Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatiseret Sammentrækning Analyse af humant Engineered Heart Væv til Cardiac Drug Safety Screening

Published: April 15, 2017 doi: 10.3791/55461
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

Summary

Her viser vi genereringen af ​​human manipuleret hjertevæv fra inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) afledt cardiomyocytter. Vi præsenterer en metode til at analysere kontraktionskraft og eksemplarisk ændring af sammentrækning mønster af hERG kanal inhibitor E-4031. Denne metode viser høj grad af robusthed og egnethed til hjerte- lægemiddelscreening.

Abstract

Hjertevæv engineering beskriver teknikker til at udgøre tredimensionelle kraftgenererende manipuleret væv. Med henblik på gennemførelsen af ​​disse procedurer i grundforskning og præklinisk lægemiddeludvikling, er det vigtigt at udvikle protokoller for automatiseret generering og analyse under standardiserede forhold. Her præsenteres en teknik til at generere manipuleret hjertevæv (EHT) fra cardiomyocytter af forskellige arter (rotte, mus, menneske). Teknikken beror på konstruktionen af ​​en fibrin-gel indeholdende dissocierede cardiomyocytter mellem elastisk polydimethylsiloxan (PDMS) stillinger i en 24-brønds format. Tre-dimensionelle, kraftgenererende EHTs udgør inden for to uger efter støbning. Denne procedure giver mulighed for generering af flere hundrede EHTs om ugen og er teknisk kun begrænset af tilgængeligheden af cardiomyocytter (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluering af auxotonic muskelsammentrækninger udføres i en modificeret rugekammeret med en mechanical interlock i 24-brønds plader og et kamera placeret på toppen af ​​dette kammer. En software styrer et kamera flyttede et XYZ akse system til hver EHT. EHT kontraktioner detekteres ved en automatiseret figur anerkendelse algoritme, og kraft er beregnet baseret på afkortning af EHT og det elastiske tilbøjelighed og geometrien af ​​PDMS stillinger. Denne procedure giver mulighed for automatiseret analyse af høje antal af EHT under standardiserede og sterile betingelser. Den pålidelig detektering af narkotika effekter på cardiomyocyte sammentrækning er afgørende for hjerte-lægemiddeludvikling og sikkerhed farmakologi. Vi viser, med eksemplet med hERG kanal inhibitor E-4031, at det humane EHT systemet replikater drug svar på sammentrækning kinetik det menneskelige hjerte, hvilket indikerer, at det er et lovende redskab til hjerte- lægemiddelsikkerhed screening.

Introduction

Hjertesygdomme bivirkninger såsom narkotika-induceret langt QT-syndrom har ført til tilbagekøb fra markedet i løbet af de seneste år. Statistikker viser, at omkring 45% af alle udbetalinger skyldes uønskede virkninger på det kardiovaskulære system 1. Dette stof fiasko efter den dyre udviklingsmæssige proces og godkendelse er det værst tænkelige scenario for farmaceutiske virksomheder. Forsknings- og udviklingsafdelinger derfor fokus på at påvisning af sådanne uønskede kardiovaskulære virkninger tidligt. Af økonomiske og etiske overvejelser, bestræbelser på at reducere dyreforsøg og erstatte dem med nye in vitro screening-assays er i gang.

Et sæt af etablerede analyser indgår i USA Food and Drug Administration (FDA) og Det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA) retningslinjer for præklinisk evaluering af proarytmiske lægemiddelvirkninger 2. Teknologien til omprogrammering somatiske celler efterfulgt af differentiering afhumane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) boostet dette forskningsområde 3. Det giver nu mulighed for at screene nye lægemiddelkandidater på humane cardiomyocytter in vitro og undgår problemer med mellem arterne forskelle. Seneste hjertedifferentiering protokoller 4, 5 tilvejebringer ubegrænset forsyning af cardiomyocytter uden etiske bekymring. Imidlertid målingen af kontraktile kraft, den vigtigste og bedst karakteriserede in vivo parameter af cardiomyocytter, er ikke veletableret. Dette er relateret til den relative umodenhed 6 af menneskelige inducerede pluripotente stamcelleafledte cardiomyocytter (hiPSC-CM) sammenlignet med den voksne cardiomyocyte. En mulig fremføring er at konstruere 3-dimensional hjertevæv fra enkeltceller 7 (manipuleret hjertevævsprøver, EHT). EHT Protokollen er baseret på indlejring enkelt murine eller humane cardiomyocytter 8 sup>, 9, 10 i fibrin hydrogel mellem to fleksible polydimethylsiloxan (PDMS) stillinger 11 i 24-brønds format. Inden for få dage de cardiomyocytter begynder at trække sig sammen spontant som enkelte celler og begynde at danne mobilnetværk. Efter 7-10 dage, makroskopiske sammentrækninger af hele væv er synlige. Under denne proces den ekstracellulære matrix er ombygget, hvilket fører til et fald i diameter og længde. Afkortningen af ​​EHT resulterer i bøjning af PDMS skrive selv under hvile, udsættelse cardiomyocytter i udviklingslandene EHT til kontinuerlig belastning. EHTs fortsat udføre auxotonic muskelsammentrækninger over flere uger. Humane EHTs viser reaktioner på fysiologisk og farmakologisk stimulering indikerer deres egnethed til lægemiddelscreening og sygdom modellering 7.

I dette manuskript præsenterer vi en robust og let protokol for de Generatipå menneskers EHT, og den automatiserede kontraktilitet analyse af koncentrationsafhængige ændringer af sammentrækning mønster i nærvær af hERG kanal inhibitorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: De følgende trin beskriver en cellekultur protokol. Zoom udføre under sterile betingelser og anvende forvarmet medier.

1. Cardiac Differentiering af hiPSC

  1. Dyrk den hiPSC
    1. Coat plader med 6 brønde (1 ml / brønd) eller T75-kolber (7 ml / kolbe) med reduceret vækstfaktor basalmembranmatrix (fx geltrex, 1: 200; se tabel af materialer) fortyndet i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) til 30 minutter ved 37 ° C. Forberede FTDA stof 12 ved blanding af basisk DMEM / F-12 medium med 2 mM L-glutamin, 0,5% penicillin / streptomycin, 5 mg / l transferrin, 5 ug / l selen, 0,1% humant serumalbumin, 1x lipid-mix, 5 mg / l insulin, 50 nM dorsomorphin, 2,5 ng / ml activin A, 0,5 ng / ml human TGFß1 og 30 ng / ml FGF2.
    2. Frø hiPSC (~ 3 x 10 5/10 cm) i FTDA medium og dyrkning ved 37 ° C, 5% CO2, 21% O2 med daglig udskiftning af mediet (Figur 1A). Ved 80% sammenløb, passage (1: 2-1: 6) med ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA; 0,5 mM; inkubationstid ~ 4 min).
  2. Dannelse af embryoide legemer (EB)
    1. Dyrk hiPSC i T75-kolber til høj tæthed.
      1. Vask kolber med sammenflydende cellerne to gange med phosphatbufret saltvand uden calcium og magnesium (PBS) og inkuberes i 0,5 mM EDTA i ~ 10 min. Sørg for, at cellerne ikke løsnes fra bunden af ​​kolben.
      2. Fjerne EDTA med glaspipette skylles off celler med 10 ml PBS, tap kolber ved bænken at frigøre celler.
        BEMÆRK: Brug celle skraber evt.
      3. Indsamle celler i 50 ml konisk rør, tilsæt ¼ volumen (fx 10 ml RMPI til 40 ml cellesuspension) RPMI 1640-medium (eller en anden standard medium indeholdende 1,8 mM calcium) og centrifugeres ved 250 xg i 5 min.
    2. Resuspender cellepelleten i FTDA medium suppleret med 4 mg / mL polyvinylalkohol (PVA) og10 uM Y27632 og tælle cellerne i en Neubauer kammer.
    3. Fyld spinnerkolben med cellesuspensionen (30 x 10 6 celler / 100 ml FTDA medium suppleret med PVA og Y-27632; se trin 1.2.2) og initiere EB-dannelse i centrifugekolber (justere rotorhastighed magnetomrører til 40 omdrejninger i minuttet ) i cellekulturen inkubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) natten over.
  3. mesodermal differentiering
    1. Under EB formation, frakke cellekultur kolber egnet til suspensionskultur med ikke-ionisk overfladeaktivt middel (14 ml / T175) natten over ved 37 ° C.
    2. Den næste morgen, vask kolber overfladeaktive overtrukket to gange med PBS (30 ml / T175). Tilføj PBS igen og holde i inkubatoren indtil de skal bruges.
    3. centrifugekolben fra inkubatoren Fjern.
      BEMÆRK: Cellesuspension skal være klar med små makroskopisk synlige EB'er (figur 1B).
    4. Overfør 50 ml suspension til et 50 ml konisk kare og lad EB nøjes med 5-20 min.
    5. Fjern supernatanten og vask bundfaldet med 7 ml RPMI 1640 suppleret med 2% PVA og 10 pM Y-27632. Overførsel suspensionen til en gradueret 15 ml konisk rør og skøn EB volumen (~ 50-100 pi).
    6. Overfør indholdet af spinner kolber til ubestrøget T175 kolber og forlade dette på V-formet stativ til sedimentering i op til 20 min. Fjern supernatanten og vask embryoide legemer som anført ovenfor. den T175 kolbe med mere end 200 ml Fyld ikke som sedimentation ville tage for lang tid. Hvis indledende spinnerkolbe volumen overstiger 200 ml, split EB suspension til flere T175-kolber og kombinere EB'er igen efter vask.
    7. Fjerne vaskemediet og resuspender i medium for mesodermal differentiering, der er RPMI suppleret med 4 mg / ml PVA, 0,5% penicillin / streptomycin, 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES), 0,05% humant serum albumin, 5 ug / ml transferrin, 5 ng / ml natriumselenit, 0,1% lipid mix, 250 uM phospho-ascorbat, 10 pM Y-27632, 10 ng / mL knoglemorfogent protein-4 (BMP-4), og 3 ng / ml activin A, 5 ng / mL stabil FGF2.
    8. Fjern PBS fra overfladeaktivt-coatede T175-kolber og fyldes med cellesuspensionen (200 pi EB'er i 40 ml). Brug mindre kolber til mindre EB volumen.
    9. Dyrk EB'er i suspension i tre dage (37 ° C, 5% CO2, 5% O2). Udveksling 50% af mediet (samme sammensætning som i trin 1.3.7) hver dag (brug V-formet sedimentering rack). Forbered medium frisk hver dag forud for fodring.
  4. Cardiac differentiering
    1. Forbered nye skibe overfladeaktive-belagt dagen før og håndtag som anført ovenfor (1.3.2).
    2. Efter tre dage med mesodermal induktion, lad EB nøjes med op til 5 min på sedimentering rack. Fjernelse af det meste af mediet og vaskes med RPMI 1640 suppleret med 0,5% penicillin / streptomycin og 10 mM HEPES.
    3. Overførsel 10 ml EB suspensionen til gradueret15 ml rør og skøn EB volumen efter sedimentering.
    4. Resuspender EB'er omhyggeligt i hjertedifferentiering medium bestående af RPMI 1640 suppleret med 0,5% penicillin / streptomycin, 10 mM HEPES, 0,05% humant serumalbumin, 5 ug / ml transferrin, 5 ng / ml natriumselenit, 0,1% lipid mix, 250 pM phospho -ascorbate, 1 pM Y-27632, 100 nM Wnt-inhibitor DS-I-7 13.
    5. Overførsel EB'er til nye overfladeaktive-coatede celledyrkningskolber (~ 200 pi EB'er i 46 ml / T175).
    6. Der inkuberes i tre dage (37 ° C, 5% CO2, 21% O2) med 50% medium ændring (medium sammensætning se trin 1.4.4) på den anden og tredje dag. Du må ikke ændre mediet inden for de første 48 timer.
    7. Inkuber i medium bestående af RPMI 1640 suppleret med 500 uM 1-thioglycerol, 10 mM HEPES, 0,5% penicillin / streptomycin, 1 uM Y-27632, 2% serumfrit neural cellekultur supplement (f.eks B27) med insulin, 100 nM Wnt -inhibitor DS-I-7 med daglig udveksling af 50% medium for de næste fire dage. EB'er skal begynde at slå inden for denne periode.
    8. Efter en uges hjertedifferentiering, skifte til det samme medium uden Wnt hæmning og med serumfrit neural cellekultur supplement. Skift 50% af mediet hver dag, bortset fra den første dag.
  5. Dissociation af menneskelige cardiomyocytter
    BEMÆRK: Efter to ugers differentiering protokol bør EB'er viser spontane kontraktioner (figur 1C). Hvis det er tilfældet, begynder dissociation og forberede kollagenaseopløsning.
    1. Forberede collagenaseopløsning ved vejning og løse 200 U / ml i calciumfrit Hanks balancerede saltopløsning uden calcium / magnesium (HBSS) og tilsættes 1 mM HEPES, 10 uM Y-27632, 30 pM N-benzyl-p-toluensulfonamid ( BTS). Der steriliseres ved filtrering (0,2 um filter) og gemme alikvoter ved -20 ° C. Tø portioner ved 4 ° C natten over.
    2. Settle EB'er på sedimentering rack,aspirat medium og erstatte med 20-25 ml forvarmet HBSS. Gentag dette vasketrin gang mere.
    3. Aspirer HBSS og erstat med forvarmet collagenaseopløsning (15 ml / T175). Der inkuberes i 4 timer i cellekulturen inkubator (37 ° C, 5% CO2, 21% O2).
    4. Forbered blokerende buffer med DMEM suppleret med 1% penicillin / streptomycin og DNase (12 ug / ml).
    5. Tryk på cellekulturkolber på bænken, dissocieret EB'er bør desintegrere og falde fra hinanden (hvis ikke, øger inkubationstid). Forsigtigt tritureres cellesuspension og overførsel til et konisk 50 ml rør. Vask kolber med blokerende buffer (15 ml / T175), som overføres til røret.
    6. Centrifuger i 10 minutter ved 100 x g. Resuspender celler i varm DMEM, tritureres og tælle celler.

2. Frembringelse af Engineered hjertevæv (EHT)

  1. Autoklaveres kommercielt tilgængelige PDMS racks og polytetrafluorethylen (PTFE) afstandsstykker (se Materialer ogUdstyr regneark; Figur 2) og fremstilling af følgende opløsninger under sterile betingelser, en dag før EHT generation.
    1. Fremstille 2% agarose ved vejning og opløsning i passende volumen af ​​PBS, autoklav, straks opbevares ved 60 ° C.
    2. Forberede aprotinin (33 mg / ml) ved vejning og opløsning i passende volumen aqua ad iniectabilia, filtrere steril (0,22 um filter), alikvot og opbevares ved -20 ° C.
    3. Forberede fibrinogen (200 mg / ml) ved at opløse steril fibrinogen i passende volumen sterilt 0,9% NaCl (lunken), alikvot og opbevares ved -20 ° C.
    4. Forberede thrombin (100 E / ml) ved at opløse steril thrombin i tre dele sterilt PBS og 2 dele aqua ad iniectabilia, alikvoter af 3 pi i små rør og opbevares ved -20 ° C.
    5. Forberede 10x DMEM ved at opløse 670 mg 10x DMEM pulver i 5 ml aqua ad iniectabilia, filtrere steril og opbevares ved 4 ° C.
    6. Forberede 2x DMEMved blanding af 2 ml 10x DMEM med 2 ml varmeinaktiveret hesteserum, 0,2 ml penicillin / streptomycin og 5,8 ml aqua ad iniectabilia, filtrere steril og opbevares ved 4 ° C.
    7. Forberede EHT-casting medium (ECM) ved blanding DMEM med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum, 1% penicillin / streptomycin og 1% L-glutamin (200 mM), opbevar ved 4 ° C.
  2. Forberede støbeforme i plader med 24 brønde ved pipettering af 1,6 ml varm agarose (2%, PBS) og anbringelse af PTFE spacer (figur 2A) i brøndene.
    BEMÆRK: Sted spacer umiddelbart efter pipettering højst 8 brønde - agarose størkner meget hurtigt. Efterlad ikke agarose ved stuetemperatur i længere tid end 5 min.
  3. Efter agarose størkning (~ 10 min, vil agarose vende uigennemsigtig), fjern PTFE afstandsstykker (fig 2C) og placere PDMS stativer (Figur 2B) i de støbeforme, således at par af PDMS stillinger nå ind i hver formen (figur 2D).
    4. 6 celler / ml minimum.
  4. Forbered 110% af den anslåede mængde af rekonstitution mix i en rundbundet 15-ml rør på ice.For 24 EHTs, pipette rekonstituering mix anført i tabel 1 for humane, rotte- eller muse-cardiomyocytter henholdsvis (10% ekstra er inkluderet).
    BEMÆRK: Cell koncentration af rekonstituering mix er forskellig for human (10 x 10 6 celler / ml), rotte (4,1 x 10 6 celler / ml) og mus (6,8 x 10 6 celler / ml) EHTs. Afhængigt af koncentrationen af ​​cellesuspensionen, tilsættes yderligere ECM til et slutvolumen på 2.640 pi. Fibrinogen skal være lunken til pipettering. Fyld langsomt spidsen af ​​pipetten og ikke røre overfladen af ​​det kolde rekonstituering blandes med det fibrinogen-indeholdende pipette når tilføjelse fibrinogen til rekonstituering mix - viskositeten af ​​fibrinogen i pipettespidsen ville stige straks.
  5. Udriv rekonstituering mix 10 - 15 gange med en serologisk pipette indtil fibrinogen koagel opløses. Kontroller rekonstituering mix i pipetten for homogenitet.
  6. For hver EHT, pipette 100 pi rekonstitution mix i en thrombin alikvot (3 pi i 200 pi rør), blandes og pipetteres blandingen ind i agarose-slots så hurtigt som muligt (fig 2E). Brug et nyt filter tip til hver EHT. Resuspender rekonstituering mix (triturering med serologisk pipette 5-10 gange) efter hver 8. EHTs.
  7. Når alle slots er fyldt med rekonstituering mix, lukker låget på cellekulturskålen og inkuberes ved 37 ° C, 7% CO2 i 2 timer.
  8. Fjern pladen fra inkubatoren og anbringes under en steril hætte. Omfatte hver brønd med en lille mængde medium (f.eks DMEM, ca. 200 - 500 ol), rystes forsigtigt på pladen og inkuber igen ved 37 ° C i mindst 10 min. Tilsætningen af ​​DMEM vil lette fjernelse fra fibringeler fra agarose støbeforme. Udarbejde en ny 24-brønds plade med 1,5 ml EHT-medium per brønd bestående af DMEM suppleret med 10% varme-inaktiveret hesteserum, 1% penicillin / streptomycin, 10 ug / ml insulin, 33 pg / ml aprotinin.
  9. Fjern forsigtigt PDMS racks fra agarose støbeforme og overføre dem til mediet fyldt plade med 24 brønde (figur 2F). Sæt fadet tilbage i inkubatoren (37 ° C, 7% CO2, 40% O2 for humane og rotte EHTs, 21% O2 for muse EHTs) og foder mandage, onsdage og fredage med frisk fremstillet EHT-medium. EHTs bør vise spontane kontraktioner afbøjende stillingerne af PDMS stativerne 7-10 dage efter støbning (figur 1D, 2G).
    1. For muse EHTs tilsættes 25 pg / ml 5-cytosin βDarabinofuranoside til dyrkningsmedium i 48 timer for at begrænse fibroblastproliferation.

3. Sammentrækning Analyse

BEMÆRK: sammentrækning Analysen er baseret påvideo-optisk optagelse i et kommercielt tilgængeligt EHT analyseinstrument (se tabel af materialer). Den centrale enhed med dette instrument er en inkubation kammer (figur 3A). Den er forsynet med instrumentsoftwaren beregner sammentrækning kraft baseret på afbøjning af PDMS stillinger med kendt elasticitetsmodul og geometri 11 (Supplerende figur 1).

  1. Tænd opvarmningsanordningen af ​​maskinen 2 timer før måling. Tænd gasforsyningen og elektronisk levering af aksen systemet umiddelbart før sammentrækning analyse.
  2. For basal optagelse (referencepunkt i analysen), anbringes 24 brønde-plade med EHTs i EHT-medium ind i EHT analyse instrument og start sammentrækning analyse software ifølge leverandørens manual.
    1. Klik på "protokol" fanen i højre panel og indtaste relevante oplysninger om undersøgelse, brugernavn, arter, cell type, alder, optagelængde og yderligere bemærkninger.
    2. Klik på fanen "Camera visning" i venstre panel og starte kamera live-mode med automatisk figur afsløring mode. Klik på fanen "opsætning" på højre panel andadjust kameraets position med xyz-koordinater for hver brønd i 24-godt-fad. Sørg EHT er i midten af ​​vinduet og i fokus på kameraet.
      1. Sørg for, at låget på cellekultur parabol er ikke tåget, da dette vil forringe figur anerkendelse og sammentrækning analyse.
        BEMÆRK: algoritme Tallet anerkendelse er baseret på påvisning af høj kontrast områder og overvåge deres ændring i stilling. I softwaren disse områder af figur anerkendelse vil blive markeret med et blåt kors, der bevæger sig med sammentrækningerne af EHT.
      2. Sørge for, at positionerne af de blå kors er både den øverste og nederste ender af EHTs og bevæger kun lodret matcher sammentrækninger af EHTs (figur 3B). Save setup positioner af hver brønd ved at trykke på knappen "position ok".
    3. Klik derefter på fanen "Parametre" på venstre panel. Parametrene, der vises her definerer de kriterier, som softwaren identificerer en sammentrækning højdepunkt og markerer det med en grøn firkant. Disse værdier er meget vigtige for korrekt identifikation af sammentrækning toppe (figur 3C) og ingen falske datapunkter (figur 3E-F).
      BEMÆRK: En liste over arter afhængige parametre og eksempler er afbildet i figur 3H. For yderligere oplysninger henvises til softwaremanualen.
    4. Klik på "Automatic" fanen i højre panel og igangsætte analysen ved at aktivere "Start" knappen. Softwaren vil bevæge sig sekventielt fra én brønd til de næste, optage EHT sammentrækninger og beregne kraft under optagelse (vises i fanen "Real time" på venstre panel). Ved afslutningen af ​​analysen, en pdf-rapport summaripift resultaterne vil blive genereret automatisk.
  3. Gem og analysere pdf rapportere systemet genererede at opsummere resultaterne.
  4. Overvåg de kontraktile parametre ved gentagen måling over flere dage. Den EHT vil stige i sammentrækning kraft, indtil den har nået et plateau (normalt omkring dag 15 i kultur).
  5. Drug screening
    1. Forberede protein Tyrode opløsning én dag forud for måling og ækvilibrere i 24-brønds plader (2 ml / brønd) i cellekulturen inkubator (37 ° C, 7% CO2, 40% O2) natten: 120 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1 mM MgCI2, 0,1-5 mM CaCl2, 0,4 mM NaH 2 PO4, 22,6 mM NaHCO3, 5 mM glucose, 0,05 mM Na2EDTA, 25 mM HEPES. Tilføj calcium op til 1,8 mM eller den tidligere bestemte [EF 50] for at undersøge positive inotrope effekter.
    2. Veje og opløse lægemidlet i DMSO og filtreres sterilt, om nødvendigt.Forberede 6 forskellige 1000x-sub-stamopløsninger (i DMSO) af arbejdskoncentrationen (f.eks 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 uM for den respektive nanomolære område).
    3. Fortynd den respektive lager i Tyrode plader (2 pi i hver 2 ml brønd) og blandes. Placer pladerne tilbage i inkubatoren indtil de skal bruges.
    4. Start basismåling ved at tage den første Tyrode fyldt 24-well-plade under de sterile hætte og position carbonelektroder i brøndene. Overfør PDMS stativer med de EHTs anbragt oven på carbonelektroder, lukke låget, sætte pladen tilbage i inkubatoren og vente på en ækvilibreringsperiode på ~ 30 min.
    5. Overfør EHTs fra inkubatoren til interlocksignalet i EHT analyse instrument. Luk instrumentet og registrere spontan baseline kontraktilitet (20 s / EHT).
    6. Forbinde carbonelektroderne til pacing-kabel og elektrisk stimulering af EHTs (2,5 V, 4 ms impuls varighed, menneske: ~ 1 Hz, rotte: ~ 2Hz, mus: ~ 4 Hz). Registrere "paced" baseline (10 s / EHT). Sørg for, at alle EHTs er korrekt tempo. Stimulering frekvens og spænding kan variere fra cellelinje til cellelinje.
    7. Efter basislinie optagelse, fjerne EHTs fra instrumentet og overføre elektroderne med PDMS stativer på toppen, til 24-brønd-plade med den første lægemiddelkoncentration. Overfør EHTs tilbage på interlock af EHT analyseapparat straks og inkuber der (standard lægemiddel inkubationstid fx 20 min).
    8. Tilslut pacing-kabler, justere figur anerkendelse og optage EHT sammentrækninger reagerer på den første lægemiddelkoncentration.
    9. For følgende lægemiddelkoncentrationer, gentag trin 3.5.7 og 3.5.8 med de 24-brønds-plader indeholdende højere medikamentkoncentrationer.
    10. Gem alle pdf optagelser. Kontrollere hver optagelse for figur anerkendelse, korrekt placering af grønne firkanter identificerer sammentrækning toppe og artefakter (se 3.2.1 og figur 3
    11. Udfør yderligere offline analyse, hvis nødvendigt.
      1. Vælg den respektive løb fra "Kører" database på venstre panel ved at klikke på "Vælg run". I "parameter" fanen til venstre, ændre parameter for sammentrækning analyse. Nu vælger "Offline-analyse" i "Offline" fanen på højre panel til reanalyze videoerne.
      2. For at justere figur anerkendelse og derfor optage en ny videofil, skal du vælge "Sample anmeldelse" efter justering tallet anerkendelse i fanen "real time". BEMÆRK: Prøve gennemgang kan kun reanalyze én brønd ad gangen, mens offline analyse kan anvende ny parameter for alle brønde ved at klikke på knappen "Brug parameter på alle brønde" i "Parameter" panel til venstre. Begge typer offline analyser vil automatisk skabe nye datafiler og pdf viser resultaterne.
    12. Analyser eksperimentet ved at kombinere resultaterne af biological replikerer og opsummere dataene i koncentrationsresponskurver til frekvens, sammentrækning kraft, sammentrækning tid og relaksationstiden (figur 5D) og / eller grafisk visning af gennemsnitlig sammentrækning toppe (figur 5C).
      BEMÆRK: PDMS stativer og PTFE spacer kan bruges gentagne gange (PDMS racks max 5 gange, og PTFE spacer uendelige.). Efter brug rense dem manuelt med vand, koges to gange i demineraliseret vand og autoklave. Vær opmærksom på potentielle overhæng, når genbruge stativerne, som narkotika kan blive absorberet af PDMS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cardiac Differentiering og Fremstilling af EHT

HiPSC blev ekspanderet på reduceret vækstfaktor basalmembranmatrix, dissocieret med EDTA og embryoide legemer (EBS) dannet i spinnerkolber natten over. Efter mesodermal induktion til tre dage blev hjertedifferentiering initieret med Wnt inhibitoren. Efter ~ 17 dages differentiering protokol blev bankende EB'er dissocieres i enkeltceller med collagenase type II (figur 1). EHTs blev fremstillet ud fra frisk isolerede cardiomyocytter med 1,0 x 10 6 celler pr 100 pi væv umiddelbart efter EB dissociation (figur 2). Til fremstilling af frosne celler (f.eks kommercielle leverandører) blev cellerne optøet ved dråbevis resuspension i medium og resuspenderet i ECM efter centrifugering. Inden for 48 timer blev spontan slå af enkelte celler observeret mikroskopisk i EHT. Løbet af de næste dage, cardiomyocytter spredt ud langs langs kraftlinierne i vævet, kombineret og dannede en sammenhængende bankende EHT. De makroskopisk synlige udbøjninger af PDMS stillinger blev målt med EHT analyse instrument.

sammentrækning Analyse

Analyse af EHT kontraktilitet var baseret på video-optisk registrering (figur 3). I systemet, blev 24-brønds plade med EHTs beliggenhed i gas- og temperaturreguleret inkubator kammer med et glastag. Et kamera forbundet til en motoriseret XYZ-akse blev placeret over denne enhed, og XYZ-koordinaterne blev defineret for hver EHT med et softwareprogram. Analyse af hvert EHT var baseret på figur erkendelse på de øverste og nederste ende af vævet. En automatiseret software-algoritme analyserede filmet EHT sammentrækninger og beregnede kraft udvikling baseret på post afbøjning og elasticity / geometri af PDMS stillinger (Supplerende figur 1) 11. Efter bestemmelse af toppe efter forudbestemte kriterier, en pdf rapport samlet parametre for kontraktilitet for alle EHTs (Supplerende figur 2).

Stabilitet i Long Term Måling

Langsigtet måling af EHTs blev udført i kontinuert med automatiseret gentagen måling hver 20 min. Sammentrækning analyse viste ingen tidsafhængige ændringer (post test for lineær tendens var ikke signifikant) i sammentrækning kraft, slagfrekvens, sammentrækning tid T1 eller relaksationstid T2 i op til 20 timer, hvilket indikerer et højt niveau af stabilitet (figur 4). Som med enhver biologisk prøve selv, de EHTs viser en vis grad af variabilitet, som forventet for biologiske gentagelser. Variationskoefficienterne ved begyndelsen og slutningen af ​​langsigtet measurement var 7/13% for kraft, 12/6% for frekvens, 4/3% for sammentrækning tid og 4/3% til afslapning tid, henholdsvis (n = 4). Denne variabilitet mellem biologiske gentagelser ikke er en artefakt af figur anerkendelse eller analyse som resultaterne for hver enkelt EHT er reproducerbare og har lav variabilitet (Supplerende figur 2).

Drug Screening

Lægemiddelscreening blev udført i serumfrit Tyrodes opløsning. Kumulative koncentrationsresponskurver blev dannet med en maksimal koncentration på 0,1% DMSO-vehikel. Baseline sammentrækning analyse viste meget lidt uregelmæssighed i at slå mønster og meget lav variation mellem replikater. Eksponering for hERG-blokkeren E4031 resulterede i en signifikant forlængelse af relaksationstiden (T2) ved 10 nM og uregelmæssig bankende mønster ved højere koncentrationer (figur 5). For frequency kontrolleret sammentrækning analyse, målinger blev eventuelt udført med elektrisk stimulering under anvendelse carbonelektroder.

figur 1
Figur 1: Cardiac differentiering. (A) human induceret pluripotente stamceller. Målestok = 100 um. (B) Embryoide organer i begyndelsen af mesodermal differentiering. Målestok = 100 um. (C) kontraherende embryoide legemer ved udgangen af hjertedifferentiering. Målestok = 100 um. (D) Humant manipuleret hjertevæv. Målestok = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Generering af Engineered hjertevæv (EHT). (A) PTFE afstandsstykke. (B) PDMS rack. A, (B) Målestok = 1 cm (C) Ovenfra på en brønd i en 24-brønds-plade med støbeform i agarose efter fjernelse af PTFE spacer. (D) par af stillinger fra PDMS rist i støbeformen. (E) Reconstitution blanding pipetteret i støbeformen og omkring PDMS stillinger. (F) Frisk genererede EHT på dag 0, overført til en ny dyrkningsskål med medium. (G) Ombygget EHT i medium på dag 15. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3: Sammentrækning Analyse af Engineered hjertevæv (EHT). (A) EHTanalyseinstrument med computerstyret kamera over gas- og temperaturreguleret rugekammeret med EHTs i 24 brønde-dyrkningsskål oven på en LED panel. (B) Levende billede af en EHT under analysen med den automatiserede sammentrækning analyse software. (C) Eksempler sammentrækning mønster viser sammentrækning kraft over tid målt med 100 frames per sekund og forstørret skematisk sammentrækning top, viser analyseparameteren kraft, sammentrækning tid (T1), relaksationstid (T2), sammentrækning hastighed (CV), afslapning hastighed ( RV, dette tal er blevet genoptrykt fra 7 og 27). DH: Parametre for sammentrækning analyse. (D) Eksempler på forskellige filtermaterialer niveauer (blå filtreret linje) påvirker figuren anerkendelse. Venstre: Filter niveau = 0. Bemærk, at ingen blå filtreret linie er synlig, men kun den røde oprindelige spor. I midten: Filter niveau = 3, hvilket indikerer ideel anerkendelse / analyse af the sammentrækning toppe. Til højre: Filter niveau = 20. Bemærk, at de blå filtrerede linjer er meget mindre end de oprindelige spor indikerer dårlig sammentrækning peak analyse. (E) Eksempel på arytmiske EHT kontraktioner analyseret med en for høj kraft tærskel (til venstre) og nedre krafttærskelen (højre) med alle toppe anerkendte. (F) Eksempler spor af EHTs udsat for natriumkanalen agonist ATX-II resulterer i en forlænget relaksationstid med tidligt efter sammentrækninger. Bemærk, at den fjerde sammentrækning højdepunkt på den venstre panel ikke genkendes (ingen grøn firkant) på grund af en for lav minimum faktor. (G) Eksempler på sammentrækning toppe med (højre panel) og uden (højre panel) pink kurve (første afledede af sammentrækning kurve, sammentrækning og afslapning hastighed). (H) Sammendrag af parameter anbefalinger til murine og humane EHTs. Bemærk, at disse parametre kan have behov for justering som ændringer sammentrækning mønster under eksponering lægemiddel (se E,F). Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4: Time Control Under Long Term Måling af spontant bankende humant Engineered hjertevæv (EHT). Tidsstyring under langvarig måling af spontant slående humant manipuleret hjertevæv (EHT). EHTs blev anbragt i EHT analyse instrument og inkuberet i et tidsrum på 20 timer. Automatiserede sammentrækning analyser blev udført hver 20 min med ikke signifikant post-test for lineær tendens (n ​​= 4; data repræsenterer gennemsnit + standardafvigelse). Klik her for at se en større version af dette tal.

t = "Figur 5" src = "/ files / ftp_upload / 55.461 / 55461fig5.jpg" />
Figur 5: Virkning af hERG Channel Blocker E4031 on Human Engineered hjertevæv (EHT).
(A) Eksempler sammentrækning mønster ved baseline. (B) Eksempler sammentrækning mønster efter inkubation i 300 nM E4031. (C) Gennemsnitlig sammentrækning peak (n = 4) af elektrisk stimulerede EHTs ved baseline (sort) og efter 30 min inkubation i 100 nM E4031 (rød). Analyse med 100 frames per sekund. (D) Koncentration responskurver for E4031 på spontant bankende humane EHTs. Bemærk den mindre effekt størrelse i T2-forlængelse i de elektrisk stimulerede EHTs (C) vs. spontant bankende EHTs (D). Envejs ANOVA, gentagne målinger med Dunnetts post-test vs. baseline; * P <0,05; n = 4. Z' faktor 25 for T2 forlængelse ved 300 nM E4031 er 0,75.pg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.

Human Rotte Mus
celler 26.4x10 6 10.8x10 6 18.0x10 6
2xDMEM [uL] 147 147 147
Basalmembranmatrix [uL] 264 - 264
Y-27632 [uL] 2.6 - -
Fibrinogen [uL] 66,8 66,8 66,8
ECM [uL] annonce 2640 annonce 2640 annonce 2640

Tabel 1: pipettering Ordning for Perstatning af Rekonstituering Mix for 24 Menneskelige, rotter og mus EHTs. Fibrinogenkoncentration er 5 mg / ml for alle EHTs. Bemærk, at cellekoncentrationen er forskellig for hver art. For humane EHTs, tilføje basalmembranmatrix (fx matrigel, se Materialer tabel) og Rho-kinase-inhibitor Y-27632 til blandingen. For muse EHTs, tilføje basalmembranmatrix. Afhængigt af den initiale koncentration af cellesuspensionen, tilsættes yderligere ECM at nå et samlet volumen på 2.640 pi rekonstituering mix.

Supplerende Figur 1
Supplerende Figur 1: Beregning Formel for kontraktionskraft Baseret på post Afbøjning 26. Klik her for at se en større version af dette tal.


Supplerende Figur 2: Eksemplarisk data Uddrag fra Sammentrækning analyserapport af softwaren.
Top: Sammentrækning toppe over 20 sekunders tid optaget med 100 frames / s (rød: sammentrækning kraft; lyserød: sammentrækning velocity). Nederst: Analyseret kontraktion parameter viser minimum, middelværdi, maksimum og standardafvigelse af de 18 analyserede sammentrækning toppe mærket med en grøn firkant (øverst). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udviklet hjerte væv giver en værdifuld mulighed for at værktøjskasse af hjerte-kar-forskning. EHTs i 24-brønds format har vist værdifulde til sygdom modellering 8, 14, lægemiddelsikkerhed screening 7, 8, 10, 11, 15, eller basisk kardiovaskulær forskning 16, 17.

Potentielle modifikationer af de basiske EHT protokoller omfatter undersøgelser på cellulær interaktion med definerede blandinger af cardiomyocytter og ikke-cardiomyocytter 18 og afterload enhancement 14. Vigtige aspekter for fejlfinding omfatter kvaliteten af ​​input cellepopulationen og kvaliteten af ​​fibrinogen. Hvis den oprindelige geldannelse er uregelmæssig eller ikke kompakt nok til at holde to PDMS stillinger, eller hvis gelen hurtigt degenereret inden for få dage efter støbning på grund af lav koncentration aprotinin, EHTs generation vil ikke blive en succes.

Følgende begrænsninger skal overvejes. (I) gennemløb i 24-brønds format er ikke velegnet til en primær screening setup, men er tilstrækkelig til en sekundær skærm til bekræftelse. (Ii) Den integrerede udlæsning af kraft, sammentrækning kinetik og rytme har lav specificitet, hvilket gør det vanskeligt at forbinde ændringer i kraft til specifikke molekylære mekanismer. (Iii) Mens 3D kultur format og strækningen pålagt af bøjede PDMS stillinger forbedre morfologiske og funktionelle aspekter af modning, manglen på sande interkalerede skiver, spontan slå, og lavere end normale adrenerge svar viser, at fuld hjerte- modning endnu ikke er opnået med denne protokol. (iv) PDMS er blevet vist at absorbere forskellige lægemidler til forskellige udvide 19 og den faktiske effektive koncentration på EHTs kan variere. Denne skævhed kan være mere fremtrædende i kronisk toksicitetsforsøg 15 end dem undersøge akutte lægemiddelvirkninger 7, 8 og klart afhænger af stoffet ved hånden. Som følge heraf bør enhver PDMS rack udsat for narkotika kasseres efter brug og det potentielle absorption af forskellige lægemidler bliver nødt til at blive taget i betragtning, når man analyserer dataene. (v) I betragtning af, at der er behov 1x10 6 hiPSCs pr EHT omkostningerne pr datapunkt er høje.

Betydningen af denne protokol i forhold til ex vivo hjerte kontraktilitet analyse er potentiale til at arbejde i en menneskelige system, manglen på eksperimentelle nedslidte, og den standardiserede produktion af EHTs som gør det muligt at oprette store undersøgelser om specifikke genetiske baggrunde (f.eks sygdom modellering ). I sammenligning med andre hiPSC testsystemer (multi elektrodesæt, impedans), dette system analyserers sammentrækningskraft som den vigtigste fysiologiske parameter af cardiomyocytter i en tredimensionel struktur og tillader dyrkning under defineret belastning. EHTs kontrakt regelmæssigt og stabil kraft, frekvens og rytme over mange timer og uger, hvilket giver lang sigt målinger og evaluering af kronisk toksicitet. EHT-analyse kan udføres under elektrisk stimulation, som er vigtigt med hensyn til kraft-frekvens forholdet mellem muskelsammentrækning og dets potentielle indflydelse på lægemiddelvirkninger. Med hensyn til den umodne status hiPSC-CM, elektrisk stimulering har potentiale til at skubbe cellerne hen imod en mere moden fænotype 20, 21 og kan inkluderes i EHT vedligeholdelse. Derudover EHT test system giver højt indhold udlæsning herunder alle standard histologiske parametre samt biokemi (RNA, DNA, protein isolation) 11. Potentielle fremtidige applikationer omfatter aspekter af lægemiddeludvikling (målvalidering, farmakologisk sikkerhed) og sygdom modellering, især i kombination med CRISPR / Cas9 medieret generation af isogene kontrol.

Under vedligeholdelse af EHTs og ydeevne koncentrationsresponskurver, er det vigtigt nøje at følge instruktionerne for sterile celledyrkningsprocedurer at undgå fungale forureninger under overføring af PDMS racks mellem plader med 24 brønde. Det mest kritiske skridt med EHT dog den cardiomyocyte differentiering protokol. For EHTs til sammenhængende danne beating muskelstrimler, input befolkning må bestå af mindst 60% cardiomyocytter. Heldigvis differentieringsfaktorer protokoller blev mere robust og effektivt gennem årene og cardiomyocytter er let kommercielt tilgængelige nu. Rollen af ​​ikke-myocytter i udviklingen af ​​hiPSC-afledte manipuleret hjertevævet er ikke fuldt klarlagt, endnu. Eksperimenter med hiPSC-CM med høj renhed førte til overraskende god EHTass = "xref"> 7, men integration af andre celletyper i vævet er blevet vist at forbedre vævsfunktion og kunne skubbe fænotype til en moden fysiologi 22, 23, 24. Som vævene genereres i en 24-brønds-format med en million celler pr væv, denne platform er stadig temmelig dyrt. Skalering ned til en 96-brønds format er stræbt, men hidtil robusthed outbalances denne mangel. Protokollen præsenteres i dette manuskript er teknisk meget robust med lidt variation mellem replikater. Intra-batch variation er meget lav for kinetikken (gennemsnitlig variationskoefficient = 5%), og noget stort til den spontane bankende frekvens (gennemsnitlig variationskoefficient 10%) og kontraktionskraft (gennemsnitlig variationskoefficient 17%). Teknikken er meget robust. På tværs af forskellige eksperimentatorer, effektiviteten til at generere slå EHTs er> 90% af støbte hydrogeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

IM, TE og AH er medstiftere af EHT Technologies GmbH, Tyskland.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for Alessandra Moretti og Dennis Schade for deres venlige bidrag materiale. Vi anerkender den store støtte fra iPS og EHT arbejdsgruppe på Institut for Eksperimentel Farmakologi og Toksikologi af UKE. Arbejdet af forfatterne er støttet af tilskud fra DZHK (tysk Center for Cardiovascular Research) og det tyske Uddannelse og Forskning (BMBF), den tyske Research Foundation (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), British National center for udskiftning Refinement & Reduktion af dyr til forskning (NC3Rs CRACK-IT bevilge 35.911-259.146), British Heart Foundation RM / 13/30157, det Europæiske Forskningsråd (Advanced Grant IndivuHeart), den tyske Hjerteforeningen og Freie und Hansestadt Hamburg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EHT analysis intrument EHT Technologies GmbH A0001 Software is included
EHT PDMS rack EHT Technologies GmbH C0001
EHT PTFE spacer EHT Technologies GmbH C0002
EHT electrode EHT Technologies GmbH P0001
EHT pacing adapter/cable EHT Technologies GmbH P0002
24-well-plate Nunc 144530
6 well-cell culture plate Nunc 140675
15 mL falcon tube, graduated  Sarstedt 62,554,502
Cell scraper Sarstedt 831,830
Spinner flask Integra 182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct  Thermo scientific 70101 Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask  Sarstedt  831,812,002
V-shaped sedimentation rack  Custom made at UKE Hamburg na
10× DMEM Gibco 52100
1-Thioglycerol  Sigma Aldrich M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma Aldrich 49752
Activin-A  R&D systems 338-AC
Agarose  Invitrogen 15510-019
Aprotinin Sigma Aldrich A1153
Aqua ad injectabilia Baxter GmbH 1428
B27 PLUS insulin  Gibco 17504-044
BMP-4 R&D systems 314-BP
Collagenase II  Worthington LS004176
DMEM Biochrom F0415
DMSO  Sigma Aldrich D4540
DNase II, type V (from bovine spleen) Sigma  D8764
Dorsomorphin  abcam ab120843
EDTA  Roth 8043.2
Fetal calf serum Gibco 10437028
FGF2 Miltenyi Biotec 130-104-921
Fibrinogen (bovine) Sigma Aldrich F8630
Geltrex  Gibco A1413302 For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+  Gibco 14175-053
HEPES  Roth 9105.4
Horse serum Life technologies 26050088
Human serum albumin  Biological Industries 05-720-1B
Insulin, human Sigma Aldrich I9278
L-Glutamin Gibco 25030-024
Lipidmix  Sigma Aldrich L5146
Matrigel BD Biosciences 354234 For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide TCI B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2 Biochrom 14190
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Pluronic F-127  Sigma Aldrich P2443
Polyvinyl alcohol  Sigma Aldrich P8136
RPMI 1640  Gibco 21875
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261
TGFß1 Peprotech 100-21
Thrombin Sigma Aldrich T7513
Transferrin  Sigma Aldrich T8158
Y-27632 Biorbyt orb6014
hiPSC Custom made at UKE hamburg na
iCell cardiomyocytes kit Cellular Dynamics International CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit Pluriomics PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit Axiogenesis AG Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes Takara Bio USA, Inc. Y10075

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  6. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  7. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  8. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).
  9. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  10. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
  11. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  12. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958 (2012).
  13. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  14. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  15. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).
  16. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  17. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).
  18. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  19. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  20. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  21. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312 (2016).
  22. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  23. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  24. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

Tags

Bioengineering Engineered hjertevæv cardiomyocytter vævsmanipulering hjertedifferentiering lægemiddelsikkerhed farmakologi
Automatiseret Sammentrækning Analyse af humant Engineered Heart Væv til Cardiac Drug Safety Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mannhardt, I., Saleem, U., Benzin,… More

Mannhardt, I., Saleem, U., Benzin, A., Schulze, T., Klampe, B., Eschenhagen, T., Hansen, A. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. J. Vis. Exp. (122), e55461, doi:10.3791/55461 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter