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Bioengineering

3D空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成

doi: 10.3791/55452 Published: April 11, 2017

Summary

この研究は、3D、生体適合性の側鎖型液晶エラストマー(種の保存法)に基づいて、生分解性、泡様細胞の足場を調製するための方法論を提示します。共焦点顕微鏡実験は泡状種の保存法は、細胞の付着、増殖、およびC2C12s筋芽細胞の自発的なアライメントを可能にすることを示しています。

Abstract

ここでは、3D、生分解性、泡様細胞足場のステップバイステップの準備を提示します。これらの足場は、スメクチックA(SMA)、液晶エラストマー(種の保存法)で得られた、側鎖のペンダント基としてコレステロールユニットを搭載星型ブロックコポリマーを架橋することによって調製しました。泡のような足場は、3D細胞培養足場、それらに適したものに、金属テンプレートを用いて調製し、相互接続さマイクロチャネルを備えています。従来の多孔質テンプレートフィルムと比較するだけでなく、より高い細胞増殖を促進する三次元細胞骨格における金属発泡体の規則的な構造のエラストマー結果の組み合わせの特性だけでなく、大量輸送のより良い管理( すなわち、栄養物、ガス、廃棄物、 など )。金属テンプレートの性質は、泡の形状( すなわち、ロールまたはフィルム)の容易な操作を可能にし、異なる細胞研究のための異なる孔径の足場の調製のためのinterconnecを維持しながら、テンプレートのテッド多孔性の性質。エッチングプロセスは、その生体適合性および生分解性を維持したまま、エラストマーの化学的性質に影響を与えることはありません。私たちは、細胞の成長と増殖を促進しながら、これらのスメクティック種の保存法は、広範囲の期間のために増殖させた場合、臨床的に関連して、複雑な組織構築物の研究を可能にすることを示しています。

Introduction

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細胞研究において、細胞の付着および増殖を1、2、3、4、5を目指し組織再生のためのアプリケーションのために設計された生物学的および生体適合性合成材料のいくつかの例があります。 6、 図7を注文分子異方性の外部刺激に応答することができ、液晶エラストマー(種の保存法)として知られている生体適合性材料のいくつかの例、、がありました。種の保存法は、光学機能と液晶8,9の分子秩序を有するエラストマーの機械的および弾性特性を組み合わせた刺激応答性物質です。種の保存法外部STIMに応じて形状、機械的変形、弾性挙動、および光学的性質の変化を体験することができULI( すなわち 熱、応力、光、 )10、11、12、13、14、15、16。以前の研究では、液晶(LCS)がセル4、17の成長と配向を感知することができることを示しています。これは種の保存法が細胞の足場とアラインメントを含む、生物学的および医学的に関連する用途に好適であり得ると仮定することが可能です。我々は以前、「スイスチーズの種類」、多孔質の形態6、18搭載スメクティック生体適合性、生分解性、キャスト成形、および薄い種の保存法フィルムの作製を報告しています。我々はまた、細胞増殖19 <ための足場として球状形態を有するネマチック生体適合性種の保存法調製しますSUP>、20。私たちの仕事は、関心21の組織のものと一致する材料の機械的特性を調整することを目的としています。また、これらの研究は、エラストマー - 細胞相互作用、ならびにエラストマーは外部刺激の対象となる細胞応答を理解することに焦点を当てます。

主な課題は、エラストマーマトリックスを介してより良い大量輸送のための細胞の付着および浸透を可能にするために、種の保存法の気孔率を調整する部分でした。これらの薄膜6の気孔率は、マトリックスのバルクを通って細胞透過性のために許可され、すべてではない孔が完全に相互接続されたまたは孔(均質)よりレギュラーサイズを有していました。私たちは、その後、球状の形態を有する生体適合性ネマチックLCEエラストマーについて報告しました。これらネマチックエラストマーは、付着および細胞の増殖を許容するが、細孔サイズが防止10-30ミクロンからのみ範囲又はこれらの使用を制限し細胞株19,20の広い様々なエラストマー。

クンの前の仕事 「犠牲」金属テンプレートを使用してグラフェン発泡体の形成に関連して得られたグラフェンフォームが選択された金属テンプレート22によって決定非常に規則的な多孔性の形態を有することを示しました。この方法では、気孔率及び気孔サイズの完全な制御を提供しています。同時に、金属テンプレートの可鍛性と柔軟性は、前のフォームの準備に異なるテンプレート形状の形成を可能にします。いくつかのケースでは、細孔サイズは、限定され、そのような材料の浸出23、ガステンプレート24、または電気紡糸繊維25、26のような他の技術は、また、多孔性材料の調製のための可能性を提供するが、それらはより多くの時間がかかるとされていますわずか数メートル。フォーム3D種の保存法様金属テンプレートは、より高いセル負荷を可能に用いて調製。改善された増殖速度。共培養;そして、、少なくとも最後のではなく、より良い大量輸送管理( すなわち 、栄養素、ガス、及び廃棄物)の完全な組織開発27を確保します。泡状3D種の保存法は、細胞整列を改善するように見えます。これは、細胞増殖と細胞の向きを検知するLCのペンダントとの関係で最も可能性が高いです。 LCE内のLC部分の存在は、LCE足場内の細胞の位置に対する細胞配向性を高めるように見えます。支柱は、一緒に(接合部)27の参加ここでは明確な配向が観察されないながら細胞は、LCEの支柱内に整列させます。

全体として、細胞支持体としてのLCE細胞足場プラットフォームを調整するために、エラストマーの形態と弾性特性、特にO順序付けられた、空間的配置を作成する(個々の)細胞型の位置合わせを指示するの機会を提供します生体系に似てF細胞。別に維持および長期細胞成長および増殖を指示することができる足場を提供することから、種の保存法はまた、細胞の配向との相互作用をオンザフライで修正することができる動的な実験を可能にします。

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Protocol

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注記:3アームスターブロック共重合体を用いた3D LCE泡状調製のための以下のステップは、 図1に示されています。核磁気共鳴(NMR)特性決定のために、スペクトルは、Bruker DMX 400 MHz装置で室温で重水素化クロロホルム(CDCl 3中)に記録されており、内部7.26の残留ピークを参照します。フーリエ変換赤外(FT-IR)スペクトルを変換する減衰全反射モードを用いたBrukerベクトル33 FT-IR分光計を用いて記録されています。以下のプロトコルの各ステップについては、適切な個人保護衣(PPE)を着用することが重要です。

(ジェロームの手順に従って28)αクロロεカプロラクトン(モノマー)の合成

  1. 次のように合成を開始する前に、3-クロロ過安息香酸を27gの精製:
    1. 蒸留水800mlに、ナトリウムの1.28グラムを加えますリン酸一水和物及びリン酸ナトリウム二塩基性七水和物の8.24グラム。リザーブこの溶液30mL(水酸化ナトリウムまたは塩酸を使用して)pHを7.4に調整します。これは、緩衝溶液です。
    2. 分液漏斗を使用して、ジエチルエーテル35mlに3-クロロ過安息香酸を溶解させます。 (ステップ1.1.1で調製した。)緩衝液10mlで有機溶液を洗浄。洗浄を3回繰り返します。
    3. 有機溶液に直接硫酸ナトリウムを3gを加えます。この乾燥剤は、有機溶液から水を吸収します。
    4. 乾燥剤を除去するためのソリューションをフィルタリングします。 850ミリバール及び40℃でロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濾液を濃縮しました。
  2. 超音波浴中で撹拌することにより乾燥ジクロロメタン150mLに精製された3-クロロ過安息香酸18.5gのを可溶化します。このプロセスは、通常20分かかります。分液ロート内のソリューションを置きます。
  3. 二口、丸底フラスコの中で、窒素ガス下でマグネチックスターラーを用いて乾燥ジクロロメタン15mLに2-クロロシクロヘキサノンの13.1グラムを溶解します。攪拌してください。
  4. ステップ1.3において二口フラスコに(ステップ1.2から)、3-クロロ過安息香酸の溶液を含有する分液漏斗に合います。窒素ガスでシステムをフラッシュします。クロロ過安息香酸の溶液を、2-クロロシクロヘキサノン溶液に滴下して入るように分液漏斗の開度を調整(1滴おきに秒)及び96時間窒素ガス下で混合物を攪拌し続けます。
  5. M -chlorobenzoic酸(m個 -CBA)副生成物を沈殿させ、1時間-20℃に反応混合物を冷却します。
  6. M -chlorobenzoic酸(m個 -CBA)を濾過し、チオ硫酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、および塩化ナトリウムの飽和溶液で残りの溶液を洗浄します。
  7. 850ミリバール及び40℃でロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去します。淡黄色の粘性liquを精製2.3トルおよび96℃で減圧蒸留によりID。
  8. 以下の1つの H NMRピークを用いた合成の成功を監視します。 1 H NMR(400 MHzの、CDCl 3中、δ[PPM]):4.75から4.68(M、1H、C H CLCO)、4.37から4.26(M、1H、C H 2 O)、4.18から4.05(M、1H 、C H 2 O)、及び2.06から1.58(M、6H、-C H 2 - )6、27。

開環共重合させてα-3アームスターブロックコポリマー(SBC-αCl)の2の合成(シャルマ 6とAmsden 29)

  1. 合成前に、トルエン中の1H、1H、2H、2H- perfluorooctyltriethoxysilaneの2%(v / v)の溶液でそれを充填し、約24時間撹拌し、20 mLのアンプルをsilanize。イソプロピルアルコールでリンスし、30分間140℃のオーブンの中に置くことによって、それを乾燥させます。
  2. 3を追加蒸留εカプロラクトンの0.64グラム、αクロロεカプロラクトンを0.5g、およびアンプルへのグリセロールの0.25ミリリットル。 1分間ボルテックスを用いて混ぜます。
  3. アンプルにDの4.90グラム、Lのラクチドを追加し、窒素でそれをパージします。 D、Lラクチドを溶融するために120℃のオーブン中でアンプルを置きます。このプロセスは、典型的には約2時間かかります。すべての内容はよく混合され、(2のSn(10月))アンプルに錫の66μL(II)2-エチルヘキサン酸を追加することを確認するために渦を使用して再度混ぜます。
    NOTE:D、Lラクチドは、このプロセスの間に冷却し、溶融したオーブンで再加熱する必要があります。
  4. 激しく渦を使用して最後の時間をミックスし、窒素でフラッシュします。
  5. ゴム栓でアンプルを閉じます。真空管に接続された針を置きゴム栓を介して(ハウスバキューム、通常十分です)。 Gまでゆっくりひねり、真空をオンにして、火炎を用いて、ガラスの長い首を溶融少女は、それ自体に崩壊します。ゴム栓を溶融しないように注意してください。アンプルは、火炎密封したら、48時間140℃の砂浴、オーブン、または適切な加熱要素に配置します。
  6. アンプルを取り出し、それを室温で冷却しましょう。
  7. 密閉されたマークでアンプルを破壊し、ジクロロメタン10mLを添加することにより、高粘性液体を溶解します。分液漏斗にソリューションを転送します。
  8. 冷メタノール100mLを含有するフラスコを準備し(-78°C前後の温度でドライアイス/アセトン浴を用いて冷やし)。フラスコの上部に分液漏斗(ステップ2.7)に固定します。約2滴は、すべての他の第二(滴下して)落ちるように、分液漏斗の開口を調整します。
  9. (濾紙を使用)を濾過により白色沈殿物を収集し、50と60℃の間の真空オーブンで乾燥します。
  10. 以下の1 H NMR及びFT-IRピークを用いた合成の成功を監視します。 1 H NMR(400 MHzの、CDCl 3中、δ[PPM]):5.29から5.03(M、COC H C H 3)、4.43から4.25(M、C H CL)、4.24から4.12(M、C H 2 O)、4.11から4.03(T、J = 4.6 Hzの、C H 2 O)、3.80から3.68(M、C H C H 2)、3.09から2.64(ブロード、S、O H)、2.39(T、J = 4.5 Hzの、α-H)、2.33 (T、J = 5.1 Hzの、α-H)、及び1.77から1.25(M、C H 2、C H 3)。 FT-IR(1 /λ[-1]):2932(S)、2869(m)は、1,741(S)、961(S)、866、および735(M)6、27。
    注:上記開環共重合(ROP)の手順に従って、より親水性の3D LCEを調製代わりにSBCの線状ブロック共重合体(LBC)を調製しました。
    1. シラン処理バイアル混合物にポリエチレングリコール(PEG)を0.3gを追加し、3.15グラムのεカプロラクトン、αクロロεカプロラクトンを1.0g、及びDを5.0g、L-ラクチド。

    (シャルマによる。6)3αN3 -ThreeアームSBC(SBC-αN3)のα-CL-三アームSBCの合成修飾

    1. 丸底フラスコに、窒素下、乾燥N、N」ジメチルホルムアミド30mLにSBC-αClを5g溶解します。
    2. アジ化ナトリウムの0.22グラムを追加し、室温で一晩反応することができます。
      注意:アジ化ナトリウムは有毒です。適切な個人保護衣(PPE)を着用。
    3. N、11ミリバール及び40℃でロータリーエバポレーターを用いて減圧下でN」ジメチルホルムアミドを除去します。トルエン30mL中の混合物を溶解させます。形成された塩を除去するために15分間2,800×gで三回溶液を遠心分離。 77ミリバール及び40℃でロータリーエバポレーターを用いて減圧下でトルエンを蒸発させます。
    4. 1 H NMR及びFT-IRピークを使用してアジド置換の成功を監視します。
      注意: /λ[-1]):2928、2108、(S、アジド)、1754(s)は、1450(s)は、960(M)、865(S)、733(S)、および696 (M)。

    4.(シャルマによる。6とドナルドソン 30)コレステリル5- Hexynoate(LC部分)の合成

    1. 丸底フラスコに、5-ヘキシン酸3g及びジクロロメタン130ミリリットルを混合します。氷浴を用いて0℃に冷却します。
    2. 別の丸底フラスコに、N、N」ジシクロヘキシルカルボジイミドの8.28グラム、コレステロールの10.3グラム、および4-ジメチルアミノピリジン0.2gを混合します。
    3. コレステロールの混合物を含むフラスコに、5-ヘキシン酸溶液を滴下して移し、0℃で1時間、最終的な混合物を維持します。
    4. 混合物を一晩室温まで昇温することを許可します。 グレード415濾紙を用いて濾過することにより得られたジシクロヘキシル尿素沈殿物を除去し、それを捨てます。
    5. 850ミリバール及び40℃でロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濾液を濃縮します。ヘキサン150mLに集められた残渣を溶解します。
    6. 335ミリバール及び40℃でロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を蒸発させます。最終生成物を回収し、油状残渣にエタノール350 mLを加え。エタノールが形成され、オフホワイトの固体を洗浄し、50℃の真空下で固体生成物を乾燥させます。
    7. 以下の1 H NMR及びFT-IRのピークを用いて合成をモニターします。 1 H NMR(400 MHzの、CDCl 3、δ[PPM]):5.39(D、J = 4.7ヘルツ、1H、C H = C)、4.70から4.58(M、1H、C H OCO)、2.44(T、 J = 2.5 Hzの、2H、C H 2 CO)、2.34(M、2H、C H 2 -C = H)、2.31(M、2H、C H 2、C H 2 -COO)、2.28(s、1H、 HC≡C)、2.27(D、J = 2.3 Hzで、2H、≡CCH 2)、2.07から1.06(M、2H、C H 2、C H)、0.94(s、3H、C H 3)、0.89 (D、J = 1.8 Hzで、3H、C H 3 C H)、および0.88(D、J = 1.8 Hzの、6H、C H 3 -C H)、0.67(s、3H、C H 3)。 FT-IR(1 /λ[-1]):2,830-2,990(広範かつ強いピーク)、2104(m)は、1,695(S)、1428(m)は、1,135(M)、999(S)、798 (S)、および667(S)。

    5.合成改変α-N 3 -ThreeアームSBCは、α-コレステリル三アームSBCアジド-アルキンヒュイゲンシクロ付加反応を介して(SBC-αCLC)( "クリック"反応)による(SBC-Cholでを取得するためにシャルマ 6)

    1. 丸底フラスコに、新たに蒸留したテトラヒドロフラン(THF)100mLにSBC-αN3(1.5g)を1モル当量を溶解します。 1.2モルequivalenを追加コレステリル5- hexynoate(1.94グラム)、銅(I)の0.1モル当量のヨウ化物(0.06 g)を、T、及びトリエチルアミン0.1モル当量(0.03 g)を得ました。窒素下で35℃で一晩、混合液を撹拌しました。
    2. 357ミリバール及び40℃でロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を蒸発させます。
    3. ジクロロメタン80ml中の残留混合物を溶解し、未反応材料及び副生成物を除去するために、室温にて2,800×gで5分間遠心します。
    4. 以下の1 H NMR及びFT-IRのピークを用いて合成をモニターします。 1 H NMR(400 MHzの、CDCl 3中、δ[PPM]):7.54(S、CH = Cトリアゾール)、5.43から5.34(M、C = CHコレステロール)、5.10から5.06(M、COCHCH 3)、4.68 -4.55(M、O-CHコレステロール)、4.24から4.19(M、CH 2 O)、4.18から4.13(T、J = 5.0 Hzで、CH 2 O)、4.11から4.05(T、J = 4.4 Hzで、CH 2 O)、2.47から2.41(T、J = 4.9 Hzで、COCH 2)、2.31から2.25(M、COCH 2)、2.07から1.02(M、CH 2 3)、1.05から1.03(S、CH 2、CH 3)、0.96から0.92(D、J = 3.3 Hzで、CH 2、CH 3)、0.91から0.87(DD、J = 1.9 Hzで、J = 1.8ヘルツ、CH 3)、0.71から0.68(s、CH 3)。 FT-IR(1 /λ[-1]):3260(s)は、2,920(S)、1,710(S)、1,460(S)、1,370(S)、1240(m)は、1,190(S)、733 (S)、および668(S)。

    2,2-ビス(1-カプロラクトン-4-イル)プロパン(架橋剤、BCP)の6の合成(ガオ 27及びAlbertsson による。31)

    1. 丸底フラスコに、1,2-ビス(4-ヒドロキシシクロヘキシル)プロパン及び酢酸52 mLを10.8gのを含有する溶液を調製。
    2. 酢酸50mLおよび蒸留水8mlに三酸化クロムの11グラムを含有する溶液を調製します。で、例えば、17と20℃(混合物との間の温度を維持しながら、ステップ6.1で調製した溶液に、この溶液を滴下して加えます水浴);この滴下法は、2時間を要します。プロセスが完了すると、溶液を約30分間攪拌することができます。
    3. 2-プロパノール50 mLを加え。室温で一晩ソリューションをかき混ぜます。
    4. 137ミリバール及び40℃でロータリーエバポレーターを用いて減圧下暗紫色溶液を濃縮。沈殿を蒸留水300mLを追加します。沈殿物は、紫色の光でなければなりません。
    5. グレード415ペーパーフィルターを使用して、粗生成物をろ過します。蒸留水〜250mLで又は固体が白色になるまで固体物質を洗浄します。
    6. 40℃でベンゼン15mLに固体材料を溶解し、25℃で再結晶化しましょう。
    7. 乾燥ジクロロメタンフラスコにジクロロメタン75mlに3-クロロ過安息香酸6.0gを含む溶液に溶解し、乾燥ジケトンの8.34グラムを加えます。
    8. 24時間、40℃で溶液を還流。
    9. Mを沈殿させ、10分間-20℃に反応混合物を冷却
    10. (濾紙を使用)を濾過によりM -chlorobenzoic酸を除去し、減圧下で溶液を濃縮します。
    11. 2-ヘプタノン200mLでビスコース、粗生成物を洗浄し、50℃で一晩真空下で沈殿物を乾燥させます。
    12. 以下の1 H NMR及びFT-IRのピークを用いて合成をモニターします。 1 H NMR(400 MHzの、CDCl 3中、δ[PPM]):4.42から4.37(DD、J = 14.2、7.4 Hzで、2H、C H 2 OC = O)、4.21から4.15(T、2H、J = 11.3ヘルツ、C H 2 OC = O)、2.80から2.75(DDT、J = 14.3、6.5、1.6ヘルツ、2H、C H 2 COO)、2.63から2.57(TT、J = 13.3、2.1 Hzで、2H、C H 2 COO)、2.04から1.93(M、4H、-C H 2 CH 2 OC = O)、1.70から1.56(M、4H、-C H 2 C H 2 COO)、1.48から1.38(M、2H、 - C H C(CH 3)2)、0.84(s、6H、C H 3 C-)。
    13. (ガオによる。27)架橋剤として(1-カプロラクトン-4-イル)プロパン(BCP)27ヘキサメチレンジイソシアネート(HDI)又は2,2-ビスのいずれかを使用して多孔質3Dエラストマー骨格の7作成

      1. HDIの0.25mLの(またはBCPの0.45 mL)および蒸留εカプロラクトンモノマーの0.24ミリリットルを添加することにより、SBC-αCLCを0.75gを用いた3アームのエラストマー混合物を調製します。 Snを60μL(10月)2を追加します。 (このステップは、2時間までかかることがあります)の代わりにHDIのBCPを使用する場合、ボルテックスを用いてSBC-αCLC及びBCPを混合し、BCPを完全に溶融し、溶解するまで140℃のオーブンに置きます。 BCPが溶解した後、オーブンと、Snの(10月)2、及び渦の外にそれを取ります。
      2. 1×4センチ金属片を切断することによって「犠牲」ニッケルフォームテンプレートを準備します。最終的なロールが、約1×1cmの金属片( 図4参照 )となるように、短い端部の一方からロール。
      3. <LI>ガラスバイアルまたはアルミホイルパックにニッケル発泡体を入れて、完全に2分間発泡体を覆うようにステップ7.1で調製した混合物を注ぎます。パスツールピペットで余分な混合物を取り除きます。 80℃のオーブンで一晩でそれを残します。
      4. アルミホイルをはがしたりガラスを破ります。カミソリの刃を用いて、ニッケル金属を露出させるために金属発泡体の周りにエラストマーを剃ります。
      5. 水100mL中の1M塩化鉄(III)(FeCl 3を)溶液を調製します。フラスコ内の泡を置きのFeCl 3溶液70mlを加えます。室温で3日間撹拌し、毎日のFeCl 3溶液を変更します。各変更の前に、0.5時間イオン水で泡をかき混ぜます。
        注:エッチング・プロセスは、通常、3日後に終了しました。フォームが柔らかく感じるまでエッチング工程が完了したことを確認するために、触覚圧縮試験を行います。触覚圧縮試験に泡抵抗は残留金属鋳型の存在を示します。
      6. ELASTをすすぎます40°Cで真空オーブンで一晩エタノールと場所とオマールフォーム。
      7. 走査型電子顕微鏡(SEM)、示差走査熱量測定(DSC)、機械的な圧縮試験、及び熱重量分析(TGA)27を使用して、材料を特徴づけます。
        注:より親水性の3D LCEを調製するために、ステップ7.5に記載の手順に従って、(LBCはまた、LCの部分を含むことを確認すること)LBCとSBCを置き換えます。

      無菌技術を使用して8 SH-SY5Y神経芽腫細胞を有するエラストマー足場の播種と培養

      1. 70%エタノール1mLで2度洗浄することによりエラストマーを滅菌します。 10分間のUV照射を行い、70%エタノール1mLで洗浄します。滅菌水1mL及びリン酸緩衝生理食塩水(PBS)1mLで二回リンス。 24ウェル培養プレート中にエラストマーを配置します。
      2. 90%のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)supplemを含有するSH-SY5Yための細胞増殖培地を準備10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン - ストレプトマイシン(ペニシリン - ストレプトマイシン)でented。
      3. 血球計数器を用いて細胞をカウントした後、増殖培地100μL(シード溶液)中に懸濁し、1.5×10 5 SH-SY5Y細胞を調製します。ドロップを形成することを確認して、エラストマーの上にソリューションを追加します。
      4. 細胞接着を促進するために、2時間、37℃で、5%CO 2で播種エラストマーをインキュベートします。増殖培地の0.5ミリリットルを追加します。 5%CO 2で37℃で再びインキュベートします。
      5. PBS 1mLで洗浄した後、培地を一日おきに変更します。

      エラストマーの9.顕微鏡イメージングを構築します

      1. 15分間、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を有するエラストマー上で増殖させた細胞を固定します。 PBS 3mLで5分間3回ずつ洗浄し、取り付けられたカバースリップで培養皿に固定された細胞を用いてエラストマーを置きます。
        注意:PFAは有毒です。適切な個人保護衣(PPE)を着用してください。
      2. 駅10分間PBS500μLの4' 、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)の0.1%と固定したサンプル中で5分間二回PBS 1mlですすぎます。
      3. サンプルにまたがる画像スタックを取得し、DAPI蛍光と共焦点顕微鏡を使用して直ちに画像エラストマー。
        注:ここでは、画像スタックは、20X目的と60Xの対物レンズを用いて取得しました。
      4. ImageJの32を用いた光共焦点画像スタックを分析します。

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Representative Results

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このレポートは、ニッケル金属テンプレートを使用して、細胞培養のための足場としての多孔質の3D LCEの調製方法を示します。得られた3D LCEは容易細胞浸潤を可能にする複雑な相互接続チャネルネットワーク、ならびにより適切な物質移動27を示しています。これは、細胞が完全に相互接続チャネルネットワークに侵入することができ、また、LCE内に整列させることが可能であることが見出されました。ここで、金属ニッケル発泡体(99%のNi、860グラム/ cm 2の密度)は、以前のKung によって報告されたグラフェンの発泡調製と同様の手法に従って選択しました 22。金属発泡体は完全にカバーされ、すべての金属支柱と、キャストポリマーでした。それはLCEの最終形態を付与し、目的の組織環境を模倣するのに役立ちますように、金属泡の大きさと密度の選択は、重要です。

D、L-ラクチド( 図2)です。最終生成物は疎水性の3アームSBCあります。それぞれ、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトールとグリセロールノードを置き換えることによって作られた4,6アームを有するのSBCは、以前に18に報告されています。より親水性のSBCのために、中央ノードは、オリゴエチレンオキシド(プロトコルのメモを参照)で置き換えました。しかし、線状ブロック共重合体27にオリゴエチレンオキシド結果とグリセロールを置き換えます。我々はヨウネスから修飾合成を用います 29。修正されたバージョンは、改変ε-CAの使用を可能に2つの異なる位置でハロゲン基、カルボニル6にアルファおよびガンマとprolactone。 SBCが形成されると、改変εカプロラクトンブロックは、アジド基とハロゲン原子の変位を受けます。減衰全反射を用いて、1バンド(ATR)FT-IR( 図3) -アジド基によるハロゲン基の置換は、2,100・cmの出現によって確認されます。アジド基は、後側と最終的な星型ブロック共重合体を得、共有結合(また、「クリック反応」として知られている)アルキンアジドヒュイゲンの付加環化反応を用いて、スターブロックコポリマーのLC部分(コレステリルhexynoate)を取り付けるために使用されています - 鎖コレステロールペンダントユニット(SBC-Cholで)。トリアゾール環の形成は、2,100・cmの消失によって確認された- 1つのバンドおよび1 H NMRスペクトルで7.30 ppmの観察シングレットの外観( 図を参照3)。我々は最近、官能ε-CL 6上のカルボニルのハロゲン基のいずれかアルファの配置の効果(α-Br)またはガンマ(γ-CL)に報告しています。中央ノードがイニシエータおよび固有架橋剤18の両方として機能するので、4アーム、6アーム、中央コアを有するSBCコポリマーの中央ノードを交換して得られた種の保存法の機械的特性に影響を与えることに留意すべきです。

SBC-Cholを用意し、十分に特徴付けされた後、金属テンプレートを使用して架橋プロセスは、フォームを調製するための最後のステップです。 SBC-Cholでは、ヘキサメチレンジイソシアネート(HDI、架橋剤)、εカプロラクトン、およびSn(OCT)2(ROP触媒、ステップ7.1を参照)と混合しました。ビス - カプロラクトン(BCP)架橋剤は、以前に報告されているように、HDIと交換しました。金属発泡体は、所望のFに切断し、成形されORM( 図4)。発泡製剤、すなわち、一次多孔度(LCEFのPP)および一次/二次多孔度(LCEF P + SP)のための2つの経路が、以前に報告されています。ニッケルテンプレートが迅速にポリマー混合物中に浸漬される。ここで、LCEF P + SP、または「浸漬」法は、提示されています。金属発泡体は完全にポリマー混合物中に浸漬し、すべての金属支柱と、アルミニウム箔またはポリマー混合物を含有するシンチレーションバイアル製の容器の内側に配置されています。過剰のポリマー混合物を慎重に除去されます。このポリマーで被覆されたニッケルのテンプレートを80℃のオーブン中で、まだ容器内、一晩置いています。架橋は、約2時間、触媒の存在下で行われます。架橋処理後、ポリマーで被覆されたニッケルのテンプレートが、アルミニウム箔を剥がし、ガラス容器を破壊することによって、その容器から除去されます。過剰ポリマーは、ポリマーで覆われたニッケルTEMPLから慎重に剃っていますニッケルテンプレートのエッジを露出するように食べ、飽和のFeCl 3溶液( 図5)と容器内に置きました。数時間後、ニッケルがほぼ完全に除去され、そしてのみLCEフォームは、ニッケル/のFeCl 3溶液を除去するために脱イオン(DI)水ですすぎます。 LCE発泡体は再び2回、飽和のFeCl 3溶液を含む容器の内側に配置し、DI水ですすがれます。エッチング処理が完了し、全体ニッケルテンプレートが完全に除去された後に、LCE発泡体は中空支柱( 図6)と相互接続チャネルネットワークを示します。 図6は、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて観察された内部LCE発泡形態を示します。 LCE発泡体支柱は、中空であり、全体的な定期的な形態は、ニッケルフォームテンプレート次第です。

以前は、BCPの使用はソルでそれを保つためにいくつかの手順が必要ン( すなわち、溶融)、BCPは、溶液は数度冷却するとすぐに再結晶化し始めるので(SN(10)2を追加するために、140℃から室温まで、ステップ7.1参照)。これは、架橋前に挑戦発泡金属とポリマーの混合物の操作を行います。 BCPを使用した場合よりも高速架橋時に許可され、架橋剤としてのHDIを使用します。 HDIは、室温で液体であるのに対し、BCPは、140°Cの融点を有する、室温で固体です。架橋剤の選択は、直接私達の場合のように、また、エラストマー製剤を低減、140から80°Cに架橋温度を低下させ、準備時間に影響を与え。

LCE発泡体は、圧縮変形( ムービー1)を用いて試験しました。 LCEサイズの70%の減少が全体の寸法に影響を与えずに、観察されます。 LCEからの圧縮が解除されると、それは完全に元のSを回復しますHAPEとサイズ。エラストマーは、それらの元の形状を回復しなかったコレステロールεカプロラクトンブロックすることなく、同じ条件で調製し、それ自体に折り畳まれるようLCE材料における液晶部分の存在は、重要であると考えられています。

LCEフォームが得られたならば、彼らは標準的な細胞培養技術を用いて神経芽細胞腫(SH-SY5Y)を播種する準備ができました。 LCEフォームは70%エタノールで2回洗浄し、前細胞播種にPBSで3回すすぎました。細胞播種の2〜3日以内に、細胞は、3D LCEネットワークの壁に取り付けることが観察されました。完全LCEネットワーク内の細胞の付着および増殖を研究するために、細胞を30日間( 図7)の後に固定しました。細胞は、DAPIで染色し、固定し、共焦点顕微鏡を用いて画像化しました。細胞は、増殖取り付けられており、広範囲の3D LCE足場ネットワークをカバーするように拡大していることが判明しました。さらにより詳細な分析は、ほとんどの場合、3次元LCE足場ネットワークの湾曲した部分によって影響されなかった細胞核の伸長を、明らかにしました。細胞伸長は、細胞の配向と相関させることが、最も可能性の高い提示LCEのスメクチック相特性の結果であることができます。これは、以前の14日27後に成長しC2C12細胞で観察されました。本研究では、細胞は14日間以上増殖し続けることを示しています。これは単独のC2C12細胞に限定されるものではありません。 LCEフォームの使用は、ほぼすべての細胞株に拡大することができます。 3D LCE泡状足場上で増殖する細胞は、2D足場と比較してより高い質量輸送効率の恩恵を受ける。 2D足場において、細胞は、通常、互いの上に、層状に成長します。トップ層の上に成長した細胞は、完全なすべての栄養素へのアクセス、ガス、および廃棄物の除去(質量輸送を)持っている唯一のものです。下位層内の細胞は、栄養素をアクセスすることができない、及びセルDの高度がありますこの場合eath。 3D足場内で、細胞は、長期の細胞及び組織再生の研究を可能にする、栄養素、成長因子、および気体に対してより効率的(2D足場と比較して)アクセス権を持っています。 3D LCE泡状の足場を用いた細胞廃棄物管理(廃棄物の除去)は、2次元の足場よりも効果的です。種の保存法の気孔率は(および/または他の構造特性)の急速な物質移動を可能にし、マトリックスの中央領域へのメディア及びセルラーアクセスを可能にする、より少ない多孔性(または他の)マトリックスに比べてセルの負荷を増加させました。このLCEプラットフォームは、筋肉、神経、および皮膚、とりわけ、だけでなく、多細胞の培養系を含むプライマリおよび不死化細胞株の多くの種類の成長をサポートするために調整可能です。長期間多くの異なる細胞型およびシステムを成長させるために使用することができますので、基本的に、これは、プラットフォームの利点の1つです。また、構築物中の細胞の複数の層を成長させる能力がより密接にEMULATE自然環境。

図1
図1:LCEフォームのステップバイステップの調製および特徴を説明する一般的な手順。詳細については、プロトコルのセクションを参照してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:3アームSBCの架橋スキーム。泡状種の保存法の調製のためのニッケル鋳型の存在下で架橋剤としてbiscaprolactone又はHDIを用いた3アームSBCの架橋スキームが示されています。 このfiguの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。再。

図3
3:1 H NMR及びFT-IR、続いて1,2,3-トリアゾール形成(成功した「クリック」反応)のスキーム。減衰全反射(ATR)FT-IRを用いて1バンド-アジド基によるハロゲン基の置換は、2,100・cmの出現によって確認されます。 1バンドおよび1 H NMRスペクトルにおける7.30 ppmに観察シングレットの外観、 -トリアゾール環の形成は、2,100・cmの消失によって確認されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:光学像様々な泡形状の架橋前。示すように、金属発泡体は、望ましい形に切断して成形されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:(A)と後(B)架橋前ニッケルフォーム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6:LCE泡の形態は、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて観察しました。 SBCベース(A及びB)及びLBCベース(C上LCE発泡体の代表的なSEM像D)エラストマーが示されています。矢印は、中空の支柱を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
図7:30日播種後エラストマー発泡体に取り付けられたSH-SY5Y細胞のDAPI染色された核を表示する共焦点顕微鏡写真。 2D画像は、Z -方向に積層し、そして断面XZの画像-及びYZ -planesを作成しました。画像は、SH-SY5Y細胞(輝点)がエラストマー発泡中空チャネルの壁内に取り付けられ、拡張することを示します。細胞は、空間的に複数の層に展開し、XZに示すように(構築物を通して100μmの上に延在し-及びYZ -plane画像クロス秒ション)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

映画1
映画1:LCEロールの変形と回復のビデオ画像。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには右クリックします。)

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Discussion

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液晶エラストマーは、最近、それらの刺激応答性、生体適合性細胞の足場として研究されてきました。彼らは、細胞の足場として理想的なプラットフォームであることが証明されています。しかし、新しいLCE足場を準備して設計する際に心に留めておくべき重要な要因は、多孔性です。浸出性固形物23またはガスの取り込みは、常に均質な多孔性または完全に相互接続された孔にはなりません。だけではなくてエッチングすることができる金属テンプレートの使用は、より組織的かつ定期的な内部構造を持ってする機会を提供していますが、また、細孔サイズおよび密度を選択することができます。これは、以前グラフェンフォーム22の調製のために使用される金属のテンプレートに直接関係します。金属テンプレートは、通常の多孔性のデと洗練された複雑なアーキテクチャを作成するために、可能性の広大な配列を許可する、LCEの架橋前に形状を形成する機会を提供します密接に内因性の環境に似せて署名しました。発泡種の保存法は、この方法論を用いて調製された細胞材料の改良された研究と、より重要なことを可能にする、空間的な細胞 - 細胞相互作用、二次元(2D)環境内で可能ではない偉業。 2D細胞足場は、細胞が自由に隣接細胞と相互作用することはできません。また、細胞は、典型的には相互作用のために、もっと重要な成長のためのスペースと、へのフルアクセスすることなく、単層で(または直接互いの上に)成長します。潜在的なインプラントまたは生体系をミラーリングするように設計された長期的な実験プラットフォームとしての構造を設計する際に、このようなニューロンやグリア細胞などの特定の空間的相互作用の細胞型は、最も重要です。

ここで紹介する私たちのモジュラー、金属テンプレートを使用した無溶剤型LCE合成は、モノマー7の適切な中央ノードとの比を選択することにより、親水性/疎水性のバランスを調整することにより、細胞接着を調節することができます27。これは通常、細胞接着を促進するために行わマトリゲル層の添加を含む余分なステップを避けるために、細胞播種のために適切です。それらはLCエラストマーの熱的および機械的特性に影響を与えるような量と中央ノードのサイズ、ならびに架橋剤は、最終LCEにおいて重要な役割を果たす。 LCEは6を劣化させるような組織の完全な再生に合わせて、前に提示されるよう加えて、これはまた、生分解性速度の調整が可能になります。現在、我々は、クロスリンカー、中央コア、及びDの置換のタイプは、Lのラクチドに対するL -ラクチドは、弾性特性、細胞の接着、増殖、及び細胞の配向にどのように影響するかを調査に焦点を当てた継続的な実験を有します。

このプロトコルの制限がある:(1)市販の金属(ニッケル)フォーム及びストラット寸法におけるそれらの限られた範囲の限られた様々な、(2)LCE、または任意の他のポリマー/エラストマー材料は、化学的に(ここでは、FeCl 3をエッチング)金属エッチングの条件をレジスト、および(3)細胞の整列はここで報告液晶変性エラストマーに限定されるように見えることをなければならないという要件(親非LCEエラストマーは、任意のかなりのセル配置を示しませんでした)。

結論として、以前のSmA種の保存法は、当社のモジュラー合成手順を用いて調製することができることが示されています。追加の生体適合性LC部分は、その機械的性質と新液晶、細胞増殖に及ぼす影響と、特に、セルの配置を探索するために組み込むことができます。機械的特性、特にヤング率の値は、細胞の接着、増殖、および細胞の位置合わせのために重要であることが知られています。ここでの結果は、SMA種の保存法の気孔率は、細孔径を制御する効果的な方法を提供し、LCEを調整するために、金属テンプレートを使用して調整することができることを示しています形状( すなわち、全体的な形態)。ニッケルテンプレートをエッチングし、続いてSCBポリマー混合物へのNiテンプレートを浸漬すると、新しいLCEの形態のための簡単なアプローチを提供します。ここで説明する泡様種の保存法は、成長との相互作用のためのより現実的な、3D環境で(ここでは、SH-SY5Y、神経細胞の機能を研究するための標準的な細胞モデル)細胞を提供しています。複数の細胞型がエラストマー全体に分散し、複数の層で成長できるようにすると密接に内因性の神経環境を模倣し、より洗練された3D組織培養実験の興味深い可能性を提供しています。ネイティブなアーキテクチャを模倣するチューナブルおよびダイナミック種の保存法の使用は、縦方向と臨床的に関連する細胞研究のための次世代の細胞モデルのための道を開きます。

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Disclosures

著者は、開示することは何もありません。

Acknowledgments

このプロジェクトの財政支援のために - 著者はケント州立大学(ReMedIKSケント州での再生医療・イニシアティブのための共同研究助成金や支援を)感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane Alfa Aesar L16606 Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane TCI B0928 Reagent
2-chlorohexanone  Alfa Aesar A18613 Reagent
2-heptanone  Sigma Aldrich W254401 Solvent
2-propanol  Sigma Aldrich 278475 Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA Sigma Aldrich 273031 Reagent
4-dimethylaminopyridine Alfa Aesar A13016 Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI  Invitrogen D1306 Nuclear Stain
5-hexynoic acid  Alfa Aesar B25132-06 Reagent
Acetic acid VWR 36289 Solvent
Acetone Sigma Aldrich 34850 Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade  VWR 71001-866 Reagent
Benzene Alfa Aesar AA33290 Solvent
ε-caprolactone  Alfa Aesar A10299-0E Reagent
Chloroform VWR BDH1109 Solvent
Cholesterol Sigma Aldrich C8503 Reagent
Chromium(VI) oxide Sigma Aldrich 232653 Reagent
Copper(I) iodide Strem Chemicals 100211-060 Reagent
D,L-Lactide  Alfa Aesar L09026 Reagent
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Solvent
Diethyl ether  Emd Millipore EX0190 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME  CORNING Cellgo 10-013 Cell Media
Ethanol Alfa Aesar 33361 Solvent
Formaldehyde  SIGMA Life Science F8775 Fixative
Fetal bovine serum, FBS  HyClone SH30071.01 Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe VWR 28320 Filtration
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI Sigma Aldrich 52649 Crosslinker
Iron(III) chloride  Alfa Aesar 12357 Etching agent
Isopropyl alcohol VWR BDH1133 Solvent
Methanol Alfa Aesar L13255 Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Aldrich D80002 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Nickel metal template American Elements Ni-860 Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) ATCC CRL-2266 Cell line
Penicillin streptomycin  Thermo SCIENTIFIC 15140122 Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG Alfa Aesar B22181 Reagent
Sodium azide  VWR 97064-646 Reagent
Sodium bicarbonate AMRESCO 865 Drying salt
Sodium chloride BDH BDH9286 Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S-374 Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma Aldrich S9638 Drying salt
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313 Drying salt
Tetrahydrofuran Alfa Aesar 41819 Solvent
Thiosulfate de sodium AMRESCO 393 Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate Aldrich S3252 Reagent
Toluene Alfa Aesar 22903 Solvent
Triethylamine Sigma Aldrich 471283 Reagent
Trypsin HyClone SH30042.01 Cell Detachment
Olympus FV1000

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References

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3D空間の細胞培養のための細胞骨格などの生体適合性液晶エラストマー発泡体の合成
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