית 80 מ"ל של dichloromethane צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 2800 XG בטמפרטורת החדר כדי להסיר חומרים unreacted ומוצרי לוואי.
    4. צג את הסינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR ו- FT-IR הבאים. 1 H NMR (400 MHz, 3 CDCl, [ppm] δ): 7.54 (ים, CH = C-triazole), 5.43-5.34 (מ ', כולסטרול C = CH), 5.10-5.06 (מ', COCHCH 3), 4.68 -4.55 (m, O-CH כולסטרול), 4.24-4.19 (מ ', CH 2 O), 4.18-4.13 (t, J = 5.0 הרץ, CH 2 O), 4.11-4.05 (t, J = 4.4 הרץ, CH 2 O), 2.47-2.41 (t, J = 4.9 הרץ, COCH 2), 2.31-2.25 (מ ', COCH 2), 2.07-1.02 (מ', CH 2 3), 1.05-1.03 (ים, 2 CH, CH 3), 0.96-0.92 (ד, י = 3.3 הרץ, 2 CH, CH 3), 0.91-0.87 (dd, J = 1.9 הרץ, J = 1.8 הרץ, CH 3), ו 0.71-0.68 (ים, CH 3). FT-IR (1 / λ [ס"מ -1]): 3260 (ים), 2920 (ים), 1710 (ים), 1460 (ים), 1370 (ים), 1240 (מ '), 1190 (ים), 733 (ים), ו 668 (ים).

    6. סינתזה של 2,2-Bis (1-caprolactone-4-י.ל) פרופאן (crosslinker, BCP) (על פי גאו et al. 27 ו Albertsson et al. 31)

    1. בבקבוק מסביב לתחתית, להכין תמיסה המכילה 10.8 גרם של 2-BIS (4-הידרוקסי-cyclohexyl) פרופן 52 מ"ל של חומצה אצטית.
    2. הכן תמיסה המכילה 11 גרם של trioxide כרום ב 50 מ"ל של חומצה אצטית ו 8 מ"ל של מים מזוקקים. הוספת dropwise פתרון זה הפתרון מוכן בשלב 6.1, תוך שמירה על טמפרטורת התערובת בין 17 לבין 20 ° C (למשל, בתוךאמבטיית מים); תהליך dropwise זה לוקח 2 h. לאחר השלמת התהליך, ולאפשר הפתרון ומערבבים במשך כ 30 דקות.
    3. להוסיף 50 מ"ל של 2-פרופנול. מערבבים את הפתרון הלילה בטמפרטורת החדר.
    4. תתרכז הפתרון הסגול הכהה בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי ב 137 mbar ו 40 מעלות צלזיוס. מוסיפים 300 מ"ל מים מזוקקים כדי לזרז; המשקע צריך להיות אור סגול.
    5. תסנין המוצר הגולמי באמצעות מסנן נייר כיתת 415. לשטוף את החומר המוצק עם ~ 250 מ"ל של מים מזוקקים או עד מוצק הופך לבן.
    6. ממיסים את החומר המוצק ב 15 מ"ל של בנזן על 40 ° C ולתת לו recrystallize ב 25 מעלות צלזיוס.
    7. מוסיפים 8.34 גרם של יבש diketone מומס dichloromethane יבש בתמיסה המכילה 6.0 גרם של חומצה 3-chloroperbenzoic ב 75 מ"ל של dichloromethane אל הבקבוק.
    8. ריפלוקס הפתרון ב 40 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    9. מצננים את התערובת התגובה -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לזרז את מ '
    10. הסר חומצה מ -chlorobenzoic ידי סינון (באמצעות מסנן נייר) ולרכז הפתרון בלחץ מופחת.
    11. לשטוף את המוצר הגולמי ויסקוזה עם 200 מ"ל של 2-heptanone ולייבש המשקע תחת ואקום ב 50 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    12. צג את הסינתזה באמצעות פסגות 1 H NMR ו- FT-IR הבאים. 1 H NMR (400 MHz, 3 CDCl, [ppm] δ): 4.42-4.37 (dd, J = 14.2, 7.4 הרץ, 2H, C H 2 OC = O), 4.21-4.15 (t, 2H, J = 11.3 הרץ, C H 2 OC = O), 2.80-2.75 (DDT, J = 14.3, 6.5, 1.6 הרץ, 2H, COO C H 2), 2.63-2.57 (TT, J = 13.3, 2.1 הרץ, 2H, C H COO 2), 2.04-1.93 (M, 4H, -C H 2 CH 2 OC = O), 1.70-1.56 (מ ', 4H, -C H 2 C H 2 COO), 1.48-1.38 (מ', 2H, - C H C (CH 3) 2), ו 0.84 (ים, 6H, C H 3 C-).
      13. 7. יצירת הפיגום אלסטומר 3D נקבובי שימוש או Hexamethylene diisocyanate (HDI) או 2,2-Bis (1-caprolactone-4-י.ל) פרופאן (BCP) 27 כפי crosslinkers (על פי גאו et al. 27)

      1. הכן תערובת אלסטומר תלת הזרוע באמצעות 0.75 גרם של SBC-αCLC ידי הוספת 0.25 מ"ל של HDI (או 0.45 מ"ל של BCP) ו 0.24 מ"ל של מונומר ε-caprolactone מזוקקים. להוסיף 60 μL של Sn (אוקטובר) 2. אם באמצעות BCP במקום HDI, לערבב SBC-αCLC ו BCP בעזרת מערבולת למקם אותם בתנור על 140 מעלות צלזיוס עד BCP מלא נמס ומתפוגג (שלב זה יכול להימשך עד 2 h). לאחר BCP כבר מומס, לקחת אותה מהתנור ו, את המספר הסידורי (אוקטובר) 2, ו מערבולת.
      2. הכין תבנית קצף ניקל "הקרבה" על ידי חיתוך פיסת מתכת סנטימטר 1 x 4. מרדד אותו מאחד הקצוות הקצרים כך הרול הסופי היא כ פיסת מתכת 1 x 1 סנטימטר (ראה איור 4).
        3. <li> שים את קצף ניקל בתוך אריזת אלומיניום בקבוקון או אלומיניום זכוכית ויוצק את התערובת המוכנה בשלב 7.1 כדי לכסות את הקצף מלא עבור 2 דקות. הסר את התערובת העודפת עם pipet פסטר. עזוב את זה לכל הלילה בתנור על 80 מעלות צלזיוס.
      3. לקלף את רדיד האלומיניום או לשבור את הכוס. באמצעות סכין גילוח, לגלח אלסטומר ברחבי קצף מתכת לחשוף את המתכת ניקל.
      4. כן 1 ברזל M (III) כלוריד (FeCl 3) פתרון 100 מ"ל מים. מניחים את הקצף בבקבוק ולהוסיף 70 מ"ל של תמיסת 3 FeCl. מערבבים במשך שלושה ימים בטמפרטורת החדר ולשנות הפתרון FeCl 3 כל יום. לפני כל שינוי, לעורר את הקצף עם מים מיוננים, 0.5 h.
        הערה: תהליך האיכול מושלם בדרך כלל לאחר שלושה ימים. כדי להבטיח כי תהליך האיכול יושלם, לבצע בדיקות דחיסת מישוש עד הקצף מרגיש רך. התנגדות קצף כדי בדיקות דחיסת מישוש מעידה על קיומו של תבנית מתכת שיורית.
      5. יש לשטוף את Elastעומר קצף עם אתנול ומקום בחלל ריק בתנור הלילה בשעה 40 ° C.
      6. לאפיין את החומרים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), סריקה calorimetry דיפרנציאלי (DSC), בדיקות דחיסת מכני, ו גרווימטריה תרמית (TGA) 27.
        הערה: להכנת LCE 3D הידרופילי יותר, להחליף את SBC עם LBC (מוודא כי LBC מכיל גם מחצית LC) ביצוע השלבים המתוארים בשלב 7.5.

      8. זריעה של הפיגום אלסטומר עם SH-SY5Y נוירובלסטומה תאים והתרבות שימוש בטכניקות סטריליות

      1. לעקר את אלסטומר ידי שטיפה פעמיים עם 1 מ"ל של אתנול 70%. בצעו קרינה UV במשך 10 דקות ולשטוף עם 1 מ"ל של אתנול 70%. יש לשטוף אותו פעמיים עם 1 מ"ל של מים סטריליים ו 1 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). מניחים את אלסטומרים צלחות תרבות 24-היטב.
      2. הכן בינוני צמיחת תאים עבור-SY5Y SH המכיל 90% Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) supplemented עם 10% בסרום שור העובר (FBS) ו 1% פניצילין, סטרפטומיצין (עט-סטרפטוקוקוס).
      3. לאחר ספירת תאים באמצעות hematocytometer, להכין 1.5 x 10 5 תאים SH-SY5Y מושעה ב 100 μL של מדיום הגידול (פתרון זרע). מוסיפים את הפתרון על גבי אלסטומרים, והקפד ליצור ירידה.
      4. דגירה אלסטומרים זורעים C 37 ° ו 5% CO 2 עבור 2 h כדי לקדם את הידבקות התא. להוסיף 0.5 מ"ל של מדיום הגידול. דגירה שוב ב- C ° 37 עם 5% CO 2.
      5. שינוי המדיום פעם ביומיים לאחר שטיפה עם 1 מ"ל של PBS.

      9. הדמיה מיקרוסקופית של Construct אלסטומר

      1. תקן את התאים גדלו לאלסטומרים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS עבור 15 דקות. לשטוף עם 3 מיליליטר של שלוש פעמים PBS עבור 5 דקות כל אחד והמקום אלסטומר עם התאים הקבועים בצלוחית-תרבית עם coverslip מצורפת.
        זהירות: PFA הוא רעיל. ללבוש ביגוד מגן אישי מתאים (PPE).
      2. Staבדגימות קבוע עם 0.1% של 4' , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב 500 μL של PBS עבור 10 דקות ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS עבור 5 דקות.
      3. מייד תמונה אלסטומרים באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם קרינת DAPI, רכישת ערימות תמונה שמשתרעות המדגם.
        הערה: כאן, ערימות תמונה נרכשו באמצעות אובייקטיבי 20X ו 60X מטרה.
      4. נתח את ערימות תמונת confocal האופטית באמצעות ImageJ 32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוח זה מציג את שיטת ההכנה של LCE 3D נקבובי כמו פיגום עבור תרבית תאים באמצעות תבנית מתכת ניקל. LCE 3D המתקבל מדגים רשת ערוץ ביניהם מורכבת המאפשרת חדירה לתא קל, כמו גם 27 להסעת המונים מתאים יותר. נמצא כי תאים מסוגלים לחדור לרשת הערוץ המחוברת באופן מלא והם גם מסוגלים ליישר בתוך LCE. הנה, קצף ניקל מטאל (99% ניקל, צפיפות של 860 גרם / ס"מ 2) נבחר בעקבות בגישה דומה להכנת קצף גרפן שפורסמו בעבר על ידי קונג ואח. 22. קצף המתכת היה casted פולימר, עם כל תמוכות המתכת המכוסות במלואו. הבחירה של גודל קצף מתכת והצפיפות חשובה, כפי שהוא מקנה את המורפולוגיה הסופית של LCE ויכול לעזור מחק את סביבת הרקמות של עניין.

גיל = "1"> הכנת יציקת הפולימר מבוססת על crosslinking של קופולימר גוש כוכב תלת זרוע מבוסס גליצרול (SBC) באמצעות פילמור טבעת-פתיחה (ROP). המונומרים הם ε-caprolactone, ε-caprolactone שונה (מסונתז לצורך הוספת אטום הלוגן כי מאוחר יוחלפו על ידי מחצית LC), ו- D, lactide L- (איור 2). התוצר הסופי הוא SBC 3-זרוע הידרופובי. בקרי גבול הפעלה עם 4 ו 6 זרועות, שנעשו על ידי החלפת צומת גליצרול עם pentaerythritol ו dipentaerythritol, בהתאמה, דווחו בעבר 18. לקבלת חומר הידרופילי SBC, הצומת המרכזית הוחלפה תחמוצת oligoethylene (עיין בהערות הפרוטוקול). עם זאת, החלפת גליצרול עם תוצאות תחמוצת oligoethylene ב קופולימר גוש ליניארי 27. השתמשנו סינתזה שונה מן יונס ואח '. 29. הגירסה ששונתה מאפשר שימוש של ε-CA שונהprolactone עם קבוצת הלוגן בשתי עמדות שונות, אלפא גמא אל קרבוניל 6. לאחר SBC נוצר, בלוק ε-caprolactone השונה סובל עקירה של אטום ההלוגן עם קבוצה תזיד. העקירה של קבוצת ההלוגן ידי הקבוצה יזיד אושר על ידי הופעתו של 2100 סנטימטר - 1 להקה באמצעות החזרה הכולל מוחלשים (ATR) FT-IR (איור 3). הקבוצה תזיד משמשת מאוחר לצרף מחצית LC קוולנטית (hexynoate cholesteryl) אל קופולימר לחסום כוכב באמצעות אלקין-תזיד תגובת cycloaddition של Huisgen (המוכרות גם בשם "תגובת לחץ"), קבלת קופולימר לחסום כוכב הסופי עם צד יחידת תליון כולסטרול -chain (SBC-צ'ול). ההיווצרות של טבעת triazole אושר על ידי ההיעלמות של 2100 סנטימטר - הלהקה 1 וההופעה וגופייה שנצפתה 7.30 ppm בספקטרום 1 H NMR (ראה איור3). דיווחנו לאחרונה על ההשפעה של המיקום של קבוצת הלוגן או אלפא (α -Br) או גמא (γ-Cl) אל קרבוניל על פונקציונליות ε -CL 6. יצוין כי החלפת צומת המרכזי-פולימרי שיתוף SBC עם 4-זרוע ליבות מרכזיות 6-יד יש השפעה על התכונות המכאניות של LCEs שהושג בגלל צומת המרכזיים לשמש הן יוזמים מהותי צולבות linkers 18 .

לאחר SBC-צ'ול הוכן מאופיין במלואו, תהליך crosslinking באמצעות תבנית מתכת הוא הצעד האחרון עבור הכנת קצף. ה- SBC-צ'ול היה מעורבב עם diisocyanate hexamethylene (HDI, crosslinker), ε-caprolactone, ו Sn (אוקטובר) 2 (ROP זרז, ראה שלב 7.1). ה- BIS-caprolactone (BCP) crosslinker הוחלף HDI, כפי שדווח בעבר. קצף המתכת הוא לגזור בצורה אל f הרצויORM (איור 4). שני נתיבים עבור הכנת קצף, כלומר נקבובי הראשוני (LCEF PP) ו יסודי / נקבובי משנית (LCEF P + SP), דווחו בעבר. כאן, LCEF P + SP, או "הטבילה", שיטה, מוצגת, שבו תבנית ניקל טבולה במהירות את תערובת הפולימר. קצף המתכת מושם בתוך מכולה מנייר אלומיניום או בקבוקון נצנץ המכיל תערובת הפולימר, עם כל תמוכות המתכת שקועות לגמרי את תערובת הפולימר. תערובת הפולימר העודפת מוסר בזהירות. תבנית ניקל פולימר מכוסים זו מושמת לילה, עדיין בתוך המכל, בתנור על 80 מעלות צלזיוס. Crosslinking מתבצע בנוכחות זרז על 2 h. לאחר תהליך crosslinking, תבנית ניקל מכוסי הפולימר יוסרה מיכל שלו על ידי קילוף נייר האלומיניום או לשבור את מכל הזכוכית. הפולימר העודף הוא מגולח בקפידה מן templ ניקל מכוסי הפולימראכלו לחשוף את הקצוות של התבנית ניקל ממוקם בתוך מיכל עם פתרון FeCl 3 רווי (איור 5). אחרי כמה שעות, הניקל הוא כמעט שהוסר לחלוטין, ורק קצף LCE הוא שטף עם יונים (DI) מים כדי לסלק את ניקל / FeCl פתרון 3. הקצף LCE שוב מושם בתוך מכולה עם פתרון FeCl 3 רווי ושטף במים DI עוד פעמיים. לאחר תהליך האיכול יושלם ואת תבנית ניקל כולה מתבטלת לגמרי, קצף LCE מציג רשת ערוץ מחוברת עם תמוכות חלולות (איור 6). איור 6 מראה את המורפולוגיה LCE קצף פנימי נצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). תמוכות קצף LCE הן חלולות, ואת המורפולוגיה הסדירה הכוללת מותנית תבנית קצף ניקל.

בעבר, השימוש BCP נדרש מספר שלבים כדי לשמור אותו solution (כלומר, מומסת), כי BCP מתחיל recrystallize בהקדם הפתרון מתקרר על ידי כמה מעלות (מ 140 ° C לטמפרטורת החדר כדי להוסיף את Sn (אוקטובר) 2; ראה שלב 7.1). זה עושה המניפולציה של תערובת קצף פולימר מתכת המאתגרת לפני crosslinking. השימוש HDI בתור crosslinker מותר לזמן crosslinking מהר יותר בעת שימוש BCP. BCP הוא מוצק בטמפרטורת החדר, עם נקודת התכה של 140 מעלות צלזיוס, ואילו HDI הוא נוזלי בטמפרטורת החדר. הבחירה של crosslinkers משפיעה ישירות על הזמן הכנה, כמו במקרה שלנו, הקטין את טמפרטורת crosslinking מן 140 עד 80 ° C, גם הפחתת הכנת אלסטומר.

קצף LCE נבדק באמצעות דחיסה-עיוות (סרט 1). הפחתת 70% בגודל LCE הוא ציין, ללא השפעה על ממדים כוללים. עם שחרורו של דחיסה מן LCE, זה לגמרי מתאושש ים המקוריhape וגודל. הוא האמין כי נוכחותו של moieties הגביש הנוזלי בחומר LCE היא קריטית, כפי אלסטומרים הכינו באותם התנאים בלי לחסום cholesterol- ε -caprolactone לא לשחזר את צורתו המקורית שלהם והתמוטטו לתוך עצמם.

לאחר קצף LCE התקבלו, הם היו מוכנים זורעים עם נוירובלסטומה (SH-Sy5Y) באמצעות טכניקות תרבית תאים סטנדרטיים. קצף LCE נשטף פעמים באתנול 70% ושטף שלוש פעמים עם PBS לפני זריעת תאים. בתוך 2-3 ימים של זריעת תאים, התאים נצפו לצרף קירות רשת LCE 3D. כדי ללמוד תא מצורף והרחבת במלואה בתוך רשת LCE, תאים היו קבועים לאחר 30 ימים (איור 7). התאים היו קבועים, מגואלות DAPI, צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. התאים נמצאו התרבו, מצורף, והרחיב כדי לכסות את רשת פיגום LCE 3D בהרחבה. נוסףניתוח יותר, מפורט גילה התארכות גרעיני תאים, אשר ברוב המקרים לא הושפעה החלקים המעוגלים של רשת פיגום 3D LCE. התארכות תא יכולה גם להיות מתואמת יישור תא היא ככל הנראה התוצאה של מאפיין smectic-שלב א של LCE שהוצג. זו נצפתה בעבר C2C12 תאים שגודלו לאחר 14 ימים 27. במחקר זה, אנו מראים כי התאים ממשיכים להתרבות במשך יותר מ 14 ימים; זו אינה מוגבלת תאי C2C12 לבד. שימוש קצף LCE ניתן להרחיב כמעט לכל קו תא. תאים גדלו על פיגומי קצף דמוי LCE 3D ליהנות יעיל להסעת המונים גבוהה לעומת פיגומי 2D. פיגומים 2D, התאים גדלים בדרך כלל בשכבות, על גבי זו. תאים גדלו על השכבות העליונות הם היחידים שיש להם גישה מלאה לכל המזינים, גז, ופינוי פסול (להסעת המונים). תאים בתוך השכבות התחתונות אינם יכולים לגשת מזינים, ויש רמה גבוהה יותר של התא דeath במקרה הזה. בתוך פיגומי 3D, יש לתאים יעיל יותר (לעומת פיגומי 2D) גישה מזינה, גורמי גדילה, וגזים, המתיר מחקרי התחדשות תאים ורקמות לטווח ארוכים. תא פסולת וניהול (סילוק פסולת) באמצעות פיגומי LCE 3D דמוי קצף הוא גם יעיל יותר מאשר פיגומי 2D. הנקבובי (ו / או תכונות מבניות אחרות) של LCEs מאפשרים להסעת המונים מהירה וטעינת תא גדלה לעומת פחות נקבוביות (או אחרות) מטריצות, מדיה המאפשרת גישה סלולרית לאזורים המרכזיים של מטריקס. פלטפורמת LCE זה היא מתכונן כדי לתמוך בצמיחה של סוגים רבים של שורות תאים ראשוניות הנציחו, כולל שרירים, עצבים, עור, בין יתר, כמו גם מערכות תרבות רבות תאיות. בעיקרו של דבר, זה אחד היתרונות של הפלטפורמה, שכן הוא יכול לשמש כדי לגדול סוגי תאים שונים ומערכות לפרקי זמן ממושכים. בנוסף, היכולת לגדול מספר שכבות של תאים בתוך המבנה הדוק יותר Emulסביבות טבעיות אטס.

איור 1
איור 1: נוהל כללי המתאר את צעד אחר צעד הכנה ואפיון של קצף LCE. עיין בסעיף הפרוטוקול לפרטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ערכת Crosslinking של SBC 3-זרוע. תכנית crosslinking של SBC 3-הזרוע באמצעות biscaprolactone או HDI כמו צולבות linkers בנוכחות תבנית מתכת הניקל להכנת LCEs קצף דמוי מוצגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של figu זהמִחָדָשׁ.

איור 3
איור 3: תכנית של היווצרות 1,2,3-triazole (מוצלחת "לחץ" תגובה) ואחריו 1 H NMR ו- FT-IR. העקירה של קבוצת ההלוגן ידי הקבוצה יזיד אושר על ידי הופעתו של 2100 סנטימטר - 1 החזרה הכולל מוחלשת באמצעות להקה (ATR) FT-IR. ההיווצרות של טבעת triazole אושר על ידי ההיעלמות של 2100 סנטימטר - 1 להקה ואת המראה של וגופייה, שנצפה 7.30 ppm בספקטרום 1 H NMR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: תמונות אופטיותצורות קצף שונות לפני crosslinking. קצף המתכת הוא לגזור בצורה לטופס הרצוי, כמוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: ניקל קצף לפני (א) ואחרי (B) crosslinking. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: מורפולוגיה קצף LCE נצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). תמונות SEM נציג של קצף LCE על מבוססי SBC (A ו- B) ו-מבוסס LBC (ג ד) באמצעות Ni-860 כתבנית מתכת מוצגים. החצים מצביעים תמוכות חלולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
Micrographs Confocal מוצג גרעינים מוכתמים DAPI של תאי SH-SY5Y מצורף קצף אלסטומר 30 ימים לאחר זריעה: איור 7. תמונות 2D נערמו z -direction, ותמונות חתך ב XZ - ו -planes YZ נוצרו. התמונות מראות כי תאי SH-SY5Y (כתמים בהירים) מצורף מורחב בין כותלי הערוצים החלולים בקצף אלסטומר. התאים מורחבי מרחבית לתוך שכבות מרובות המורחבת מעל 100 מיקרומטר באמצעות המבנה (כמוצג XZ - ותמונת -plane YZ שניות צלבשום הגבלות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט 1
סרט 1: תמונות וידאו של עיוות והתאוששות של גליל LCE. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון הזה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אלסטומרים גבישי נוזלים נחקרו לאחרונה כמו פיגומי תא ביולוגיים עקב היענות הגירויים שלהם. הם הוכחו להיות פלטפורמות אידיאליות כמו פיגומי תא. עם זאת, גורם חשוב לזכור בעת הכנה ועיצוב פיגום LCE חדש הוא נקבובי. השילוב של מוצקי leachable 23 או גזים לא תמיד לגרום נקבוביות הומוגנית או נקבובי מחובר באופן מלא. השימוש בתבנית מתכת שניתן משורטטת לא רק מציע את ההזדמנות להיות בעל מבנה פנימי יותר מאורגן רגיל, אלא גם מאפשר את הבחירה של גודל נקבובי וצפיפות. זה קשור ישירות לתבנית המתכת המשמשת בעבר להכנת קצף גרפן 22. תבניות מתכת גם מספקות את ההזדמנות כדי ליצור צורות לפני crosslinking LCE, המתיר מגוון רחב של אפשרויות ליצירת ארכיטקטורות מתוחכמות ומורכבות עם דה הנקבובית קבועהחתם להידמות סביבות אנדוגניים מקרוב. LCEs הקצף מוכן באמצעות מתודולוגיה זו מאפשרת לחקר המשופר של חומר תא, וחשוב יותר, אינטראקציות בין תאים מרחבית, הישג בלתי אפשרי בתוך הסביבות דו-ממדיות (2D). פיגומי תא 2D אינם מאפשרים לתאי אינטראקציה בחופשיות עם תאי שכנים. בנוסף, התאים בדרך כלל לגדול monolayers (או ישירות על גבי זו), ללא גישה מלאה מרחב לצמיחה, וחשוב יותר, לאינטראקציה. סוגי תאים ספציפיים מרחבית אינטראקציה, כגון נוירונים ותאי גלייה, הם בעלי חשיבות עליונה בעת תכנון מבנים כמו שתלים פוטנציאל או פלטפורמות ניסיון לטווח ארוך שנועדו לשקף מערכות חיים.

מודולרי שלנו, סינתזת LCE ממיס חינם באמצעות תבנית מתכת, המוצג כאן, עוזר להתאים הידבקות תא על ידי כוונון האיזון הידרופובי / הידרופילי ידי בחירת הצומת המרכזית הנאותה והיחס של מונומרים 7 27. זה רלוונטי עבור זריעת תאים על מנת למנוע את צעד נוסף הכולל תוספת של שכבת Matrigel, בדרך כלל נעשה כדי לקדם מצורף תא. הכמות והגודל של הצומת המרכזית, כמו גם את crosslinker, ממלאי תפקידים קריטיים LCE הסופי, כפי שהם משפיעים על תכונות תרמיות מכאניות של אלסטומרים LC. בנוסף, זה גם מאפשר הכוונון של שיעורי הפריקות הביולוגיים, כפי שהוצג לפני, כדי להתאים את ההתחדשות המלאה של רקמות כמו LCE מדרדרת 6. נכון לעכשיו, יש לנו ניסויים מתמשכים התמקדות חוקר כיצד סוג מקשר צולב, ליבה מרכזית, והחלפת D, L -lactide עבור L -lactide משפיע על תכונות אלסטיות, הידבקות תא, התפשטות, ויישור תאים.

המגבלות של פרוטוקול זה הן: (1) המגוון המצומצם של מתכת זמינה מסחרי (ניקל) קצפי הטווח המוגבל שלהם בממדי יתד, (2) אתדרישה כי LCE או כל חומר פולימרים / אלסטומר אחר חייב להתנגד לתנאים כימיים של לחרוט מתכת (פה, לחרוט 3 FeCl), ו (3) עובדת יישור תא נראה יוגבל ל אלסטומרים הגביש שונים הנוזלים דיווחו כאן (אלסטומרים הלא-LCE הורה לא הראו שום יישור תא ניכר).

לסיכום, הוכח בעבר כי LCEs SMA ניתן להכין באמצעות הליך סינתזה מודולרית שלנו. moieties LC הביולוגי נוסף יכול להיות משולב כדי לחקור תכונות המכאניות שלהם ואת השפעות גבישי נוזלי חדשות על התפשטות תאים, במיוחד, יישור תא. זה ידוע כי תכונות מכניות, במיוחד בערכים moduli של יאנג, הם קריטיים עבור הידבקות התא, התפשטות, ויישור תאים. התוצאות המוצגות כאן מראות כי הנקבובי של LCEs SMA יכול להיות מכוונות באמצעות תבנית מתכת כדי לספק דרך יעילה לשלוט על הגודל הנקבובי כדי להתאים את LCEצורה (כלומר, הכולל מורפולוגיה). טובל את תבנית Ni לתוך תערובת פולימר SCB, ואחריו תחריט תבנית Ni מספק גישה קלה מורפולוגיה LCE חדשות. LCEs דמוי הקצף המתואר כאן לספק תאים (כאן, SH-Sy5Y, מודל תאים סטנדרטי ללמוד תפקוד עצבי) עם מציאותית יותר, סביבת 3D לצמיחה ואינטראקציה. התרת סוגי תאים מרובים לגדול בשכבות מרובות המפוזרות ברחבי אלסטומר יחקה סביבות עצביות אנדוגניים ומציע את האפשרות המסקרנת של ניסויים בתרבית רקמת 3D מתוחכמים יותר. שימוש LCEs מתכונן והדינמי לחקות ארכיטקטורות מקוריות סולל את הדרך עבור דגמים סלולריים מהדור הבא ללימודי תא אורכיים רלוונטיים קליני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות קנט סטייט (מענק מחקר שיתופי התמיכה ביוזמת רפואה רגנרטיבית באוניברסיטת קנט - ReMedIKS) עבור תמיכה כספית של הפרויקט הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane Alfa Aesar L16606 Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane TCI B0928 Reagent
2-chlorohexanone  Alfa Aesar A18613 Reagent
2-heptanone  Sigma Aldrich W254401 Solvent
2-propanol  Sigma Aldrich 278475 Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA Sigma Aldrich 273031 Reagent
4-dimethylaminopyridine Alfa Aesar A13016 Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI  Invitrogen D1306 Nuclear Stain
5-hexynoic acid  Alfa Aesar B25132-06 Reagent
Acetic acid VWR 36289 Solvent
Acetone Sigma Aldrich 34850 Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade  VWR 71001-866 Reagent
Benzene Alfa Aesar AA33290 Solvent
ε-caprolactone  Alfa Aesar A10299-0E Reagent
Chloroform VWR BDH1109 Solvent
Cholesterol Sigma Aldrich C8503 Reagent
Chromium(VI) oxide Sigma Aldrich 232653 Reagent
Copper(I) iodide Strem Chemicals 100211-060 Reagent
D,L-Lactide  Alfa Aesar L09026 Reagent
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Solvent
Diethyl ether  Emd Millipore EX0190 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME  CORNING Cellgo 10-013 Cell Media
Ethanol Alfa Aesar 33361 Solvent
Formaldehyde  SIGMA Life Science F8775 Fixative
Fetal bovine serum, FBS  HyClone SH30071.01 Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe VWR 28320 Filtration
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI Sigma Aldrich 52649 Crosslinker
Iron(III) chloride  Alfa Aesar 12357 Etching agent
Isopropyl alcohol VWR BDH1133 Solvent
Methanol Alfa Aesar L13255 Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Aldrich D80002 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Nickel metal template American Elements Ni-860 Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) ATCC CRL-2266 Cell line
Penicillin streptomycin  Thermo SCIENTIFIC 15140122 Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG Alfa Aesar B22181 Reagent
Sodium azide  VWR 97064-646 Reagent
Sodium bicarbonate AMRESCO 865 Drying salt
Sodium chloride BDH BDH9286 Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S-374 Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma Aldrich S9638 Drying salt
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313 Drying salt
Tetrahydrofuran Alfa Aesar 41819 Solvent
Thiosulfate de sodium AMRESCO 393 Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate Aldrich S3252 Reagent
Toluene Alfa Aesar 22903 Solvent
Triethylamine Sigma Aldrich 471283 Reagent
Trypsin HyClone SH30042.01 Cell Detachment
Olympus FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9 (2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

Tags

Bioengineering גיליון 122 Liquid Crystal אלסטומרים פיגומים נקבוביים 3D פיגומי Cell ויישור תאים תא כיווני ביולוגי
סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prévôt, M. E., Ustunel,… More

Prévôt, M. E., Ustunel, S., Bergquist, L. E., Cukelj, R., Gao, Y., Mori, T., Pauline, L., Clements, R. J., Hegmann, E. Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (122), e55452, doi:10.3791/55452 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter