Summary
Inandningsenheten som beskrivs häri kan generera, prov för karakterisering, och likformigt avsätta ett läkemedel aerosol i lungorna hos gnagare. Detta möjliggör den prekliniska bestämning av effekten och säkerheten av läkemedelsdoser deponeras i lungorna; nyckeldata som möjliggör klinisk inhalerad drogutveckling.
Abstract
Obstruktiva andningssjukdomar, såsom astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) för närvarande behandlas av inhalerade antiinflammatoriska och bronkodilaterande läkemedel. Trots att det finns flera behandlingar, är båda sjukdomarna växande folkhälsoproblem. Majoriteten av astmapatienter under god kontroll på aktuella inhalerade behandlingar men ett stort antal patienter med svår astma inte. Astma drabbar uppskattningsvis 300 miljoner människor över hela världen och cirka 20 procent har en svår form av sjukdomen. Till skillnad från astma, det finns få effektiva behandlingar för KOL. Uppskattningsvis 10% av befolkningen har KOL och utvecklingen i dödligheten ökar för KOL och samtidigt minska för andra allvarliga sjukdomar. Även om utvecklings läkemedel för inhalerad leverans är utmanande, möjliggör näsan endast inandning enhet direkt leverans av nya läkemedel till lungan hos gnagare för pre-klinisk effekt och säkerhet / toxikologistudier. Inhalerad läkemedelstillförselhar flera fördelar för respiratoriska sjukdomar, där hög koncentration i lungan förbättrar effektiviteten och minimerar systemiska biverkningar. Inhalationssteroider och luftrörsvidgande dra nytta av dessa fördelar och inandning leverans kan också hålla potential för framtida biologiska terapier. Inandningsenheten som beskrivs häri kan generera, prov för karakterisering, och likformigt avsätta ett läkemedel aerosol i lungorna hos gnagare. Detta möjliggör den prekliniska bestämning av effekten och säkerheten av läkemedelsdoser deponeras i lungorna hos gnagare, nyckeldata som erfordras innan initiering av klinisk utveckling.
Introduction
Det finns många fördelar med att inhalerad administrering av läkemedel för behandling av luftvägssjukdomar. Inhalerad leverans tillämpar terapeutiskt medel direkt till verkningsstället, lungorna. En hög lokal koncentration av läkemedlet i lungorna erbjuder en betydande fördel som minimerar dos och systemisk exponering, och maximerar effektivitet. Detta är en viktig fördel som kraftigt kan öka det terapeutiska indexet (TI, förhållande mellan dos av läkemedel som orsakar en sidoeffekt över dos av läkemedel som ger efficacy) av ett läkemedel. Inhalerade β 2 adrenergiska agonister, kortikosteroider och anti kolinerga läkemedel har visat sig vara effektiva för att förbättra lungfunktionen hos patienter med astma och KOL, samtidigt minimera de systemiska biverkningar (takykardi, immunsuppression, och förstoppning) observerades när dessa läkemedel tas oralt. Nya läkemedelsklasser (till exempel, PDE4-inhibitorer 1 och BTK inhibitorer 2) har nyligenvisat sig vara effektiv för att förbättra lungfunktionen i modeller men, prekliniska djursjukdomar liknande P2-agonister, kortikosteroider och anti kolinerga läkemedel, lider av systemiska biverkningar som kan minimeras genom inhalerad leverans. På grund av den extra kostnaden för utveckling av inhalerade vs. orala läkemedel, bör en inhalerad formulering endast övervägas för respiratoriska indikationer efter framgångsrik oral / systemisk administrering avslöjar dosbegränsande mekanismbaserade systemisk biverkningar.
Pre-kliniskt, är inhalerade föreningar optimerade för att öka TI, som kräver in vivo effekt och biverknings mätningar. Initialt dessa mätningar kan göras i separata analyser, vanligen en topiskt levererad effekt mätning och en systemiskt levererade bieffekt mätning, men att verkligen jämföra föreningar skall effekt och biverkningar mätas i samma djur efter inhalerade administrering. Detta kräver studier att AC dos / responshieve tillräckligt förening som administreras till lungorna för att inducera en mätbar bieffekt. Det enda sättet för närvarande att likformigt fördela stora doser av läkemedlet in i lungorna av multipla små djur samtidigt är nose-only inhalation 3, 4, 5. Styrkor och svagheter hos olika inandning exponeringstekniker har nyligen samman 6, 7, 8. Specialutrustning och en stor mängd av testförening (gramkvantiteter) krävs för näsa-bara inhalerad läkemedelstillförsel, men proof-of-concept studier kan vara möjligt med andra medel.
När mängden läkemedel är begränsad (mg kvantiteter), direkta administreringsmetoder är ett alternativ men lider alla av icke-homogen avsättning, med mer läkemedel koncentrerad längs de centrala luftvägarna och mindre väl representerade i parenkymal / alveoläraområdena 3, 4, 5. Den effektiva dosen som levereras genom direkt instillation är alltid högre och kan aldrig direkt jämföras med inhalerade doser 4. Direktinstillation metoder inklusive intranasal 9, intratrakeal vätska 10, 11 och sprayinstillation 12, eller torrpulver insufflation 13, kan 14 användas som ett screeningsverktyg för att bestämma den ungefärliga dosintervallet för senare näsa-bara inhalationsstudier, eller för att bestämma ranking av effektivitet / toxicitet för en serie av strukturellt liknande läkemedel 15. På grund av att den centrala luftvägsavsättningsmönstret, kan direkta administreringsmetoder vara mer användbart för att bestämma effekterna av föreningar som verkar på de centrala luftvägarna (bronkodilatorer eller mastcellhämmare) än in den perifera lungan (antiinflammatoriska medel).
Till skillnad från människor, som kan andas in en betydande dos av koncentrerad aerosol från en inhalator i en enda djupt andetag, kontinuerlig generering av en respirabel (0,5-5 | im aerodynamisk massmediandiameter, MMAD) aerosol, i upp till en timme, krävs för att deponera en verksam läkemedelsdos i en spontanandning gnagare lungor i en näsa-bara inhalationssystem 16. Aerosolgeneratorer (jet nebulisatorn eller Wright damm foder 17) som kontinuerligt kan producera den erforderliga aerosolen partikelstorleken och koncentrationen för näsa-bara inhalationsstudier är inte särskilt effektiva på att generera hög kvalitet (respirabla) aerosoler. De läkemedelsmatningshastigheterna till dessa aerosolgeneratorer för potent (IC 50 pM till nM i funktionella cell baserade analyser) föreningar är vanligen i en till 10 mg / min intervall och vanligen mindre än 1% av det läkemedlet aerosol gör det till andningszonen av djuren(Figur 1). Många av partiklarna som genereras är för stora (> 5 pm) för att komma in i lungorna och avlägsnas genom en aerosol klassificerare (en pre-separator eller cyklon med ett 5 | im snitt punkt) för att undvika en stor dos av läkemedel i näsan. Tillsats till ineffektiviteten hos näsa-bara inandningssystem är den lilla partikelstorleksområde (0,5 till 5 pm MMAD) för inandningsbara partiklar. Många av aerosolpartiklarna mindre än 0,5 ^ m utandas (som cigarettrök) och inte deponeras i lungorna 18. Även många av de "större" aerosolpartiklar (~ 5 | im) insättning i näsan absorberas eller transporteras av mukociliär clearance mot baksidan av halsen där de sväljs in i magen 19. Vid användning av näsa-bara inhalering är dosen deponeras i näsan alltid större än den avsätts i lungorna dos och den nasala dos kan bidra till systemisk exponering och biverkningar 20. Naturligt, inhaleras drug doser är små (i mikrogram-området) minimera eventuella systemisk biverkan potential av läkemedel som absorberas av den nasala, lunga, eller gastrointestinala vävnader. Även när partikelstorleken av aerosolen levereras till djuren är i det inandningsbara intervallet, ett genomsnitt av endast 4% av de aerosolpartiklar som gör det till andningszonen hos djur deposition i lungorna. Effektivare aerosolgeneratorer är tillgängliga, men den jetnebulisatorn och Wright damm foder är oöverträffade för deras förmåga att producera kontinuerliga aerosoler från olika formuleringar flytande och torra pulver, respektive.
Inandningsbar aerosol från föravskiljaren passerar in i näsan-bara exponering inandning enhet 21 som är baserad på en flödes förbi nosen designen 22. Inandnings enhet har 3 nivåer (endast två nivåer visas i figur 1) och varje grupp innehåller 10 exponerings portar för djur och aerosol provtagning. Portarna är placerade perifert runt central aerosol plenumet. Medvetna möss placeras i glashållande hållarna (6 inches lång och 1,2 tum i diameter) och andas innehållet i inandningsenheten aerosol. Mössen är inte acklimatiserad till fasthållningsanordningar 23. Tidigare erfarenheter har visat att möss tolererar fasthållningsröret av mindre än en timme varaktighet på liknande sätt, med eller utan anpassning 2.
Inandning Enheten är utformad för att leverera läkemedels aerosoler direkt till lungorna hos djuren samtidigt som man undviker exponering för operatörerna. Styrkan / toxiciteten av dessa läkemedel är vanligtvis okända och flera ingenjörssäkerhetskontrollerna används för att undvika exponering för operatörerna. Operatörerna måste alltid bära personlig skyddsutrustning (handskar, laboratorierock, respiratorer och skyddsglasögon). Den yttre plenumkammaren av inandnings enheten är under negativt tryck vid alla tidpunkter under drift, vilket möjliggör en säker borttagning av enstaka eller grupper av djur withoUT avstängning aerosolgeneratorn. Inandningsenheten är även innesluten i en sekundär inneslutning som hålles vid ett negativt tryck genom en avgasport i taket för att förhindra varje läckage av aerosol in i rummet i händelse av fel. All utströmmande luft från inandningssystemet filtreras av ett HEPA-filter före utsläpp i miljön. Näsan-bara exponeringssystemet som används i detta manuskript köptes från en enda leverantör (se kompletterande tabell of Materials).
Protocol
Mössen som användes i dessa studier var omhändertagna i enlighet med Guide för skötsel och användning av försöksdjur åttonde upplagan 24. Möss i grupp vid en associering för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) internationell ackrediterad anläggning i steril ventilerad mikroisolatorhuset på majskolv sängkläder. Vid mätning bronkokonstriktion, sövdes mössen med 100 mg / kg ip pentobarbital och anestesidjupet övervakades genom brist på tå nypa reflex och underhålls genom ip anestesi efter behov. Vid slutet av experimenten, avlivades mössen genom cervikal dislokation efter barbiturat överdos. Kontroll av eutanasi bekräftades av bristande andning. Ingen överlevnad operationer utfördes på möss. Alla forskningsprotokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Formulering och enhetsval för Generering av Pharmedels Aerosoler
OBS: Formulering och anordning urval är beroende av de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos den individuella läkemedel som skall aerosoliseras, därför generella protokoll presenteras nedan och läsaren hänvisas till de omdömen av Zeng 25 och O'Riordan 26.
- Torra pulveraerosoler
- Mikronisera läkemedel torra pulver i en kulkvarn, strålkvarn eller liknande anordning 27 och säkerställa det mikroniserade partikelstorleksfördelning (PSD) innehåller partiklar av respirabel (0,5-5 | im aerodynamisk massmediandiameter, MMAD) partikelstorlek. Blanda potenta testföreningar som kräver spädning med mikroniserad laktos.
OBS: Om det inte finns tillräckligt mikroniserat pulver för att bestämma PSD med en kaskadimpaktor, kan PSD av en liten (sub-milligram) prov av det mikroniserade pulvret mätas genom ljusspridning för att bekräfta den innehåller små / respirabla partiklar. - Generera den torra pulvret aerosol med användning av en Wright damm foder torrt pulver aerosolgenerator. Packa mikroniserade läkemedel / laktospulver in i den cylindriska behållaren med hjälp av en manuell hydraulisk press vid ungefär 1000 pounds per kvadrattum (psi) för att framställa sammanpressade kakor av pulver som används som indata av Wright dammmatnings aerosolgenerator 17.
- Skruva den cylindriska behållaren till Wright damm foder frammatning av reservoaren tills skrapbladet är i kontakt med läkemedlet kakan.
- Ansluta utloppet av Wright damm matningen till en cyklon och inloppet till en tryckluftkälla inställd på 15 L / min luftflödeshastighet (maximalt tryck 90 psi).
- Ställa in tillförselhastigheten kontrollen till 0,7 varv per minut (rpm) och slå på Wright dammmatnings aerosolgenerator.
OBS: 0,7 rpm motsvarar en testartikel kaka matningshastighet av 1 g / h vid användning av den lilla Wright dammmatnings cylindrisk reservoar. Wright damm foder skrapar ett tunt skikt av kompakterat powder av testartikeln kakan genom att vrida på behållaren. Luft bär dammet ut ur Wright damm foder genom ett ljudmunstycke för de-agglomerering, och in i en cyklon för att avlägsna icke-inandningsbara partiklar och agglomerat. - Ansluta utloppet från cyklonen till den centrala aerosol plenum inandning enheten (Figur 1).
OBS: Föreningar kan komprimeras 300-1500 psi i reservoaren av Wright dammfoder. Objektet är att komprimera partiklarna tillräckligt så att de kommer att kvarhållas i behållaren när den är inverterad, men inte så mycket att den Wright damm foder inte kan skrapa bort ett tunt lager för åter aerosolbildning. Man måste komma ihåg att mätaren på manuell hydraulisk press läser i pounds och kolven på den lilla damm matningsbehållaren har en yta på ca 0,25 kvadrattum. Därför, är ekvivalent med 1000 psi 250 pounds av kompressionskraft på 0,25 kvadrattum.
- Mikronisera läkemedel torra pulver i en kulkvarn, strålkvarn eller liknande anordning 27 och säkerställa det mikroniserade partikelstorleksfördelning (PSD) innehåller partiklar av respirabel (0,5-5 | im aerodynamisk massmediandiameter, MMAD) partikelstorlek. Blanda potenta testföreningar som kräver spädning med mikroniserad laktos.
- Nebuliserade vätskeaerosoler
- Lösa läkemedlet i 100 ml av vatten eller fysiologisk saltlösning.
- Ladda en 100 ml spruta med läkemedelslösningen och placera sprutan i sprutpumpen med en flödeshastighet inställd på 1 ml / min.
- Ansluta sprutpumpen till jetnebulisatorn och genombubblas luft från matningsledningen som leder till nebulisatorn.
- Ansluter den trycksatta luftkällan till jetnebulisatorn och ställa luftflödesmätaren till 10 L / min.
- För in jetnebulisatorn i föravskiljaren. Föravskiljaren ansluter nebulisatorn till den centrala aerosol plenum inandning enheten (Figur 1).
OBS! Många läkemedelsföreningar har begränsad vattenlöslighet och är bättre formuleras som torra pulveraerosoler. Om en stabil suspension kan framställas av mikroniserad (MMAD <5 pM) förening, kan den användas med jetnebulisatorn. Försiktighet bör användas som suspensionen kan täppa nebulisatorn. Nebulisatorn foder koncentrationer från 1 mg / ml för potenta föreningar (såsom bronkdilaterandeipratropium) till 40 mg / ml suspensioner (för mindre potenta föreningar såsom salbutamolsulfat) har använts. Sprutpumpen matningshastigheten är satt till 1 ml / min för en praktisk orsak; för att tillåta aerosolen koncentrationen jämviktsperioden och 45-min-lång exponering slutföras utan behovet att ladda om sprutan.
2. Aerosol Exposure Experiment Setup
- Mäta läkemedelskoncentrationen (genom att samla aerosol på ett absolut filter) och partikelstorleksfördelning (genom att samla aerosol med användning av en kaskadimpactor) av aerosolen som kommer in i inandningsenheten efter pre-separator / cyklon. Använd dessa parametrar tillsammans med djurets minut ventilation, kroppsvikt och exponeringstiden för att uppskatta dos av läkemedlet deponeras i lungorna.
- Väg den absoluta filter och registrera filtervikten. Placera filtret i filterhållaren och montera filterhållaren. Ansluta inloppet av den absoluta filterhållarentill en central aerosol plenumprovöppning och utloppet till en vakuumkälla inställd att sampla aerosolen vid en flödeshastighet av 1 l / min under hela experimentet.
OBS: Massan av läkemedlet på filtret efter provtagning för 45 min kan vara i sub-mikrogram intervall och / eller blandas med laktos, NaCl-salt, eller annat fordon. En mikrovåg som läser till 0,1 mikrogram är nödvändig. Att få en korrekt läkemedelsvikten avsatt på filtret, måste filtret ekvilibrerad och vägdes i en fuktighetsreglerad miljö. Vikten av läkemedel på filtren kan endast användas i beräkning dosen om det inte finns något fordon i formuleringen eller fordonet är vatten. När det finns ett fordon i det andra än vatten formulering, ger vikten av substansen på filtret endast en uppskattad utgångspunkt för ytterligare analys av läkemedelsinnehåll genom högupplösande vätskekromatografi (HPLC). - Väga och notera vikten av de 7 kaskadimpaktor stegets filter och en slutlig "svans piece"; filtrera. Placera ett filter på var och en av de sju stegen i kaskadkroppen och montera Mercer kaskadimpaktor 28. Ansluta inloppet till kaskadimpaktor till en central aerosol plenumprovöppning och utloppet till en vakuumkälla inställd att sampla aerosolen vid flödeshastigheten kaskadimpaktorn kalibreras vid (vanligen 0,5 eller 1 L / min) under varaktigheten av experimentera.
- Övervaka innehållet aerosol av inandningsenheten med aerosol monitorn realtid (se tabell av Material och reagens) för att bekräfta de aerosolbehållare som är funktionella och framställning av en stabil aerosol under hela experimentet. Ansluta inloppet till aerosol monitorn realtid till en central aerosol plenumprovöppning och utloppet till en vakuumkälla inställd att sampla aerosolen vid en flödeshastighet av 1 l / min under hela experimentet.
OBS! Signalen från realtids aerosol monitor redovisas i ug / L, men är kalibrerad för vägdamm och måste kalibrerasför varje individuellt läkemedel aerosol för erhållande av korrekta koncentrationsvärden aerosol. behövs inte kalibrering för att använda bildskärmen för att bekräfta närvaron eller frånvaron och temporal stabilitet av aerosol koncentration. - Ställa processtyrningsparametrar (luftflöde, vakuum, tryck, aerosolgeneratorn effekt) till de värden som krävs som beror på det antal djur som ska anslutas till inandningsenheten. De inandning enhets och aerosolgeneratorer kontinuerligt kontrollerad / övervakas av ett datoriserat processtyrning / datainsamlingssystem (DACO) som levereras av tillverkaren (se tabell av Material och reagenser). Luftflödeshastigheten in i inandningsenheten bör vara minimalt ca 2 gånger den totala minutventilation hastigheten för alla djur i inandningsenheten i syfte att undvika en ackumulering av CO2.
- Väg den absoluta filter och registrera filtervikten. Placera filtret i filterhållaren och montera filterhållaren. Ansluta inloppet av den absoluta filterhållarentill en central aerosol plenumprovöppning och utloppet till en vakuumkälla inställd att sampla aerosolen vid en flödeshastighet av 1 l / min under hela experimentet.
- Belastnings möss i näsa-bara hämmarna före exponering för aerosol i näsan-endast inandning enhet. Också ladda fasthållningsspänningskontrolldjur itill hämmarna att andas rumsluft.
OBS: En dos / svarsexperiment består av flera grupper av möss som exponerats för aerosol för olika lång tid. Exponeringstid används för att styra den dos varje grupp mottar under en dos / svarsexperiment.- Vinkla hållande röret upp mot taket samtidigt som man försöker ladda djuren, eftersom de tenderar att köra uppåt försöker fly. Pekar rören ner medan laddning kommer att uppmuntra vända och fly ut på baksidan av röret. Säkerställa musens nos är orienterad i den spetsiga änden av röret och fixera varierbart anbringningsbar kolven i den bakre änden av restrainer.
OBS: Kolven är utformad att tillåta svansen på musen för att skjuta ut från hållaren, vilket gör att musen för att reglera sin kroppstemperatur medan i restrainer. - Ställ kolven för att låta mössen att rotera, men inte vända huvudet till svans; att säkerställa aerosolen inhaleras.
- Kontinuerligt övervakamöss medan i de återhållande rör. Efter positionering av kolven, liten möss (<20 gram) ofta försöka vända huvud till svans i rören och anta en U-position där de har svårt att andas. Denna vridningsuppförandet är mest utbrett i de första 5 minuterna av återhållsamhet, efter att mössen sällan försöka vända huvud till svans.
- Vinkla hållande röret upp mot taket samtidigt som man försöker ladda djuren, eftersom de tenderar att köra uppåt försöker fly. Pekar rören ner medan laddning kommer att uppmuntra vända och fly ut på baksidan av röret. Säkerställa musens nos är orienterad i den spetsiga änden av röret och fixera varierbart anbringningsbar kolven i den bakre änden av restrainer.
3. Aerosol Delivery
- Infoga proppar att plugga avgivningsportarna av inandningsenheten och aktivera aerosolgeneratorn, tryckluft flödesregulator, och inandning enheten vakuumpump från inom processtyrningsprogram.
- När avläsningarna från aerosolen monitorn realtid visa koncentrationen aerosol har att komma till jämvikt (~ 30 min, fig 2), börja ta bort proppar och insättning av näsa-bara fasthållande rör innehållande möss in i inandningsenheten. Upprepa tills alla möss som skall exponeras för läkemedel är anslutna till inandning enheten.
OBS! Iexemplet experimentet, är det totala luftflödet som matas till inandning enheten via aerosolgeneratorn och utspädningsluften inställd att mata en 0,5 L / min flödeshastighet till var och en av djurexponerings portar vid användning. Till exempel, är ett 15 L / min totala luftflödet tillräckligt för att leverera alla 30 portar i inandningsenheten. Detta är mycket mer luftflöde än vad som krävs av minutventilationen av mössen, men en större luftflödet är nödvändigt att tillföra den energi (tryckfallet över aerosolgeneratorn) för att framställa (finfördela / de-agglomerat) aerosolen. - När alla djur laddas in i exponeringsenheten, slå på provtagningspumparna vakuum som är anslutna till det absoluta filtret och kaskadimpaktor med användning av förfarandet kontrollmjukvaran.
- När alla exponeringar är klara, stäng av aerosolgeneratorn och ta bort återstående möss från inandning enheten.
OBS: Djur kommer att hanteras i en förändring station huva eller av personal som bär en ansiktsmask. Efter avslutningen av aerosoltillförsel, mössen är removed från rören och rören sanerad efter varje användning.
4. Beräkning av deponerade dosen
- Att beräkna den deponerade dosen 29 i ^ g / kg (ekvation 1) multiplicera koncentrationen av läkemedlet i aerosol (| ig / l) x minutventilationen (L / min) x exponeringsduration (min) x inandningsbar fraktion x lungdeponeringsfraktionen och dividera med kroppsvikten (kg).
- Beräkna aerosol koncentration (| ig / l) genom att dividera massan av läkemedlet på det absoluta filtret (pg) av luftflödeshastigheten genom filtret (L / min) multiplicerad med samplingstiden (min). Uppskatta musens minuters ventilation med en allometriska ekvation baserad på kroppsvikt 30. Den inhalerbara fraktionen är en som aerosolen fick passera genom en pre-separator för att avlägsna icke-inandningsbara partiklar, och lungdeponeringsfraktionen bestäms från läkemedelsaerosolen MMAD (Figur 3) med användning avexperimentella kalibreringskurvor från monodispersa aerosoler (figur 4) 31.
Representative Results
Det bronkdilaterande ipratropiumbromid löstes i 0,9% normal koksaltlösning vid en koncentration av 1 mg / ml. En 100 ml spruta fylldes med ipratropium lösningsformuleringen och sprutan sattes in i en sprutpump inställd att mata jetnebulisator (Figur 1) vid en flödeshastighet av 1 ml / min. Aktivering av styrsystemet för inhalering enheten initierar en 10 L / min luftflöde till jetnebulisatorn, 5 l / min utspädningsluftens flöde till utspädningskammaren, och 15,5 l / min av vakuum luftflöde för att dra läkemedelsaerosolen ur inandning enhet när den passerar näsan av mössen. Sprutpumpen och realtids aerosol övervaka provpump aktiverades. Tjugofyra möss sattes in i inandningsenheten efter aerosol monitorn realtid bekräftar aerosol koncentrationen i inandningsenheten hade kommit till jämvikt (15-30 min, figur 2). Provet pumpar för absolutfilter (1 L / min) och kaskadimpaktor (0,5 L / min) sattes på en gång alla möss var anslutna till inandningsenheten. Den första gruppen av åtta möss avlägsnades från inandning enheten efter 5 min, den andra gruppen efter 15 minuter, och den tredje gruppen efter 45 min. Bronkokonstriktion 32 mättes som ökningen i andningsorganen motstånd (Rrs) till en enda nebuliserad dos av metakolin (30 mg / ml) tillförd 2 h efter dosering ipratropium hjälp av respirator för gnagare 33. Den procentuella ökningen i Rrs för varje djur, beräknad som den maximala Rrs över 3-min intervall efter nebuliserad metakolin (Rmax) minus det Rrs värdet för baslinjemätning före metakolin (Rbase) dividerat med Rbase (% ökning av Rrs = (Rmax -Rbase) / Rbase), användes för att kvantifiera bronkokonstriktion.
Aerosolen avsätts på kaskadimpaktor filter och absolut filter under 45 min av aerosol exponering löstes i50% acetonitril och massan av ipratropium kvantifierades med HPLC (tabell 1). MMAD x / GSD av ipratropium aerosol beräknades vara 1,7 x / 1,5 | im (fig 3) och en deponeringsfraktionen (DF) av 0,037 för möss användes för en aerosol med en MMAD av 1,7 | j, m (fig 4). Den inhalerbara fraktionen (IF) var en som aerosolen fick passera genom en pre-separator för att avlägsna icke-inandningsbara partiklar. Medelkoncentrationen av ipratropium i aerosolen (0,5 | ig / l) beräknades från massan av ipratropium på absolutfilter (22 ^ g) dividerat med flödeshastigheten av luft dras genom filtret (1 L / min) multiplicerad med samplingstiden (45 min). Den genomsnittliga kroppsvikten hos möss var 0,019 kg och deras förutsagda minutventilation beräknades som 0,021 l / min. Med användning av ekvation 1, de deponerade doserna för 5, 15, och 45 min exponerings grupper var 0,1, 0,3, och 0,9 | ig / kg; respektive.
= "1"> Ipratropium inhiberade nebuliserad metakolin-inducerad bronkokonstriktion hos 8 veckor gamla C57Bl / 6-möss. Metakolin ökade Rrs inom sekunder av nebuliserad administrering (Figur 5, övre fältet). De Rrs i kontrollgruppen (som exponeras för rumsluft i stället för ipratropium aerosol) ökade från ett baslinjevärde av 0,62 ± 0,03 cm H2O * s / ml till ett maximalt värde av 1,66 ± 0,12 cm H2O * s / ml, vilket motsvarar en 168 ± 9% ökning i Rrs, 70 s efter metakolin aerosoladministrering. Ökningen i andningsorganen motstånd procent inhiberades på ett dosberoende sätt genom inhalerade doser av ipratropium. Ökningen i Rrs procent hämmades av 51 ± 9%, 79 ± 14%, och 89 ± 2% (figur 5, nedre panelen) vid inhalerade deponerade doser av ipratropium av 0,1, 0,3, och 0,9 ug / kg, respektive.
g"/>
Figur 1: Inandning enhet med torrt pulver aerosolgenerator bifogas. Nebulisatorn användes för att generera aerosol från flytande formuleringar visas till höger. 1) Wright damm foder, 2) cyklon, 3) sprutpump, 4) jetnebulisator införd i föravskiljare, 5) utspädningsluftblandare. Vid leverans av nebuliserade aerosoler, är damm foder och cyklon ersättas med sprutpumpen, jetnebulisator / föravskiljare, och utspädningsluftblandare. Den förstorade vyn (modifierad från Oldham 21) visar aerosolbehållaren flödesvägen vid andningszonen runt djurets näsa som är skapad genom att sätta in den återhållande röret i inandningsenheten. Aerosolen fyller den centrala aerosol (grå) plenum inandningsenheten, strömmar ut till djurets näsa där den dras tillbaka av ett lätt vakuum i den yttre (vit) plenumet och in i avfallsinsamlings filter (ej visat). Pllätthet klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Realtids aerosol monitor mätningar bekräftar aerosol koncentrationen i inandningsenheten når jämvikt ~ 30 min efter att vrida på aerosolgeneratorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ipratropium massa uppsamlad på varje steg av kaskadimpactor (blå stapeldiagram) övertäckt med kurvanpassning (svart kurva) används för att beräkna MMAD och GSD av aerosolen partikelstorleksfördelning. Snälla duKlicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Avlagring fraktion för muslungor som en funktion av MMAD för aerosoler som levereras av näsa-endast inandning (som modifierad från Hsieh 31). För partikelstorlekar mindre än 0,5 | im mest av aerosolen utandas och inte avsättas i lungorna (som cigarettrök). För partikelstorlekar större än 5 fim, mest av aerosolen filtreras ut genom näsan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Den snabba ökningen av andningsorganen resistens inducerad av nebuliserad metakolin administerött till möss blockeras av ipratropium levereras av näsa-endast inandning till möss (n = 8 per grupp, övre panelen). Ipratropium inhiberade metakolin inducerad ökning av andningsorganen motstånd med ett ED 50 av 0,1 ug / kg deponerad dos (* p <0,05 mot kontroll, nedre panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kaskadimpaktor data som används för att beräkna MMAD och GSD | ||
| Stage Filter | Ipratropium på filter med HPLC (mg) | Stage Cut Diameter (mm) |
| 1 | 0,002 | 6 |
| 2 | 0,19 | 4,5 |
| 3 | 1,43 | 2,5 |
| 4 | 2,55 | 1,5 |
| 5 | 2,95 | 1,2 |
| 6 | 1,03 | 0,7 |
| 7 | 0,37 | 0,5 |
Tabell 1: Cascade impactor data som används för att beräkna MMAD och GSD
Discussion
En näsa-bara inhalation systemet och dess drift för att leverera farmaceutiska aerosoler till lungorna hos gnagare har beskrivits. Hålla fast djur i näsa-bara innehavare är en vanligt använd metod för att exponera djuren för luftburet material. Ett experiment utfördes som visar det antikolinergiska bronkdilaterare ipratropiumbromid 34 kan potent omvänd metakolin-inducerad bronkokonstriktion vid leverans genom näsan-endast inandning till möss med ett ED 50 av 0,1 pg / kg deponerade dosen. En ökning som är större än 10-faldigt i effektiv dos av ipratropium krävdes för bronkodilatation efter intratrakeal leverans (ED 50 intratrakeal = 1,3 | ig / kg, data visas ej) leverans. Detta beror på att den icke-homogena depositionsmönstret av läkemedel i lungorna som produceras av intratrakeal dosering 3, 5, 10. 10-faldigt och större effektiv dosskillnader mellan inhalerade och intratrakeala doseringstekniker för andra läkemedel har tidigare observerats av andra 4.
Den icke-homogena depositionsmönstret av läkemedel i lungorna som produceras av intratrakeal dosering saktar också läkemedelsabsorption genom lungan 35, minskar den hastighet med vilken läkemedlet kommer in i systemcirkulationen och minskar chanserna att se systemiska biverkningar. Därför, för att optimera säkerhets- / effekt (terapeutiskt index) 36 av nya inhalerade läkemedel, bör näsa-bara inhalation leverans användas. Intratrakeal avsättning kommer att ge en felaktig uppskattning av TI genom att generera felaktigt höga effektiva doser i lungan och låga doser till den systemiska cirkulationen.
Som nya läkemedel som levereras av den inhalerade vägen utvecklas är det viktigt att på lämpligt sätt översätta effektiva läkemedelsdosen från prekliniska effektstudier för att förutsäga en efficacious dosen till människa för kliniska prövningar. Den ökända död Tusko elefanten 37 vanligen citeras i litteraturen för att påminna oss att använda allometriska skalning för att förutsäga mellan arter läkemedelsdoser och att mellan arter läkemedelsdoser bör inte linjärt extrapoleras på basis av en enkel jämförelse av kroppsmassor. Är det vanligt att använda en allometriska arbetssätt med allometriska exponent b från 0,67 för att förutsäga humana läkemedelsdoser från preklinisk effektivitetsstudier 38. Med hjälp av musen inhalerad ED 90 av 0,9 | ig / kg för ipratropium, en allometriska exponent av 0,67, en mus kroppsmassa av 0,03 kg, och en human kroppsmassa på 60 kg; en uppskattad human ED 90 av 0,07 ug / kg ((0,9 * (0,03 / 60 ) (1-0.67) = 0,07) kan beräknas som den förutsagda humana deponerade dosen från våra musdata. Detta förutsagda värde är jämförbart med det faktiska humana efficacious deponerad dos av 0,26 | j, g / kg, vilket kan beräknas ur den levererade göraSO om 40 | j, g 39 dividerat med den mänskliga kroppsmassa på 60 kg multiplicerat med en human oral inhalation pulmonell deponering fraktion 16 av 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). En uppskattning av den effektiva humana inhalerad deponerade dosen bidrar också till att planera de levererade doserna som användes vid inandnings toxikologiska studier som krävs för kliniska prövningar 40.
Den specialutrustning och stor mängd av testförening (gramkvantiteter) som krävs för näsa-bara inhaleras läkemedelstillförsel kan vara betydande begränsningar vid utvecklingen näsan-bara inhalationsteknik. En kalibreringskörning utan djur som finns är nödvändigt om en specifik dos krävs för en (vanligtvis toxikologi och inte en effektivitet dos / respons) studie, och denna kalibreringskörning kommer att kräva mer läkemedel för att vara tillgängliga. Denna kalibreringskörning är nödvändig eftersom de fysikokemiska egenskaperna av varje läkemedel / formulering kan variera tillräckligt för att kraftigt påverka den avsatta dosenav läkemedel i lungorna. Optimering av luft- och läkemedelsmatningshastigheterna till aerosolgeneratorn under kalibreringskörning krävs för att uppnå en aerosol partikelstorlek och koncentration för den specifika dos som erfordras. Medan aerosolgeneratorn luft och läkemedelsmatningshastigheter som föreslås i metoderna är en rimlig utgångspunkt, det finns potential att en icke-respirabel (partikelstorlek> 5 mm) aerosol för en specifik läkemedelsformulering kommer att genereras. I prekliniska stadiet, finns det ofta inte tillräckligt läkemedel tillgängliga för att göra en kalibreringsdrivet och det är omöjligt att veta på förhand vilka doser (om någon) får in i lungorna. Också är statisk elektricitet produceras under aerosolproduktion processen och kan påverka tiden som krävs för aerosolen koncentrationen till jämvikt. Det är viktigt att korrekt jorda utrustning för att minimera statisk laddning. Ett annat alternativ för att minimera statisk elektricitet är att tillsätta fuktighet till den luft som tillinandningsenheten, för att öka ledningsförmågan ochavleda elektrostatiska laddningar på partiklarna 25. Befuktning av luft som tillförs aerosolgeneratorn krävs inte för djur komfort under korta (<1 h) doseringssessioner men bör övervägas om längre doseringstider används.
Läkemedel kan levereras till lungorna hos djur genom passiv näsa-bara inhalation eller direkta intratrakeala administreringsmetoder som kringgår nasofaryngeal avsättning. Nose-only inhalation leverans är vanligen används inom området för inandning toxikologi 41 men är sparsamt används tidigt i läkemedelsutvecklingsprocessen. En tvärvetenskaplig forskargrupp behövs för att genomföra näsa endast inhalationsstudier på grund av: behovet av stora mängder läkemedel, specialkunskaper som krävs för att formulera, skapa och karakterisera aerosoler; använda avancerade utrustning, och mäta läkemedlets effektivitet i djurmodeller av luftvägssjukdom. Leverans tekniker som beskrivs häri används för att utveckla small molekyl inhalerade läkemedel men i framtiden kan tillämpas för att utveckla inhalerade bioläkemedel 42, 43. Förhoppningsvis de förfaranden och tips dokumenteras i detta manuskript kommer att underlätta nya prekliniska läkemedelsforskning och toxikologiska forskare att förvärva de kunskaper som krävs för att leverera läkemedel till gnagare genom aerosol inhalation.
Disclosures
Alla författare anställd av Amgen. Publiceringsersättningar för denna video-artikeln betalas av Amgen.
Acknowledgments
Vi erkänner: Dr Thomas Budiman på TSE Systems GmbH för sin tekniska expertis och utrustning anpassning. John Fry (Battelle Inc.) och Dr Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) för deras hjälp diskussioner. Tian Wu, Sam Mboggo april Miller och Sean Davis (Amgen) för att få hjälp med experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
| DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
| MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
| Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
| Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
| Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
| Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
| Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
| Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
| Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
| flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |
References
- Chapman, R. W., et al. Pharmacology of a potent and selective inhibitor of PDE4 for inhaled administration. Eur J Pharmacol. 643 (2-3), 274-281 (2010).
- Phillips, J. E., et al. Btk inhibitor RN983 delivered by dry powder nose-only aerosol inhalation inhibits bronchoconstriction and pulmonary inflammation in the ovalbumin allergic mouse model of asthma. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 29 (3), 233-241 (2016).
- Zecchi, R., et al. Impact of drug administration route on drug delivery and distribution into the lung: an imaging mass spectrometry approach. Eur J Mass Spectrom. 19 (6), 475-482 (2013).
- Cooper, A. E., Ferguson, D., Grime, K. Optimisation of DMPK by the inhaled route: challenges and approaches. Curr Drug Metab. 13 (4), 457-473 (2012).
- Leong, B. K., Coombs, J. K., Sabaitis, C. P., Rop, D. A., Aaron, C. S. Quantitative morphometric analysis of pulmonary deposition of aerosol particles inhaled via intratracheal nebulization, intratracheal instillation or nose-only inhalation in rats. J Appl Toxicol. 18 (2), 149-160 (1998).
- Pauluhn, J. Overview of inhalation exposure techniques: strengths and weaknesses. Exp Toxicol Pathol. 57 Suppl 1, 111-128 (2005).
- Wong, B. A. Inhalation exposure systems: design, methods and operation. Toxicol Pathol. 35 (1), 3-14 (2007).
- Phalen, R. F. Inhalation Studies Foundations and Techniques. , 2nd, Informa Healthcare. (2009).
- Siddiqui, S., et al. Pulmonary eosinophilia correlates with allergen deposition to the lower respiratory tract in a mouse model of asthma. Clin Exp Allergy. 38 (8), 1381-1390 (2008).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur J Pharm Biopharm. 61 (3), 214-218 (2005).
- Morello, M., et al. Dry-powder pulmonary insufflation in the mouse for application to vaccine or drug studies. Tuberculosis (Edinb). 89 (5), 371-377 (2009).
- Guillon, A., et al. Pulmonary delivery of dry powders to rats: tolerability limits of an intra-tracheal administration model. Int J Pharm. 434 (1-2), 481-487 (2012).
- Pauluhn, J., Mohr, U. Inhalation studies in laboratory animals--current concepts and alternatives. Toxicol Pathol. 28 (5), 734-753 (2000).
- Snipes, M. B., McClellan, R. O., Mauderly, J. L., Wolff, R. K. Retention patterns for inhaled particles in the lung: Comparisons between laboratory animals and humans for chronic exposures. Health Phys. 57 (Sup 1), 69-78 (1989).
- Wright, B. M. A new dust-feed mechanism. J Sci Inst. 27, 12-15 (1950).
- Scheuch, G., Siekmeier, R. Novel approaches to enhance pulmonary delivery of proteins and peptides. J Physiol Pharmacol. 58 Suppl 5 (Pt 2), 615-625 (2007).
- Phillips, J. E., Ji, L., Rivelli, M. A., Chapman, R. W., Corboz, M. R. Three-dimensional analysis of rodent paranasal sinus cavities from X-ray computed tomography (CT) scans. Can J Vet Res. 73 (3), 205-211 (2009).
- Wolff, R. K. Toxicology studies for inhaled and nasal delivery. Mol Pharm. , (2015).
- Oldham, M. J., Phalen, R. F., Budiman, T. Comparison of predicted and experimentally measured aerosol deposition efficiency in BALB/c mice in a new nose-only exposure system. Aerosol Sci Technol. 43 (10), 970-977 (2009).
- Cannon, W. C., Blanton, E. F., McDonald, K. E. The flow-past chamber: an improved nose-only exposure system for rodents. Am Ind Hyg Assoc J. 44 (12), 923-928 (1983).
- Narciso, S. P., Nadziejko, E., Chen, L. C., Gordon, T., Nadziejko, C. Adaptation to stress induced by restraining rats and mice in nose-only inhalation holders. Inhal Toxicol. 15 (11), 1133-1143 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Zeng, X., Martin, G., Marriott, C. Particulate Interactions in Dry Powder Formulations for Inhalation. , Taylor & Francis. (2001).
- O'Riordan, T. G. Formulations and nebulizer performance. Respir Care. 47 (11), 1305-1313 (2002).
- Pilcer, G., Amighi, K. Formulation strategy and use of excipients in pulmonary drug delivery. Int J Pharm. 392 (1-2), 1-19 (2010).
- Mercer, T. T., Tillery, M. I., Newton, G. J. A multi-stage, low flow rate cascade impactor. J. Aerosol Sci. 1 (1), 9-15 (1970).
- Forbes, B., et al. Challenges in inhaled product development and opportunities for open innovation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (1-2), 69-87 (2011).
- Alexander, D. J., et al. Association of inhalation toxicologists (AIT) working party recommendation for standard delivered dose calculation and expression in non-clinical aerosol inhalation toxicology studies with pharmaceuticals. Inhal Toxicol. 20 (13), 1179-1189 (2008).
- Hsieh, T. H., Yu, C. P., Oberdorster, G. Deposition and clearance models of Ni compounds in the mouse lung and comparisons with the rat models. Aerosol Sci Technol. 31 (5), 358-372 (1999).
- Phillips, J. E., et al. House dust mite models: will they translate clinically as a superior model of asthma. J Allergy Clin Immunol. 132 (1), 242-244 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. JoVE. (75), e50172 (2013).
- Storms, W. W., DoPico, G. A., Reed, C. E. Aerosol Sch 1000. An anticholinergic bronchodilator. Am Rev Respir Dis. 111 (4), 419-422 (1975).
- Schanker, L. S., Mitchell, E. W., Brown, R. A. Jr Species comparison of drug absorption from the lung after aerosol inhalation or intratracheal injection. Drug Metab Dispos. 14 (1), 79-88 (1986).
- Biju, P., et al. Steroidal C-21 mercapto derivatives as dissociated steroids: discovery of an inhaled dissociated steroid. Bioorg Med Chem Lett. 21 (21), 6343-6347 (2011).
- West, L. J., Pierce, C. M., Thomas, W. D. Lysergic acid diethylamide: Its effects on a male asiatic elephant. Science. 138 (3545), 1100-1103 (1962).
- Boxenbaum, H., DiLea, C. First-time-in-human dose selection: allometric thoughts and perspectives. J Clin Pharmacol. 35 (10), 957-966 (1995).
- Spina, D. Current and novel bronchodilators in respiratory disease. Curr Opin Pulm Med. 20 (1), 73-86 (2014).
- Degeorge, J. J., et al. Considerations for toxicology studies of respiratory drug products. Regul.Toxicol.Pharmacol. 25 (2), 189-193 (1997).
- McClellan, R. O., Henderson, R. F. Concepts in Inhalation Toxicology. , Taylor & Francis Group. (1989).
- Patton, J. S., et al. The particle has landed--characterizing the fate of inhaled pharmaceuticals. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 23 Suppl 2, S71-S87 (2010).
- Depreter, F., Pilcer, G., Amighi, K. Inhaled proteins: Challenges and perspectives. Int J Pharm. 447 (1-2), 251-280 (2013).
