Summary
Diese Studie stellt eine Methode zur Herstellung von 3D, biologisch abbaubare, schaumartige Gerüste Zelle basierend auf biokompatible Seitenkettenflüssigkristall Elastomere (LCEs). Die konfokale Mikroskopie Experimente zeigen, dass schaumartige LCEs ermöglichen Zellanheftung, Proliferation und die spontane Ausrichtung der C2C12s Myoblasten.
Abstract
Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt Herstellung eines 3D, biologisch abbaubaren, schaumartige Zellgerüst. Diese Gerüste wurden hergestellt durch vernetzende Stern-Block-Copolymere mit Cholesterin-Einheiten als Seitenketten-Seitengruppen, die sich in der smektischen A (SmA) Flüssigkristall Elastomere (LCEs). Schaumartige Gerüste, hergestellt Metall Vorlagen verfügen miteinander verbundene Mikrokanäle, so dass sie geeignet als 3D-Zellkulturgerüste. Die kombinierten Eigenschaften der regelmäßigen Struktur des Metallschaums und des Elastomer Ergebnis in einem 3D - Zell Gerüst , das nicht nur eine höhere Zellproliferation im Vergleich zu herkömmlichen porösen Templat Filme, sondern auch eine bessere Verwaltung der Massentransport (dh Nährstoffe, Gase, Abfall fördert usw.). Die Art der Metallschablone ermöglicht die einfache Bearbeitung von Schaumformen (dh Rollen oder Folien) und zur Herstellung von Gerüsten unterschiedlicher Porengrößen für unterschiedliche Zellstudien unter Beibehaltung die interconnected poröse Natur der Vorlage. Der Ätzprozess wirkt sich nicht auf die Chemie der Elastomere, ihre biokompatibel und biologisch abbaubar Natur zu bewahren. Wir zeigen, dass diese smektische LCEs, wenn sie für ausgedehnte Zeiträume gewachsen, die Untersuchung von klinisch relevanten und komplexen Gewebekonstrukte ermöglichen, während das Wachstum und die Vermehrung von Zellen zu fördern.
Introduction
Es gibt mehrere Beispiele von biologischen und biologisch verträglichen synthetischen Materialien zur Anwendung , in Zellstudien und für die Geweberegeneration darauf abzielen, die Zellanheftung und Proliferation 1, 2, 3, 4, 5. Es gibt einige Beispiele von biokompatiblen Materialien gewesen, bekannt als Flüssigkristall Elastomere (LCEs), die Molekular auf äußere Reize mit anisotropen reagieren könnten Bestellung 6, 7. LCEs sind Stimuli reagierende Materialien , die die mechanischen und elastischen Eigenschaften von Elastomeren , die mit den optischen Funktionen und molekularen Anordnung von Flüssigkristallen 8, 9 verbinden. LCEs können Änderungen in der Form, mechanische Verformung, elastisches Verhalten auf, und die optischen Eigenschaften in Reaktion auf externe stimUli (dh., Wärme, Druck, Licht, etc.) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Frühere Studien haben gezeigt , dass Flüssigkristallen (LCs) 4 , das Wachstum und die Orientierung von Zellen abtasten kann, 17. Es ist möglich, dann davon ausgehen, dass LCEs für biologisch und medizinisch relevante Anwendungen geeignet sein kann, einschließlich Zellgerüsten und Ausrichtung. Wir haben bereits berichtet , die Herstellung von smektischen biokompatibles, biologisch abbaubarem, gussgeformt, und dünnen Filme von LCEs einen „Swiss-Käse - Typ“ poröse Morphologie 6, 18. Wir haben auch nematische biokompatiblen LCEs mit globuläre Morphologie als Gerüste für das Zellwachstum 19 hergestellt <sup> 20. Unsere Arbeit wurde bei Abstimmung der mechanischen Eigenschaften der Materialien richtet 21 diejenigen des Gewebes von Interesse zu entsprechen. Außerdem konzentrieren sich diese Studien auf Elastomer-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen, sowie zelluläre Reaktion, wenn die Elastomere auf äußere Reize unterliegen.
Die wichtigsten Herausforderungen waren teilweise die Porosität des LCEs maßzuschneidern für die Zellanheftung und Permeation durch die Elastomermatrix und zum besseren Massentransport zu ermöglichen. Die Porosität dieser Dünnschichten 6 für Zellpermeation durch die Masse der Matrix erlaubt, aber nicht alle Poren vollständig miteinander verbunden waren oder hatten ein regelmäßigeres (homogen) Größe Pore. Wir berichten dann auf biokompatiblen nematischen LCE Elastomere mit globulären Morphologien. Diese nematische Elastomere für die Anheftung und Proliferation von Zellen erlaubt, aber die Porengröße lag im Bereich von 10 bis 30 nur um, was verhindert, oder die Verwendung von dieser beschränktElastomere mit einer größeren Vielfalt von Zelllinien 19, 20.
Frühere Arbeiten von Kung et al. im Zusammenhang mit der Bildung von Graphen Schäumen einer „Opfer“ Metallschablone zeigte , dass der erhaltene Graphitschaum eine sehr regelmäßige poröse Morphologie durch die gewählte Metallschablone 22 diktiert hatte. Diese Methode bietet die volle Kontrolle über die Porosität und Porengröße. Zur gleichen Zeit, die Geschmeidigkeit und Flexibilität der Metallschablone ermöglichen die Bildung von verschiedener Vorlage Schaumherstellung vor prägt. Andere Techniken, wie beispielsweise Material Auslaugung 23, Gas Templat 24 oder elektrogesponnenen Fasern 25, 26 bieten auch das Potential für die Herstellung von porösen Materialien, aber sie sind zeitaufwendig , und in einigen Fällen wird die Porengröße begrenzt auf nur wenige Mikrometer. Schaum-ähnlichen 3D LCEs vorbereitet Metallschablonen für eine höhere Zellenlast erlauben verwendet; eine verbesserte Proliferationsrate; Cokultivieren; und last but not least, eine bessere Massentransportmanagement (dh Nährstoffe, Gase und Abfall) , um sicherzustellen , vollständige Gewebeentwicklung 27. Schaumartige 3D LCEs scheint auch Zellausrichtung zu verbessern; Dies ist wahrscheinlich in Bezug auf die LC-Anhänger Abfühlen Zellwachstum und die Zellorientierung. Die Anwesenheit von LC-Einheiten innerhalb des LCE erscheint Zellenausrichtung mit Bezug auf Zellenposition innerhalb des LCE Gerüstes zu verbessern. Zellen auszurichten innerhalb der Streben des LCE, während keine klare Orientierung beobachtet wird , wo die Verstrebungen miteinander verbinden (junctions) 27.
Insgesamt ist unsere LCE Zellgerüstplattform als Zellträgermedium bietet die Möglichkeit zur Abstimmung der Elastomer Morphologie und elastische Eigenschaften und insbesondere die Ausrichtung der (individuellen) Zelltypen zu lenken, eine geordnete, räumlichen Anordnungen o zu schaffenf Zellen ähnlich wie lebende Systeme. Abgesehen von einem Gerüst der Lage erhalt Bereitstellung und langfristiges Zellwachstum und -proliferation zu leiten, LCEs erlaubt auch für dynamische Experimente, in denen Zellorientierung und Wechselwirkungen können im laufenden Betrieb geändert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Die folgenden Schritte für die 3D LCE schaumartige Zubereitung des 3-armige Sternblockcopolymer verwendet , ist in Abbildung 1 dargestellt. Für Kernspinresonanz (NMR) Charakterisierung, die Spektren in deuteriertem Chloroform (CDCl 3) bei Raumtemperatur auf einem Bruker DMX - 400-MHz - Instrumente und intern referenzierten Restpeaks bei 7,26 aufgezeichnet. Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) Spektren aufgenommen werden, einen Bruker Vector 33 FT-IR-Spektrometer unter Verwendung unter Verwendung von abgeschwächter Totalreflexionsmodus. Für jeden Schritt des folgenden Protokolls ist es wichtig, geeignete persönliche Schutzkleidung (PSA) zu tragen.
1. Synthese von α-Chlor-ε-caprolacton (Monomer) (nach dem Verfahren in Jérôme et al. 28)
- Vor der Synthese beginnt, reinigen 27 g 3-Chlorperbenzoesäure wie folgt:
- In 800 ml destilliertem Wasser, fügen 1,28 g NatriumPhosphat monobasisches Monohydrat und 8,24 g dibasisches Natriumphosphat-Heptahydrat. Den pH-Wert auf 7,4 (mit Natriumhydroxid oder Chlorwasserstoffsäure) und Reserve 30 ml dieser Lösung; dies ist die Pufferlösung.
- Unter Verwendung eines Scheidetrichter, lösen sich 3-Chlorperbenzoesäure in 35 ml Diethylether. Wasche die organische Lösung mit 10 ml Pufferlösung (hergestellt in Schritt 1.1.1.). Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
- Fügen 3 g Natriumsulfat direkt in die organische Lösung; Das Trocknungsmittel absorbiert Wasser aus der organischen Lösung.
- Die Lösung wird filtriert das Trocknungsmittel zu entfernen. Man engt das Filtrat unter vermindertem Druck mittels eines Rotationsverdampfer bei 850 mbar und 40 ° C verwendet wird.
- Solubilisieren 18,5 g gereinigtem 3-Chlorperbenzoesäure in 150 ml trockenem Dichlormethan, indem in einem Ultraschallbad gerührt werden; Dieser Vorgang dauert typischerweise 20 min. Legen Sie die Lösung in einem Trenntrichter.
- Innerhalb eines Zweihalsrundkolben,lösen sich 13,1 g 2-Chlorcyclohexanon in 15 ml trockenem Dichlormethan eines Magnetrührers unter einer Stickstoffgas. Halten gerührt wurde.
- Den Scheidetrichter, enthaltend 3-Chlorbenzoesäure-Lösung (aus Stufe 1.2) zu dem Zweihalskolben in Schritt 1.3. Spülen Sie das System mit Stickstoffgas. Justieren der Öffnung des Trenntrichter, so daß die Chlorperbenzoesäure Lösung tropfenweise in den 2-Chlorcyclohexanon Lösung fällt (1 Tropfen alle zwei Sekunden) und weiter für 96 h das Gemisch unter Stickstoffgas gerührt wurde.
- Man kühlt das Reaktionsgemisch auf -20 ° C für 1 h , um die m - Chlorbenzoesäure (m -CBA) Nebenprodukt auszufällen.
- Filtern Sie die m - Chlorbenzoesäure (m -CBA) und wäscht die verbleibende Lösung mit einer gesättigten Lösung von Natriumthiosulfat, Natriumhydrogencarbonat, und Natriumchlorid.
- Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 850 mbar und 40 ° C verwendet wird. Reinige den hellgelben, viskosen Liquid durch Destillation unter vermindertem Druck bei 2,3 Torr und 96 ° C.
- Überwacht den Erfolg der Synthese der folgenden 1 H - NMR - Peaks unter Verwendung. 1 H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, C H ClCO), 4,37-4,26 (m, 1H, C H 2 O), 4,18 bis 4,05 (m, 1 H , C H 2 O) und 2,06 bis 1,58 (m, 6H, -C H 2 -) 6, 27.
2. Synthese von α-dreiarmigen Stern Blockcopolymer (SBC-αCl) durch Ringöffnungscopolymerisation (Sharma et al. 6 und Amsden et al. 29)
- Vor der Synthese, silanisieren eine 20 ml-Ampulle, indem er mit einer 2% (v / v) Lösung von 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyltriethoxysilan in Toluol und Rühren für etwa 24 h zu füllen. Spülen mit Isopropylalkohol und trocknen Sie ihn, indem sie in einem Ofen bei 140 ° C für 30 Minuten platziert.
- In 3.64 g destilliertes ε-Caprolacton, 0,5 g α-Chlor-ε-Caprolacton und 0,25 ml Glycerin in die Ampulle. Mischen unter Verwendung eines Vortex für 1 min.
- In 4,90 g D, L - Lactid in die Ampulle und mit Stickstoff spülen. Platzieren Sie die Ampulle in einem Ofen bei 120 ° C , um das D, L - Lactid zu schmelzen; Dieser Prozess dauert in der Regel ca. 2 h. Mischen Sie wieder einen Wirbel mit , um sicherzustellen , dass alle Inhalte gut gemischt sind und fügen Sie 66 ul Zinn (II) -2-ethylhexanoat (Sn (Oct) 2) in die Ampulle.
HINWEIS: D, L - Lactid wird während dieses Prozesses abkühlen und müssen in den Ofen wieder erwärmt werden , zu schmelzen. - Energisch ein letztes Mal mit dem Vortex mischen und mit Stickstoff spülen.
- Schließen Sie die Ampulle mit einem Gummistopfen. Platzieren eine Nadel mit einem Vakuumschlauch verbunden (das Haus Vakuum ist in der Regel ausreichend) durch das Gummistopfen. Schalten Sie das Vakuum und eine Flamme, in der Schmelze die langen Hals des Glases, Zwirnen langsam, bis die glass kollabiert auf sich. Achten Sie darauf, nicht das Gummistopfen zu schmelzen. Nachdem die Ampulle schmolzenen ist, legen sie in einem Sandbad, ein Ofen oder entsprechenden Heizelement bei 140 ° C für 48 h.
- Nehmen Sie die Ampulle aus und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Brechen der Ampulle an der versiegelten Markierung und lösen sich die hochviskose Flüssigkeit durch Zugabe von 10 ml Dichlormethan gegeben. Die Lösung wird in einen Trenntrichter.
- Bereiten Sie einen Kolben mit 100 ml kaltem Methanol (gekühlt mit Hilfe eines Trockeneis / Aceton-Bad bei einer Temperatur um -78 ° C). Fixiert die Scheidetrichter (Schritt 2.7) auf der Oberseite des Kolbens. Justieren der Öffnung des Trenntrichter, so daß etwa zwei Tropfen alle zwei Sekunden (tropfenweise) fallen.
- Sammelt den weißen Niederschlag durch Filtration (unter Verwendung eines Papierfilter) und trocknet im Vakuumofen zwischen 50 und 60 ° C.
- Überwacht den Erfolg der Synthese unter Verwendung der folgenden 1 H - NMR und FT-IR - Peaks. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COC H C H 3), 4,43-4,25 (m, C H Cl), 4,24 bis 4,12 (m, C H 2 O), 4,11 bis 4,03 (t, J = 4,6 Hz, C H 2 O), 3,80-3,68 (m, C H C H 2), 3,09-2,64 (breit, s, O H), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, α- H) und 1,77-1,25 (m, C H 2, C H 3); FT-IR (1 / λ [cm - 1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, und 735 (m) , 6, 27.
Hinweis: Um eine hydrophilere 3D LCE vorzubereiten, bereiten ein lineares Blockcopolymer (LBC) anstelle einer SBC, im Anschluss an die Ringöffnungscopolymerisation (ROP) oben beschriebenen Verfahrens.- Zugabe von 0,3 g Polyethylenglykol (PEG), 3,15 g ε-Caprolacton, 1,0 g α-Chlor-ε-Caprolacton und 5,0 g D, L-Lactid auf die silanisierte Fläschchen Mischung.
3. Synthetisches Modifizierung von α-Cl-dreiarmigen SBC zu & alpha; n 3 -Three Arm SBC (SBC-3 & alpha; N) (Nach Sharma et al. 6)
- In einem Rundkolben überführt und unter Stickstoff, lösen sie 5 g SBC-αCl in 30 ml trockenen N, N - Dimethylformamid.
- In 0,22 g Natriumazid und lassen über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen.
Vorsicht: Natriumazid ist giftig; Tragen Sie geeignete Schutzkleidung (PPE). - Entfernen Sie die N, N - Dimethylformamid unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 11 mbar und 40 ° C verwendet wird . Man löst die Mischung in 30 ml Toluol. Zentrifugierte die Lösung dreimal bei 2.800 xg für 15 min zur Entfernung des gebildeten Salzes. Man dampft das Toluol unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 77 mbar und 40 ° C verwendet wird.
- Überwachen Sie den Erfolg der Azid - Substitution unter Verwendung von 1 H - NMR und FT-IR - Peaks.
HINWEIS:
4. Synthese von Cholesteryl 5-hexinoat (LC Rest) (Nach Sharma et al. 6 und Donaldson et al. 30)
- In einem Rundkolben wird die Mischung 3 g 5-hexinsäure und 130 ml Dichlormethan gegeben. Man kühlt auf 0 ° C mit einem Eisbad.
- In einem anderen Rundkolben, Mischung 8,28 g N, N' - Dicyclohexylcarbodiimid, 10,3 g Cholesterol und 0,2 g 4-Dimethylaminopyridin.
- Übertragen der 5-hexinsäure Lösung tropfenweise zu dem Kolben, der die Cholesterol Mischung und Aufrechterhaltung der Endmischung bei 0 ° C für 1 h enthält.
- Lassen Sie die Mischung über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Entfernen Sie die resultierende Dicyclohexylharnstoff Niederschlag durch Filtration eine 415 Grad Papierfilter und entsorgen.
- Man engt das Filtrat unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 850 mbar und 40 ° C verwendet wird. Man löst den gesammelten Rückstand in 150 ml Hexan.
- Dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 335 mbar und 40 ° C verwendet wird. In 350 ml Ethanol zu dem öligen Rückstand des Endprodukt zu sammeln. Waschen Sie die weißlicher Feststoff mit Ethanol gebildet und Trocknen des festen Produktes unter Vakuum bei 50 ° C.
- Überwacht die Synthese der folgenden 1 H - NMR und FT-IR - Peaks verwenden. 1 H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, C H = C), 4,70 bis 4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, C H 2 CO), 2,34 (m, 2H, C H 2 -C H =), 2,31 (m, 2H, C H 2 CH 2 -COO), 2,28 (s, 1 H, HC≡C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H 2), 2,07 bis 1,06 (m, 2H, C H 2, C H), 0,94 (s, 3H, C H 3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H 3 C H) und 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, CH 3 -C H), 0,67 (s, 3H, C H 3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2,830-2,990 (breit und starker Peak), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s) und 667 (s).
5. Synthetische Modifizierung von α-N 3 -Three Arm SBC a-Cholesteryl-dreiarmige SBC (SBC-αCLC) über eine Azid-Alkin Huisgen Cycloadditionsreaktion ( "Klicken" Reaktion) zu erhalten SBC-Chol (Nach Sharma et al. 6)
- In einem Rundkolben, auflösen 1 Moläquivalent SBC-3 & alpha; N (1,5 g) in 100 ml frisch destilliertem Tetrahydrofuran (THF). In 1,2 Mol equivalent von Cholesteryl-5-hexinoat (1,94 g), 0,1 molares Äquivalent Kupfer (I) iodid (0,06 g) und 0,1 Moläquivalent Triethylamin (0,03 g). Man rührt die Mischung über Nacht bei 35 ° C unter Stickstoff zugegeben.
- Dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 357 mbar und 40 ° C verwendet wird.
- Man löst das verbleibende Gemisch in 80 ml Dichlormethan und Zentrifuge für 5 min bei 2800 xg bei Raumtemperatur nicht umgesetzte Materialien und Nebenprodukte zu entfernen.
- Überwacht die Synthese der folgenden 1 H - NMR und FT-IR - Peaks verwenden. 1 H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-Triazol), 5,43 bis 5,34 (m, C = CH - Cholesterin), 5,10-5,06 (m, COCHCH 3), 4,68 -4.55 (m, O-CH - Cholesterin), 4,24-4,19 (m, CH 2 O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, CH 2 O), 4,11 bis 4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH 2 O), 2,47 bis 2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH 2), 2,31-2,25 (m, COCH 2), 2,07-1,02 (m, CH 2 3), 1,05-1,03 (s, CH 2, CH 3), 0,96 bis 0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH 2, CH 3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH 3), 0,71-0,68 (s, CH 3). FT-IR (1 / λ [cm - 1]): 3260 (s), 2,920 (s), 1,710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1,240 (m), 1,190 (s), 733 (s) und 668 (s).
6. Synthese von 2,2-Bis (1-Caprolacton-4-yl) propan (Vernetzerklasse, BCP) (Nach Gao et al. 27 und Albertsson et al. 31)
- In einem Rundkolben, wird eine Lösung von 10,8 g 2-Bis (4-hydroxycyclohexyl) -propan und 52 ml Essigsäure enthält.
- Es wird eine Lösung von 11 g Chromtrioxid in 50 ml Essigsäure und 8 ml destilliertes Wasser enthält. Diese Lösung wird tropfenweise zu der Lösung , hergestellt in Schritt 6.1 , während die Mischungstemperatur zwischen 17 und 20 ° C gehalten wird (zB in einemWasserbad); Dieser Vorgang dauert tropfenweise 2 Stunden. Sobald der Prozess abgeschlossen ist, lassen Sie die Lösung für etwa 30 min rühren.
- In 50 ml 2-Propanol. Rühren Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur.
- Man engt die dunkelpurpurfarbene Lösung unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 137 mbar und 40 ° C verwendet wird. Hinzufügen von 300 ml destilliertem Wasser auszufällen; der Niederschlag sollte leicht lila sein.
- Filtrieren das Rohprodukt eine Klasse 415 Papierfilter. Waschen des festen Materials mit ~ 250 ml destilliertem Wasser, oder bis der Feststoff wird weiß.
- Man löst den Feststoff in 15 ml Benzol bei 40 ° C und läßt es bei 25 ° C rekristallisiert.
- Hinzufügen 8,34 g trockenen Diketon, gelöst in trockenem Dichlormethan gelöst und eine Lösung, die 6,0 g 3-Chlorperbenzoesäure in 75 ml Dichlormethan in den Kolben gegeben.
- Rückflußtemperatur der Lösung bei 40 ° C für 24 h.
- Man kühlt das Reaktionsgemisch auf -20 ° C für 10 min , um den m auszuzufällen
- Entfernen m - Chlorbenzoesäure durch Filtration (unter Verwendung eines Papierfilter) und konzentrieren die Lösung unter vermindertem Druck.
- Waschen Sie die Viskose Rohprodukt mit 200 ml 2-Heptanon und trocknet den Niederschlag unter Vakuum bei 50 ° C über Nacht.
- Überwacht die Synthese der folgenden 1 H - NMR und FT-IR - Peaks verwenden. 1 H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H 2 OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H 2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,04 bis 1,93 (m, 4H, -C H 2 CH 2 OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -C H 2 CH 2 COO), 1,48 bis 1,38 (m, 2H, - C H C (CH 3) 2), 0,84 (s, 6H, C H 3 C-). 7. Schaffung von Poröse 3D Scaffold Elastomer Verwendung entweder Hexamethylendiisocyanat (HDI) oder 2,2-Bis (1-Caprolacton-4-yl) propan (BCP) 27 als Vernetzer (Nach Gao et al. 27)
- Bereiten dreiarmige Elastomermischung unter Verwendung von 0,75 g der SBC-αCLC durch Zugabe von 0,25 ml HDI (oder 0,45 ml BCP) und 0,24 ml destilliertes ε-Caprolacton Monomer. In 60 & mgr; l Sn (Oct) 2. Bei Verwendung von BCP anstelle von HDI, mischen SBC-αCLC und BCP einen Wirbel unter Verwendung und sie in einem Ofen bei 140 ° C, bis die BCP vollständig schmilzt und löst sich (dieser Schritt bis 2 h in Anspruch nehmen kann). Sobald der BCP aufgelöst wurde, nehmen Sie es aus dem Ofen und die Sn (Oct) 2 und Wirbel.
- Vorbereiten einer „Opfer“ Nickelschaum Vorlage durch ein 1 x 4 cm Metallstück zu schneiden. Rollen sie von einem der kurzen Enden , so daß die Endrolle ist etwa 1 x 1 cm Metallstück (siehe Abbildung 4). <li> Setzen Sie den Nickelschaum in einer Glasfläschchen oder Aluminiumfolienpackung und gießt das Gemisch in Schritt hergestellten 7,1 bis vollständig den Schaum für 2 min abdecken. Entfernen Sie die überschüssige Mischung mit einer Pasteur-Pipette. Lassen Sie es in einem Ofen über Nacht bei 80 ° C.
- Abziehen der Aluminiumfolie oder brechen das Glas ab. Mit einer Rasierklinge rasiert das Elastomer um den Metallschaum das Nickelmetall zu belichten.
- Herstellung von 1 M Eisen (III) -chlorid (FeCl 3) Lösung in 100 ml Wasser. Setzen Sie den Schaum in einem Kolben und fügen Sie 70 ml FeCl 3 -Lösung. Rühren Sie drei Tage bei Raumtemperatur und die jeden Tag FeCl3 Lösung ändern. Vor jeder Änderung, rühren Sie den Schaum mit ionisiertem Wasser für 0,5 Stunden.
HINWEIS: Der Ätzprozess typischerweise nach drei Tagen abgeschlossen ist. Um sicherzustellen, dass der Ätzprozess abgeschlossen ist, führen taktile Druckversuche, bis die Schäume weich anfühlen. Schaumbeständigkeit taktile Kompressionstests zeigt das Vorhandensein einer Restmetallschablone. - Spülen Sie die elastGomer Schaum mit Ethanol und in einem Vakuumofen über Nacht bei 40 ° C.
- Charakterisieren der Materialien unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM), Differential - Scanning - Kalorimetrie (DSC), mechanische Kompressionstests und thermische gravimetrische Analyse (TGA) 27.
HINWEIS: Für ein hydrophilere 3D LCE Vorbereitung, ersetzt den SBC mit LBC (um sicherzustellen, dass das LBC auch eine LC-Einheit enthält) im Anschluss an den in Schritt 7.5 beschriebenen Schritte.
8. Seeding von Elastomer Scaffold mit SH-SY5Y Neuroblastomzellen und Kultur Sterile Techniken
- Sterilisiert das Elastomer durch sie zweimal mit 1 ml 70% igem Ethanol gewaschen wird. Führen der UV-Bestrahlung für 10 min und Waschen mit 1 ml 70% Ethanol. Spülen Sie sie zweimal mit 1 ml sterilem Wasser und 1 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). Legen Sie die Elastomere in 24-Well-Kulturplatten.
- Bereiten Zellwachstumsmedium für SH-SY5Y, enthaltend 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) NachtrENTED mit 10% fötalen Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep).
- Nachdem die Zellen Zählen einer Zählkammer unter Verwendung bereiten in 100 & mgr; l Wachstumsmedium suspendiert 1,5 x 10 5 SH-SY5Y - Zellen (Keimlösung). Fügen Sie die Lösung auf der Elastomere, um sicherzustellen, einen Tropfen zu bilden.
- Inkubiere die gesäten Elastomeren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 h Zelladhäsion zu fördern. In 0,5 ml Wachstumsmedium. Inkubieren wieder bei 37 ° C mit 5% CO 2.
- Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag, nachdem sie mit 1 ml PBS gewaschen.
9. Die mikroskopische Bildgebung von Elastomer Baukonstruktion
- Fix die auf Elastomeren mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min gezüchteten Zellen. Spülen mit 3 ml PBS dreimal für jeweils 5 Minuten und legen das Elastomer mit den fixierten Zellen in einer Kulturschale mit einem daran befestigten Deckglas.
Achtung: PFA ist giftig. Tragen Sie geeignete Schutzkleidung (PPE). - Stain den festen Proben mit 0,1% 4' , 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 500 ul PBS für 10 min und spült zweimal mit 1 ml PBS für 5 min.
- Unmittelbar Bild der Elastomere Konfokalmikroskopie mit DAPI-Fluoreszenz unter Verwendung Bildstapel Erwerb, der die Probe überspannen.
HINWEIS: Hier Bildstapeln wurden unter Verwendung eines 20X Ziel erworben und ein 60X Ziel. - Analysieren der optischen konfokalen Bildstapel mit ImageJ 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieser Bericht zeigt die Herstellungsverfahren eines porösen 3D LCE als Gerüst für die Zellkultur einer Nickel-Metall-Vorlage. Der erhaltene 3D LCE zeigt ein Komplex miteinander verbundenes Kanalnetzwerk , das ebenso wie weitere geeigneten Massentransport 27 für eine einfache Zellinfiltration ermöglicht. Es wurde festgestellt, dass die Zellen der Lage sind, in vollem Umfang das miteinander verbundene Kanalnetzwerk eindringen und ebenfalls innerhalb des LCE ausrichten kann. Hierbei wird ein Metallschaum Nickel (99% Ni, eine Dichte von 860 g / cm 2) wurde nach einem ähnlichen Ansatz für die Graphenschaumherstellung ausgewählt zuvor von Kung et al. 22. Der Metallschaum wurde Polymer gegossen, mit allen Metallstreben vollständig abgedeckt. Die Auswahl der Metallschaum Größe und Dichte ist wichtig, da es die endgültige Morphologie des LCE verleiht und in Nachahmung die Gewebeumgebung von Interesse helfen kann.
D, L- Lactid (Abbildung 2). Das Endprodukt ist ein hydrophober 3-armige SBC. SBCs mit 4 und 6 Armen, die von den Knoten mit Glycerin Pentaerythrit und Dipentaerythrit ersetzt bzw. zuvor 18 berichtet. Für eine hydrophilere SBC wurde der Zentralknoten mit Oligoethylenoxid ersetzt (die Protokollnoten sehen). Jedoch ersetzen Glycerin mit Oligoethylenoxid resultiert in einem linearen Block - Copolymer 27. Wir verwenden eine modifizierte Synthese von Younes et al. 29. Die modifizierte Version ermöglicht die Verwendung eines modifizierten ε-caprolactone mit einer Halogengruppe in zwei unterschiedlichen Positionen, alpha und gamma zur Carbonylgruppe 6. Sobald die SBC gebildet wird, leidet der modifizierten ε-Caprolacton Block eine Verschiebung des Halogenatoms mit einer Azid-Gruppe. 1 - Band verwendet abgeschwächte Totalreflexion (ATR) FT-IR (Figur 3) - die Verschiebung der Halogengruppe durch die Azidgruppe wird durch das Auftreten des 2,100-cm bestätigt. Die Azidgruppe wird später verwendet, um kovalent die LC-Einheit (Cholesteryl hexinoat) zum Sternblockcopolymer befestigen unter Verwendung von Alkin-Azid Huisgen der Cycloadditionsreaktion (auch als „Klick-Reaktion“ bezeichnet), Erhalt des endgültige Sternblockcopolymer mit einer Seite -Kette Cholesterin Anhänger Einheit (SBC-Chol). Die Bildung des Triazolrings durch das Verschwinden des 2,100-cm bestätigt wird - 1 - Band und das Auftreten eines Singuletts bei 7,30 ppm im 1 H - NMR - Spektren beobachtet (siehe Abb3). Wir haben uns auf die Wirkung der Platzierung einer Halogengruppe entweder alpha (α -Br) oder gamma (γ-Cl) zur Carbonylgruppe auf der funktionalisierten ε -CL 6 kürzlich berichtet. Es soll beachtet werden , dass in den SBC Co-Polymere mit 4-Arm - und 6-Arm zentralen Kernen den zentralen Knoten ersetzt auf den mechanischen Eigenschaften der erhaltenen LCEs eine Wirkung hat , weil die zentralen Knoten sowohl als Initiatoren und intrinsische Vernetzern dienen 18 .
Sobald die SBC-Chol hergestellt wurde, und vollständig charakterisiert, ist das Vernetzungsverfahren unter Verwendung einer Metallschablone der letzte Schritt zur Schaumherstellung. Der SBC-Chol mit Hexamethylendiisocyanat (HDI, Vernetzer), ε-Caprolacton, und Sn (Okt) 2 vermischt wurde (ROP - Katalysator, siehe Schritt 7.1). Das Bis-Caprolacton (BCP) Vernetzer wurde mit HDI ersetzt, wie zuvor berichtet. Der Metallschaum wird geschnitten und geformt, um die gewünschten fORM (Abbildung 4). Zwei Wege zur Schaumherstellung, nämlich die primäre Porosität (LCEF PP) und primäre / sekundäre Porosität (LCEF P + SP), wurden bereits berichtet. Hier wird die P + LCEF SP oder „Eintauchen“ Methode wird vorgestellt, in dem die Nickelschablone schnell in der Polymermischung eingetaucht wird. Der Metallschaum befindet sich in einem Behälter aus Aluminiumfolie oder ein Szintillationsfläschchen, enthaltend die Polymermischung, wobei alle Metallstreben vollständig eingetaucht in der Polymermischung gegeben. Die überschüssige Polymermischung wird sorgfältig entfernt. Dieses Polymer bedeckten Nickel Vorlage wird bei 80 ° C über Nacht, noch im Inneren des Behälters, in einem Ofen angeordnet. Crosslinking wird für etwa 2 h in der Gegenwart des Katalysators durchgeführt. Nach dem Vernetzungsprozess wird die Polymer bedeckte Nickelschablone aus seinem Behälter die Aluminiumfolie durch Abziehen entfernt oder die Glasbehälter zu brechen. Das überschüssige Polymer wird aus dem Polymer bedeckt Nickel templ sorgfältig rasiertaß die Ränder der Nickelschablone zu belichten und in einem Behälter mit einer gesättigten Lösung von FeCl 3 (Figur 5) angeordnet. Nach einigen Stunden ist die Nickel fast vollständig entfernt, und nur der LCE - Schaum wird mit entsalztem Wasser (DI) gespült , um die Nickel / FeCl 3 -Lösung zu beseitigen. Der LCE - Schaum wird wieder in einem Behälter mit einer FeCl 3 -Lösung gegeben und mit gesättigter DI Wasser zweimal gespült. Nachdem die Ätzprozess abgeschlossen ist und die gesamte Nickelschablone vollständig eliminiert wird, zeigt der LCE Schaum ein miteinander verbundenes Kanalnetzwerk mit ausgehöhlten Streben (Abbildung 6). Abbildung 6 zeigt die interne LCE Schaum Morphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie beobachtet (SEM). Die LCE Schaumstreben sind hohl, und die gesamte reguläre Morphologie ist abhängig von der Nickelschaum-Vorlage.
Bisher erforderte die Verwendung von BCP mehrere Schritte, die sie in solu zu haltention (dh geschmolzen), weil BCP beginnt sofort rekristallisieren als die Lösung um ein paar Grade abkühlt (von 140 ° C auf Raumtemperatur die Sn (Oct) 2 hinzuzufügen, siehe Schritt 7.1). Dies macht die Handhabung des Metallschaum und Polymermischung herausfordernd vor der Vernetzung. Die Verwendung von HDI als Vernetzer für eine schnellere Vernetzungszeit erlaubt, als wenn BCP verwenden. BCP ist ein Feststoff bei Raumtemperatur mit einem Schmelzpunkt von 140 ° C, während HDI eine Flüssigkeit bei Raumtemperatur ist. Die Wahl der Vernetzer wirkt sich direkt auf die Vorbereitungszeit und, wie in unserem Fall, die Vernetzungstemperatur 140 bis 80 ° C reduziert wird, auch Elastomerenherstellung verringert wird.
Die LCE - Schaumstoffe wurden durch Kompressionsverformung (Film 1) getestet. Eine 70% ige Reduktion der LCE Größe beobachtet wird, ohne Auswirkung auf die Gesamtabmessungen. Nach der Veröffentlichung von Kompression von der LCE, erholt sie vollständig ihre ursprünglichen shape und Größe. Es wird angenommen , dass die Anwesenheit der Flüssigkristalleinheiten in dem LCE Material kritisch ist, wie Elastomere , die unter den gleichen Bedingungen ohne die cholesterin ε -Caprolacton Block vorbereitet nicht ihre ursprüngliche Form wiederherzustellen und kollabiert in sich.
Sobald LCE Schäume erhalten wurden, waren sie bereit, mit Neuroblastome werden ausgesät (SH-SY5Y) unter Verwendung von Standardzellkulturtechniken. LCE Schäume wurden zweimal in 70% Ethanol gewaschen und dreimal mit PBS vor der Zellaussaat gespült. Innerhalb von 2-3 Tagen nach der Zellaussaat wurden die Zellen beobachtet an den Wänden des 3D LCE-Netzwerk zu verbinden. Um vollständig die Zellanheftung und Expansion innerhalb des LCE Netzwerk zu untersuchen, wurden die Zellen nach 30 Tagen fixiert (Figur 7). Die Zellen wurden fixiert, mit DAPI gefärbt und bebildert konfokalen Mikroskopie. Die Zellen wurden haben stark vermehrt, angebracht gefunden, und erweitert, um ausgiebig das 3D LCE Gerüstnetz. Des Weiterenmehr detaillierte Analyse ergab, Zellkerne Dehnung, die in den meisten Fällen nicht durch die gekrümmten Abschnitte des 3D LCE Gerüstnetzes betroffen war. Zellverlängerung kann auch zur Zellenausrichtung und ist höchstwahrscheinlich das Ergebnis der smektischen A-Phase-Charakteristik der präsentierten LCE korreliert werden. Dies wurde zuvor in C2C12 - Zellen nach 14 Tagen 27 gewachsen beobachtet. In dieser Studie zeigen wir, dass die Zellen für mehr als 14 Tage zu vermehren fortzusetzen; dies ist nicht allein auf C2C12 Zellen beschränkt. Die Verwendung der LCE Schäume können auf fast jede Zelllinie erweitert werden. Die Zellen wachsen auf 3D LCE schaumartige Gerüste profitieren von höherer Effizienz Massentransport im Vergleich zu 2D-Gerüste. Im 2D-Gerüsten, wachsen Zellen in der Regel in Schichten übereinander. Zellen, die auf den oberen Schichten wachsen, sind die einzigen, die vollen Zugriff auf alle Nährstoffe, Gas und Abfallbeseitigung (Massentransport) haben. Die Zellen in den unteren Schichten sind nicht in der Lage Nährstoffe zugreifen zu können, und es gibt einen höheren Grad der Zelle death in diesem Fall. Innerhalb 3D-Gerüste, haben Zellen eine effizientere (im Vergleich zu 2D-Gerüsten) Zugang zu Nährstoffen, Wachstumsfaktoren und Gasen, ermöglichen langfristige Zell- und Geweberegeneration Studien. Zellabfallwirtschaft (Beseitigung von Abfällen), um die 3D-LCE schaumartige Gerüste verwendet, ist auch effektiver als in den 2D-Gerüsten. Die Porosität (und / oder andere Struktureigenschaften) der LCEs ermöglichen einen schnellen Massentransport und erhöhte Zellenbelastung im Vergleich zu weniger porös (oder andere) Matrizen, so dass Medien und Zell Zugang zur zentralen Region der Matrix. Diese LCE Plattform abstimmbar ist das Wachstum vielen Arten von primären und immortalisierten Zelllinien, einschließlich Muskeln, Nerven und Haut, unter anderem, sowie mehrzellige Kultursysteme zu unterstützen. Im Wesentlichen ist dies einer der Vorteile der Plattform, da sie verwendet werden, können viele verschiedene Zelltypen und Systemen für längere Zeit zu wachsen. Darüber hinaus, um die Fähigkeit, mehr mehr Schichten von Zellen in dem Konstrukt wächst eng emulAtes natürliche Umgebungen.
Abbildung 1: Allgemeines Verfahren die Schritt- für -Schritt - Herstellung und Charakterisierung der LCE Schaumstoffen beschreibt. Siehe das Protokoll Abschnitt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Vernetzende Schema von 3-Arm SBC. Das Vernetzungsschema des 3-armige SBC biscaprolactone oder HDI als Vernetzer in Gegenwart einer Nickel-Metallhydrid-Vorlage für die Herstellung von schaumartigen LCEs Verwendung gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses figu anzuzeigenRe.
Abbildung 3: Schematische Darstellung 1,2,3-Triazol - Bildung (erfolgreiche "Klick" Reaktion) , gefolgt von 1 H NMR und FT-IR. 1 - Band verwendet abgeschwächte Totalreflexion (ATR) FT-IR - die Verschiebung der Halogengruppe durch die Azidgruppe wird durch das Auftreten des 2,100-cm bestätigt. 1 - Band und das Auftreten eines Singulett, beobachtete bei 7,30 ppm im 1 H - NMR - Spektren - Die Bildung des Triazolrings wird durch das Verschwinden des 2,100-cm bestätigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Optische Bilderaus verschiedenen Schaumformen vor der Vernetzung. Der Metallschaum wird geschnitten und geformt, um die gewünschte Form, wie dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Nickelschaum vor (A) und nach (B) Vernetzung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: LCE Schaummorphologie beobachtet Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Repräsentative REM - Aufnahmen von LCE Schaumstoffen auf SBC-Basis (a und b) und LBC-basierte (c d) Elastomere Ni-860 als Metallschablone verwenden dargestellt. Die Pfeile zeigen die ausgehöhlten Streben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Konfokale mikroskopische Aufnahmen Anzeige DAPI-gefärbte Zellkerne von SH-SY5Y - Zellen an den Elastomerschaum 30 Tage nach der Aussaat. 2D - Bilder wurden in der z - Richtung, und die Querschnittsbilder in der xz gestapelt - und yz -Ebenen wurden erstellt. Die Bilder zeigen, dass die SH-SY5Y-Zellen (helle Punkte) befestigt ist und innerhalb der Wände der Hohlkanäle in der Elastomerschaum expandiert. Die Zellen räumlich in mehreren Schichten aufgeweitet und über 100 & mgr; m durch das Konstrukt ausgefahren (wie in der xz gezeigt - und yz -Ebene Bildquer secgen). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1: Videobilder der Deformation und die Einziehung einer LCE Rolle. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flüssigkristalline Elastomere als biokompatible Zellgerüste untersucht aufgrund ihrer Reize Ansprechbarkeit kürzlich. Sie haben sich als ideale Plattformen als Zellgerüste sein. Jedoch ist ein wichtiger Faktor im Auge zu behalten bei der Vorbereitung und ein neues LCE Gerüstes Gestaltung ist Porosität. Die Einarbeitung von auslaugbaren Feststoffen oder Gas 23 führt nicht immer in homogener Porosität oder vollständig miteinander verbundene Poren. Die Verwendung einer Metallschablone, die nicht geätzt werden kann bietet nur die Möglichkeit, eine besser organisierte und regelmäßige interne Struktur haben, sondern ermöglicht auch die Auswahl der Porengröße und Dichte. Dies ist unmittelbar mit der Metallschablone zuvor für die Herstellung von Schaumstoffen verwendet Graphen 22. Metallschablonen bieten auch die Möglichkeit, Formen bilden vor der LCE Vernetzung ermöglichen eine breite Palette von Möglichkeiten, anspruchsvolle und komplexe Architekturen mit regelmäßiger Porosität de zu schaffenunterzeichnet in engen Zusammenhang mit endogenen Umgebungen ähneln. Foam LCEs hergestellt unter Verwendung dieser Methodik ermöglicht die verbesserte Untersuchung von Zellmaterial und, was noch wichtiger ist, räumliche Zell-Zell-Interaktionen, eine Leistung nicht möglich, innerhalb von zweidimensionalem (2D) Umgebungen. 2D-Zellgerüste nicht erlauben, die Zellen mit benachbarten Zellen frei zu interagieren. Darüber hinaus wachsen die Zellen typischerweise in Monolayern (oder direkt auf aufeinander), ohne vollen Zugang zum Raum für Wachstum und, was noch wichtiger ist, für die Interaktion. Spezifische räumlich zusammenwirkenden Zelltypen, wie Neuronen und Gliazellen, sind von größter Bedeutung, wenn Konstrukte als potentielle Implantate oder langfristigen Versuchsplattformen entwickelt, um widerzuspiegeln lebende Systeme zu entwerfen.
Unsere modularen, lösemittelfreie Synthese LCE einer Metallschablone verwendet wird , hier dargestellt, hilft durch Abstimmen des hydrophoben / hydrophilen Balance Zelladhäsion einzustellen , indem die richtigen zentralen Knoten und das Verhältnis der Monomere der Wahl 7
Die Grenzen dieses Protokolls sind: (1) die begrenzte Auswahl an handelsüblichen Metall (Nickel) Schaumstoffen und ihren begrenzten Bereich in Strebenabmessungen, (2) dieAnforderung , dass das LCE oder jedes andere Polymer / Elastomer - Material chemisch die Bedingungen des Metall Ätzresist muss (hier eine FeCl 3 Etch) und (3) die Tatsache , dass Zellausrichtung an die Flüssigkristall modifizierten Elastomere hier berichtet werden begrenzt erscheint (die Mutter nicht-LCE Elastomere zeigten keine nennenswerte Ausrichtung Zelle).
Abschließend wurde zuvor gezeigt, dass SmA LCEs modulare Syntheseverfahren unter Verwendung hergestellt werden kann. Weitere biokompatible LC-Teile können eingearbeitet werden, ihre mechanischen Eigenschaften und neue flüssigkristalline Wirkungen auf die Zellproliferation zu untersuchen, und insbesondere Zellausrichtung. Es ist bekannt, dass mechanische Eigenschaften, insbesondere Elastizitätsmoduli Werte, entscheidend sind für die Zelladhäsion, Proliferation und Zellausrichtung. Die Ergebnisse zeigen hier, dass die Porosität von SmA LCEs kann durch die Verwendung einer Metallschablone abgestimmt werden, um eine effektive Art und Weise, um die Porengröße zu steuern und die LCE zuzuschneidenForm (dh Gesamt Morphologie). Eintauchen der Ni-Vorlage in die SCB Polymermischung, gefolgt von Ätzen der Ni-Vorlage bietet einen einfachen Ansatz für neue LCE Morphologien. Die schaumartige LCEs hier beschriebenen Zellen liefern (hier, SH-SY5Y, ein Standard-Zellmodell neuronale Funktion zu studieren) mit einer realistischeren, 3D-Umgebung für Wachstum und Interaktion. Damit können mehrere Zelltypen in mehreren Schichten verteilt wachsen überall in der Elastomer neuronalen Umgebungen ahmt endogene und bietet die faszinierende Möglichkeit, anspruchsvollere Experimente Kultur 3D-Gewebe. Die Verwendung von abstimmbaren und dynamischer LCEs nativen Architekturen zu imitieren ebnet den Weg für die nächste Generation Zellmodelle für Längs- und klinisch relevante Zellstudien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Kent State University (kollaborativen Forschungsförderung und Unterstützung für die Regenerative Medizin Initiative an der Kent State - ReMedIKS) danken für die finanzielle Unterstützung dieses Projekts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane | Alfa Aesar | L16606 | Silanizing agent |
| 2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane | TCI | B0928 | Reagent |
| 2-chlorohexanone | Alfa Aesar | A18613 | Reagent |
| 2-heptanone | Sigma Aldrich | W254401 | Solvent |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | 278475 | Solvent |
| 3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA | Sigma Aldrich | 273031 | Reagent |
| 4-dimethylaminopyridine | Alfa Aesar | A13016 | Reagent |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI | Invitrogen | D1306 | Nuclear Stain |
| 5-hexynoic acid | Alfa Aesar | B25132-06 | Reagent |
| Acetic acid | VWR | 36289 | Solvent |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850 | Solvent |
| Alcohol 200 proof ACS Grade | VWR | 71001-866 | Reagent |
| Benzene | Alfa Aesar | AA33290 | Solvent |
| ε-caprolactone | Alfa Aesar | A10299-0E | Reagent |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | Solvent |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8503 | Reagent |
| Chromium(VI) oxide | Sigma Aldrich | 232653 | Reagent |
| Copper(I) iodide | Strem Chemicals | 100211-060 | Reagent |
| D,L-Lactide | Alfa Aesar | L09026 | Reagent |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | Solvent |
| Diethyl ether | Emd Millipore | EX0190 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME | CORNING Cellgo | 10-013 | Cell Media |
| Ethanol | Alfa Aesar | 33361 | Solvent |
| Formaldehyde | SIGMA Life Science | F8775 | Fixative |
| Fetal bovine serum, FBS | HyClone | SH30071.01 | Media Component |
| Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe | VWR | 28320 | Filtration |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Central node (3-arm) |
| Hexamethylene diisocyanate, HDI | Sigma Aldrich | 52649 | Crosslinker |
| Iron(III) chloride | Alfa Aesar | 12357 | Etching agent |
| Isopropyl alcohol | VWR | BDH1133 | Solvent |
| Methanol | Alfa Aesar | L13255 | Solvent |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Aldrich | D80002 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Nickel metal template | American Elements | Ni-860 | Foam template |
| Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) | ATCC | CRL-2266 | Cell line |
| Penicillin streptomycin | Thermo SCIENTIFIC | 15140122 | Antibiotics |
| Polyethylene glycol 2000, PEG | Alfa Aesar | B22181 | Reagent |
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | Reagent |
| Sodium bicarbonate | AMRESCO | 865 | Drying salt |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | Drying salt |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S-374 | Drying salt |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma Aldrich | S9638 | Drying salt |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | Drying salt |
| Tetrahydrofuran | Alfa Aesar | 41819 | Solvent |
| Thiosulfate de sodium | AMRESCO | 393 | Drying salt |
| Tin(II) 2-ethylhexanoate | Aldrich | S3252 | Reagent |
| Toluene | Alfa Aesar | 22903 | Solvent |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 471283 | Reagent |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | Cell Detachment |
| Olympus FV1000 |
References
- Khor, E., Lim, L. Y.
- Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
- Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
- Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
- Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
- Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
- Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
- deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
- Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
- Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
- Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
- Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
- Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
- Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
- Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
- Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
- Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
- Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
- Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
- Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
- McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
- Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
- Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
- Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
- Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
- Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9 (2009).
- Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
- Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
- Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
- Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
- Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).
