Summary
Aquí, se muestra la generación de tejido del corazón ingeniería humana a partir de células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) derivada de los cardiomiocitos. Se presenta un método para analizar la fuerza de contracción y la alteración ejemplar de patrón de contracción por el hERG inhibidor del canal E-4031. Este método muestra alto nivel de robustez y la idoneidad para la detección de drogas cardíaco.
Abstract
la ingeniería de tejidos cardíaco describe técnicas para constituir tres tejidos de ingeniería dimensionales generadores de fuerza. Para la aplicación de estos procedimientos en la investigación básica y el desarrollo preclínico de fármacos, es importante desarrollar protocolos para la generación y el análisis automatizado bajo condiciones estandarizadas. A continuación, presentamos una técnica para generar tejido del corazón diseñados (EHT) de los cardiomiocitos de diferentes especies (rata, ratón, humano). La técnica se basa en el montaje de una fibrina-gel que contiene cardiomiocitos disociados entre polidimetilsiloxano elástico (PDMS) mensajes en un formato de 24 pocillos. Tridimensionales, técnicos en salud ambiental de generación de fuerza constituyen un plazo de dos semanas después de la fundición. Este procedimiento permite la generación de varios cientos de técnicos en salud ambiental por semana y es técnicamente limitado sólo por la disponibilidad de los cardiomiocitos (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluación de las contracciones musculares auxotonic se realiza en una cámara de incubación modificado con un mechanenclavamiento ical para placas de 24 pocillos y una cámara colocada en la parte superior de esta cámara. Un software controla una cámara se movió en un sistema de ejes XYZ a cada EHT. contracciones EHT son detectadas por un algoritmo de reconocimiento de la figura automatizado, y la fuerza se calcula sobre la base de acortamiento de la EHT y la propensión elástica y la geometría de los puestos de PDMS. Este procedimiento permite el análisis automatizado de alto número de EHT bajo condiciones estandarizadas y estériles. La detección fiable de efectos del fármaco sobre la contracción de los cardiomiocitos es crucial para el desarrollo de fármacos cardíaco y farmacología de seguridad. Demostramos, con el ejemplo del inhibidor del canal hERG E-4031, que el sistema de EHT humana replica las respuestas de drogas sobre la cinética de contracción del corazón humano, lo que indica que es una herramienta prometedora para la detección de la seguridad del fármaco cardiaco.
Introduction
efectos secundarios cardiacos como el síndrome de QT largo inducido por fármacos han dado lugar a las retiradas del mercado en los últimos años. Las estadísticas indican que alrededor del 45% de todas las extracciones son debido a los efectos no deseados sobre el sistema cardiovascular 1. Este fracaso de drogas después de que el proceso de desarrollo y aprobación caro es el peor de los casos para las compañías farmacéuticas. Por lo tanto, los departamentos de investigación y desarrollo se centran en la detección de tales efectos cardiovasculares no deseados desde el principio. Por razones económicas y éticas, los esfuerzos para reducir los experimentos con animales y reemplazarlos con nuevos ensayos de selección in vitro están en curso.
Un conjunto de ensayos establecidos están incluidos en la Food and Drug Administration (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) directrices para la evaluación preclínica de proarrítmicas efectos de drogas 2. La tecnología de la reprogramación de células somáticas seguido por la diferenciación de lascélulas humanas inducidas pluripotentes madre (hiPSC) impulsaron este campo de investigación 3. En la actualidad ofrece la posibilidad de detectar nuevos fármacos candidatos en cardiomiocitos humanos in vitro y evita problemas con las diferencias entre las especies. Los últimos protocolos de diferenciación cardíacas 4, 5 proporcionan suministro ilimitado de cardiomiocitos y sin preocupación ética. Sin embargo, la medición de la fuerza contráctil, la más importante y mejor caracterizado parámetro vivo de los cardiomiocitos, no está bien establecido. Esto está relacionado con la relativa inmadurez 6 de cardiomiocitos inducida humanos madre pluripotentes derivadas de células (hiPSC-CM) en comparación con la de los cardiomiocitos adultos. Una posible avance es diseñar el tejido del corazón de 3 dimensiones a partir de células individuales 7 (tejido corazón ingeniería, EHT). El protocolo EHT se basa en la incorporación de un solo murino o cardiomiocitos humanos 8 sup>, 9, 10 en hidrogel de fibrina entre dos polidimetilsiloxano flexible (PDMS) mensajes 11 en formato de 24 pocillos. A los pocos días los cardiomiocitos comienzan a contraerse espontáneamente a medida que las células individuales y comienzan a formar redes celulares. Después de 7-10 días, las contracciones macroscópicas de todo el tejido son visibles. Durante este proceso, la matriz extracelular es remodelado, lo que conduce a una disminución del diámetro y longitud. El acortamiento de los resultados EHT en la flexión de los PDMS publicar incluso durante el reposo, sometiendo los cardiomiocitos en la EHT en desarrollo a carga continua. Técnicos en salud ambiental continúan realizando contracciones musculares auxotonic lo largo de varias semanas. Técnicos en salud ambiental en humanos demuestran respuestas a la estimulación fisiológica y farmacológica que indican su idoneidad para la detección de drogas y la enfermedad modelar 7.
En este manuscrito se presenta un protocolo robusto y fácil para los Generatien de EHT humano, y el análisis de la contractilidad automatizado de los cambios dependientes de la concentración del patrón de contracción en presencia de inhibidores de los canales de hERG.
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Protocol
NOTA: Los pasos siguientes describen un protocolo de cultivo de células. Por favor, realice en condiciones estériles y usar los medios pre-calentado.
1. cardiaca diferenciación de hiPSC
- Cultivar la hiPSC
- Recubrir placas de 6 pocillos (1 ml / pocillo) o matraces T75 (7 ml / matraz) con matriz de membrana basal reducida del factor de crecimiento (por ejemplo geltrex, 1: 200; véase la tabla de materiales) diluido en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) para 30 min a 37 ° C. Preparar medio EDA 12 mediante la mezcla de DMEM básico / F-12 medio con 2 mM L-glutamina, 0,5% de penicilina / estreptomicina, 5 mg / L de transferrina, 5 mg / L de selenio, 0,1% de albúmina de suero humano, 1x lípido-mix, 5 mg / L de insulina, 50 nM dorsomorphin, 2,5 ng / ml de activina A, 0,5 ng / ml humano TGFß1 y 30 ng / ml FGF2.
- HiPSC Seed (~ 3 x 10 5/10 cm²) en medio y la cultura EDA a 37 ° C, 5% de CO2, 21% de O 2 con cambio de medio al día (Figura 1A). Al 80% de confluencia, el paso (1: 2-1: 6) con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 0,5 mM; tiempo de incubación ~ 4 min).
- La formación de cuerpos embrioides (EB)
- Cultivar hiPSC en matraces T75 a alta densidad.
- Lavar matraces con células confluentes dos veces con solución salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio (PBS) y se incuban en EDTA 0,5 mM durante ~ 10 min. Asegúrese de que las células no se separan del fondo del matraz.
- Eliminar el EDTA con pipeta de vidrio, lave fuera de las células con 10 ml de PBS, frascos de agua en el banco para separar las células.
NOTA: El uso raspador celular si es necesario. - Recoger las células en tubo cónico de 50 ml, añadir ¼ de volumen (por ejemplo, 10 ml RMPI a 40 ml de suspensión celular) RPMI 1640 (o cualquier otro medio estándar que contiene calcio 1,8 mM) y se centrifuga a 250 xg durante 5 min.
- Resuspender el sedimento celular en medio EDA suplementado con 4 mg / ml de alcohol de polivinilo (PVA) y10 M Y27632 y contar las células en una cámara de Neubauer.
- Llenar el matraz de agitación con la suspensión de células (30 x 10 6 células / 100 ml de medio suplementado con EDA PVA y Y-27632; véase la etapa 1.2.2) e iniciar EB formación en matraces de agitación (ajustar la velocidad del rotor de agitador magnético a 40 rpm ) en la incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO2, 5% de O 2) durante la noche.
- Cultivar hiPSC en matraces T75 a alta densidad.
- la diferenciación mesodérmica
- Durante la formación de EB, cultivo celular capa matraces adecuado para el cultivo en suspensión con un tensioactivo no iónico (14 ml / T175) durante la noche a 37 ° C.
- A la mañana siguiente, lavar los frascos de tensioactivos recubierto dos veces con PBS (30 ml / T175). Añadir PBS de nuevo y mantener en la incubadora hasta que se necesite.
- Retire el frasco giratorio de la incubadora.
NOTA: La suspensión celular debería estar claro con pequeñas EBs macroscópicamente visibles (Figura 1B). - Transferir 50 ml de suspensión de bañera cónica 50 mlcorreos y dejar que los CE se conforman con 5-20 min.
- Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con 7 ml de RPMI 1640 suplementado con 2% de PVA y 10? M Y-27632. Transferencia de suspensión a una 15 ml tubo cónico y estimación del volumen de EB graduada (~ 50-100 l).
- Transferir el contenido de los matraces de agitación a matraces T175 no recubiertos y dejar este sobre una rejilla en forma de V para la sedimentación durante un máximo de 20 min. Se retira el sobrenadante y lavar cuerpos embrionarios como se indicó anteriormente. No llene el frasco T175 con más de 200 ml como la sedimentación sería demasiado largo. Si el volumen inicial matraz de agitación superior a 200 ml, dividir suspensión EB a varios matraces T175 y combinar EBs de nuevo después del lavado.
- Retire medio de lavado y resuspender en medio de diferenciación mesodérmica, es decir RPMI suplementado con 4 mg / ml de PVA, 0,5% de penicilina / estreptomicina, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES), suero humano al 0,05% albúmina, 5 mg / ml de transferrina, 5 ng / ml selenito de sodio, 0,1% de mezcla de lípidos, 250 M fosfo-ascorbato, 10? M Y-27632, 10 ng / ml de proteína morfogénica ósea-4 (BMP-4), y 3 ng / ml de activina A, 5 ng / ml FGF2 estable.
- Retirar PBS de los matraces de T175 tensioactivo revestido y rellenar con la suspensión de células (200! L EBs en 40 ml). Usar frascos más pequeños para menor volumen EB.
- Cultivar EBs en suspensión durante tres días (37 ° C, 5% de CO2, 5% de O 2). Cambio de 50% del medio (misma composición que en el paso 1.3.7) cada día (rack de sedimentación en forma de V uso). Preparar medio fresco cada día antes de la alimentación.
- diferenciación cardíaca
- Preparar nuevos vasos tensioactivos recubierto el día antes y manejar como se ha indicado anteriormente (1.3.2).
- Después de tres días de la inducción mesodérmica, permiten EBs se conforman con hasta 5 min en el estante de la sedimentación. Eliminar la mayor parte del medio y se lava con RPMI 1640 suplementado con 0,5% de penicilina / estreptomicina y HEPES 10 mM.
- Transferencia de 10 ml de suspensión de EB a graduó15 ml tubo y estimación del volumen de EB después de la sedimentación.
- Resuspender EBs cuidadosamente en medio de diferenciación cardiaca que consiste en RPMI 1640 suplementado con 0,5% de penicilina / estreptomicina, HEPES 10 mM, 0,05% de albúmina de suero humano, 5 mg / ml de transferrina, 5 ng / selenito de sodio ml, 0,1% de mezcla de lípidos, 250 M fosfo -ascorbato, 1 M Y-27632, 100 nM Wnt-inhibidor DS-I-7 13.
- Transferencia de EBs a nuevos frascos de cultivo celular de tensioactivos recubierto (~ 200! L EBs en 46 ml / T175).
- Incubar durante tres días (37 ° C, 5% de CO2, 21% de O 2) con 50% de cambio medio (composición del medio véase la etapa 1.4.4) en el segundo y tercer día. No cambie el medio dentro de las primeras 48 h.
- Incubar en un medio que consiste en RPMI 1640 suplementado con 500? M 1-tioglicerol, HEPES 10 mM, 0,5% de penicilina / estreptomicina, 1 M Y-27632, 2% de suplemento de cultivo celular neural exento de suero (por ejemplo, B27) con insulina, 100 nM Wnt -inhibidor DS-I-7 con cambio diario del medio de 50% durante los siguientes cuatro días. EBS deben empezar a golpear dentro de este período.
- Después de una semana de la diferenciación cardiaca, cambiar al mismo medio sin inhibición Wnt y con suplemento de cultivo celular neural exento de suero. Cambiar el 50% del medio todos los días, excepto para el primer día.
- La disociación de los cardiomiocitos humanos
NOTA: Después de dos semanas de protocolo de diferenciación, EBs debe mostrar contracciones espontáneas (Figura 1C). Si es así, iniciar la disociación y preparar la solución de colagenasa.- Preparar solución de colagenasa en el pesaje y la solución de 200 U / ml en solución salina equilibrada de Hanks libre de calcio sin calcio / magnesio (HBSS) y se añade HEPES 1 mM, 10! M Y-27632, 30? M N-bencil-p-tolueno sulfonamida ( BTS). Esterilizar por filtración (filtro de 0,2 micras) y las alícuotas almacenar a -20 ° C. Descongelar alícuotas a 4 ° C durante la noche.
- Settle EBS sobre una rejilla de sedimentación,medio aspirado y reemplazar con HBSS 20-25 ml pre-calentado. Repita este paso de lavado una vez más.
- Aspirar HBSS y reemplazar con solución de colagenasa pre-calentado (15 ml / T175). Incubar durante 4 h en el incubador de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO2, 21% de O 2).
- Preparar tampón de bloqueo con DMEM suplementado con 1% de penicilina / estreptomicina y ADNasa (12 mg / ml).
- Toque en los frascos de cultivo celular en el banco, disociado EBs debería desintegrarse y desmoronarse (si no, aumentar el tiempo de incubación). suspensión de células se tritura suavemente y transferir a un tubo de 50 ml cónico. Lavar frascos con tampón de bloqueo (15 ml / T175) y transferir al tubo.
- Centrifugar durante 10 min a 100 x g. Resuspender las células en DMEM caliente, se tritura y contar las células.
2. Generación de ingeniería tisular corazón (EHT)
- Autoclave bastidores PDMS disponibles en el mercado y los espaciadores de politetrafluoroetileno (PTFE) (ver Materiales yHoja de cálculo de equipos; La Figura 2) y preparar las siguientes soluciones en condiciones estériles, un día antes de la generación de EHT.
- Preparar 2% de agarosa en el pesaje y la disolución en un volumen apropiado de PBS, autoclave, almacenar inmediatamente a 60 ° C.
- Preparar aprotinina (33 mg / ml) en el pesaje y disolviendo en volumen apropiado de anuncios iniectabilia aqua, filtro estéril (filtro de 0,22 micras), alícuota y se almacena a -20 ° C.
- Preparar fibrinógeno (200 mg / ml) mediante la disolución de fibrinógeno estéril en volumen apropiado de estéril al 0,9% de NaCl (tibia), alícuota y se almacena a -20 ° C.
- Preparar trombina (100 U / ml) mediante la disolución de trombina estéril en tres partes PBS estéril y 2 partes iniectabilia ad aguamarina, partes alícuotas de 3 l en tubos pequeños y almacenar a -20 ° C.
- Preparar 10x DMEM disolviendo 670 mg 10x DMEM en polvo en 5 ml iniectabilia aqua ad, filtrado estéril y se almacena a 4 ° C.
- Preparar 2x DMEMmediante la mezcla de 2 ml 10x DMEM con 2 ml de suero de caballo inactivado por calor, 0,2 ml de penicilina / estreptomicina y 5,8 ml iniectabilia aqua ad, filtrado estéril y se almacena a 4 ° C.
- Preparar EHT-fundición medio (ECM) mediante la mezcla de DMEM con 10% de suero fetal inactivado por calor de ternera, 1% de penicilina / estreptomicina y 1% de L-glutamina (200 mM), se almacena a 4 ° C.
- Preparar moldes de colada en placas de 24 pocillos pipeteando 1,6 ml de agarosa caliente (2%, PBS) y colocar el espaciador PTFE (Figura 2A) en los pocillos.
NOTA: Lugar espaciador inmediatamente después de pipetear en un máximo de 8 pocillos - agarosa solidifica muy rápido. No deje que la agarosa a temperatura ambiente durante más de 5 minutos. - Después de la solidificación de agarosa (~ 10 min, agarosa se volverá opaca), retirar los espaciadores de PTFE (Figura 2C) y colocar los bastidores PDMS (Figura 2B) en los moldes de fundición de modo que pares de postes PDMS alcanzan en cada molde (Figura 2D).
- Prepare 110% del volumen estimado de mezcla reconstitución en un fondo de tubo redondo de 15 ml en ice.For 24 técnicos en salud ambiental, pipeta la mezcla reconstitución enumerados en la Tabla 1 para humanos, de rata o de ratón cardiomiocitos, respectivamente (10% extra está incluido).
NOTA: La concentración de células de la mezcla de la reconstitución es diferente para (6.8 x 10 6 células / ml) técnicos en salud ambiental humana (10 x 10 6 células / ml), de rata (4.1 x 10 6 células / ml) y el ratón. Dependiendo de la concentración de la suspensión de células, añadir ECM adicional a un volumen final de 2.640 l. Fibrinógeno tiene que estar tibia para pipetear. llenar lentamente la punta de la pipeta y no toque la superficie de la mezcla de la reconstitución en frío con la pipeta que contiene fibrinógeno cuando la adición de fibrinógeno en la mezcla de la reconstitución - la viscosidad de la fibrinógeno en la punta de la pipeta aumentaría inmediatamente. - Se tritura la mezcla de reconstitución 10 - 15 veces con una pipeta serológica hasta que el coágulo de fibrinógeno se disuelve. Compruebe la mezcla de la reconstitución de la pipeta para la homogeneidad.
- Para cada EHT, pipeta de 100! L de la mezcla de la reconstitución en una parte alícuota de trombina (3 l en un tubo de 200! L), mezclar y pipetear la mezcla en la agarosa ranuras lo más rápidamente posible (Figura 2E). Utilizar una punta de filtro para cada EHT. Resuspender la mezcla de reconstitución (trituración con serológica pipeta 5-10 veces) después de cada 8 técnicos en salud ambiental.
- Una vez que todas las ranuras se llenan con la mezcla de la reconstitución, cierre la tapa de la cápsula de cultivo celular y se incuba a 37 ° C, 7% de CO2 durante 2 h.
- Retirar la placa de la incubadora y se coloca bajo una campana estéril. Cubrir cada pocillo con una pequeña cantidad de medio (por ejemplo, DMEM, de aproximadamente 200 - 500 l), agitar suavemente la placa y se incuba de nuevo a 37 ° C durante al menos 10 min. La adición de DMEM facilitará la eliminación de los geles de fibrina a partir de moldes de fundición de agarosa.
- Retire cuidadosamente los bastidores de PDMS de los moldes de fundición de agarosa y la transferencia a la placa de 24 pocillos llenos de medio (Figura 2F). Coloque el plato de nuevo en la incubadora (37 ° C, 7% de CO2, 40% de O 2 para técnicos en salud ambiental humanos y de rata, 21% O 2 para técnicos en salud ambiental ratón) y de alimentación de los lunes, miércoles y viernes con recién preparada EHT-medio. Técnicos en salud ambiental deberían mostrar las contracciones espontáneas de desviación los puestos de los bastidores PDMS 7-10 días después de la fundición (Figura 1D, 2G).
- Para ratón técnicos en salud ambiental añaden 25 g / ml de βDarabinofuranoside 5-citosina a medio de cultivo durante 48 h para limitar la proliferación de fibroblastos.
Análisis 3. Contracción
NOTA: El análisis se basa en la contracciónvideo-óptico de grabación en un instrumento de análisis EHT disponible en el mercado (véase la Tabla de materiales). La unidad central de este instrumento es una cámara de incubación (Figura 3A). El software proporcionado con el instrumento calcula la fuerza de contracción basada en la desviación de los puestos de PDMS con módulo elástico conocido y la geometría 11 (Figura 1).
- A su vez en el dispositivo de calentamiento de la máquina 2 h antes de la medición. Abra el suministro de gas y suministro electrónico del sistema de eje inmediatamente antes del análisis contracción.
- Para la grabación de la línea de base (punto de referencia en el análisis), colocar la placa de 24 pocillos con los técnicos en salud ambiental en EHT-medio en el instrumento de análisis EHT e iniciar el software de análisis de contracción según el manual de proveedores.
- Haga clic en la pestaña "Protocolo" en el panel de la derecha y entre la información pertinente respecto nombre del estudio, el usuario, especie, ceTipo II, edad, duración de la grabación y observaciones adicionales.
- Haga clic en la pestaña "Vista de cámara" en el panel izquierdo y empezar el modo en directo de la cámara con el modo de detección automática de la figura. Haga clic en la pestaña "Configuración" en el panel derecho andadjust la posición de la cámara con las coordenadas XYZ para cada pozo en el 24 pocillos plato. Asegúrese de que el EHT se encuentra en el centro de la ventana y en el enfoque de la cámara.
- Asegúrese de que la tapa de la placa de cultivo celular no es niebla, ya que esto perjudicar la figura reconocimiento y análisis de contracción.
NOTA: El algoritmo de reconocimiento cifra se basa en la detección de zonas de alto contraste y el seguimiento de su cambio de posición. En el software de reconocimiento de estas áreas cifra serán marcados con una cruz azul que se mueve con las contracciones de la EHT. - Asegúrese de que las posiciones de los cruces azules son en ambos extremos superior e inferior de los técnicos en salud ambiental y mover solamente a juego verticalmente las contracciones de los técnicos en salud ambiental (Figura 3B). Sposiciones de configuración ave de cada pozo presionando el botón de "Posición OK".
- Asegúrese de que la tapa de la placa de cultivo celular no es niebla, ya que esto perjudicar la figura reconocimiento y análisis de contracción.
- A continuación, haga clic en la pestaña "Parámetros" en el panel izquierdo. Los parámetros que se muestran aquí se definen los criterios por los cuales el software identifica un pico de contracción y lo marca con un cuadrado verde. Estos valores son muy importantes para la correcta identificación de los picos de contracción (Figura 3C) y no hay puntos de datos falsos (Figura 3E-F).
NOTA: Una lista de parámetros y ejemplos dependiente de la especie se representa en la Figura 3H. Para más detalles, consulte el manual del software. - Haga clic en la pestaña "automática" en el panel de la derecha e iniciar el análisis activando el botón "Inicio". El software se moverá secuencialmente de un pozo a los próximos, ficha contracciones EHT y calcular la fuerza durante la grabación (que aparece en la pestaña de "tiempo real" en el panel izquierdo). Al final del análisis, un informe pdf summarizing los resultados se generará automáticamente.
- Guardar y analizar el informe pdf el sistema genera para resumir los resultados.
- Monitorizar los parámetros contráctiles de medición repetida durante varios días. El EHT se incrementará en la fuerza de contracción hasta que se haya alcanzado una meseta (por lo general alrededor del día 15 del cultivo).
- La detección de drogas
- Preparar la solución de Tyrode libre de proteína de un día antes de la medición y equilibrar en placas de 24 pocillos (2 ml / pocillo) en la incubadora de cultivo celular (37 ° C, 7% de CO2, 40% de O 2) durante la noche: NaCl 120 mM, KCl 5,4 mM, 1 mM de MgCl2, 0,1-5 mM CaCl2, 0,4 mM NaH 2 PO 4, 22,6 mM NaHCO 3, glucosa 5 mM, 0,05 mM Na 2 EDTA, HEPES 25 mM. Añadir calcio hasta 1,8 mM o el determinado previamente [EC 50] para investigar los efectos inotrópicos positivos.
- Pesar y disolver el fármaco en DMSO y filtro estéril, si es necesario.Preparar 6 soluciones diferentes 1000x-sub-almacén (en DMSO) de la concentración de trabajo (por ejemplo, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100? M para el rango nanomolar respectiva).
- Diluir la acción correspondiente en las placas de Tyrode (2 l en cada pocillo de 2 ml) y mezclar completamente. Colocar las placas de nuevo en la incubadora hasta que se necesite.
- Iniciar la medición de línea de base mediante la adopción de la primera 24 placa de pocillos Tyrode llenas debajo de los electrodos del capó y la posición de carbono estériles en los pocillos. La transferencia de los bastidores de PDMS con los técnicos en salud ambiental colocados en la parte superior de los electrodos de carbono, cierre la tapa, poner la placa posterior en la incubadora y esperar un periodo de equilibrio de ~ 30 min.
- La transferencia de los técnicos en salud ambiental de la incubadora para el enclavamiento en el instrumento de análisis EHT. Cerrar el instrumento y registrar la contractilidad basal espontánea (20 s / EHT).
- Conectar los electrodos de carbono para el cable de estimulación y empezar la estimulación eléctrica de los técnicos en salud ambiental (2,5 V, 4 ms de duración del impulso, humana: ~ 1 Hz, de rata: ~ 2Hz, ratón: ~ 4 Hz). Grabar la línea de base "ritmo" (10 s / EHT). Asegúrese de que todos los técnicos en salud ambiental están debidamente estimulados. frecuencia de estimulación y la tensión puede variar en función de la línea celular a línea celular.
- Después de la grabación de línea de base, eliminar los técnicos en salud ambiental desde el instrumento y transferir los electrodos con los bastidores de PDMS en la parte superior, a la placa de 24 pocillos con la primera concentración de fármaco. Transferir el técnicos en salud ambiental de nuevo en el enclavamiento del instrumento de análisis EHT inmediatamente e incubar allí (incubación de medicamentos estándar tiempo, por ejemplo 20 min).
- Vuelva a conectar los cables de estimulación, ajuste el reconocimiento figura y registrar contracciones EHT que respondieron a la primera concentración del fármaco.
- Para las siguientes concentraciones de fármaco, repetir el paso 3.5.7 y 3.5.8 con los 24 pocillos de placas que contienen concentraciones de fármaco más altas.
- Guardar todas las grabaciones pdf. Compruebe cada grabación para el reconocimiento figura, el correcto posicionamiento de cuadrados verdes identificación de los picos de contracción y artefactos (véase 3.2.1 y la Figura 3
- Realizar análisis fuera de línea adicional si es necesario.
- Seleccione la respectiva ejecución de la base de datos "series" en el panel izquierdo, haga clic en "Seleccionar plazo". En la pestaña "Parámetros" de la izquierda, cambiar parámetros para el análisis de la contracción. A continuación, seleccione "análisis sin conexión" en la pestaña "fuera de línea" en el panel de la derecha para volver a analizar los videos.
- Para ajustar el reconocimiento figura y, por tanto, grabar un nuevo archivo de vídeo, seleccione "revisión de la muestra" después de ajustar el reconocimiento de la figura de la ficha "en tiempo real". NOTA: revisión de la muestra sólo se puede volver a analizar un pozo a la vez, mientras que el análisis fuera de línea puede aplicar nuevos parámetros para todos los pozos haciendo clic en el botón "Uso de parámetros en todos los pozos" en el panel de "parámetros" en la izquierda. Ambos tipos de análisis fuera de línea creará automáticamente nuevos archivos de datos y PDF que muestra los resultados.
- Analizar el experimento mediante la combinación de los resultados de la biológica replica y resumir los datos en curvas de respuesta a concentración para la frecuencia, la fuerza de contracción, el tiempo de contracción y el tiempo de relajación (Figura 5D) y / o de visualización gráfica de los picos de contracción media (Figura 5C).
NOTA: Los bastidores de PDMS y PTFE espaciador se pueden utilizar repetidamente (PDMS bastidores max 5 veces, y PTFE spacer sin fin.). Después del uso, limpiar manualmente con agua, hervir dos veces en agua desmineralizada y autoclave. Ser conscientes de los posibles efectos de arrastre, cuando se vuelva a utilizar los bastidores, como las drogas podrían ser absorbidos por el PDMS.
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Representative Results
Cardiaca Diferenciación y Preparación de EHT
HiPSC se expandieron en matriz de membrana basal factor de crecimiento reducido, se disoció con EDTA y cuerpos embrioides (EBS) formados en matraces de agitación durante la noche. Después de la inducción mesodérmica durante tres días, la diferenciación cardiaca se inició con el inhibidor de Wnt. Después de ~ 17 días de protocolo de diferenciación, EBs golpeando se disociaron en células individuales con colagenasa tipo II (Figura 1). Técnicos en salud ambiental se prepararon a partir cardiomiocitos recién aisladas con 1,0 x 10 6 células por 100! L tejido inmediatamente después de EB de disociación (Figura 2). Para la preparación de células congeladas (por ejemplo, proveedores comerciales), las células se descongelaron mediante resuspensión gota a gota en el medio y se resuspendieron en ECM después de la centrifugación. Dentro de 48 h, se observó latido espontáneo de células individuales microscópicamente en el EHT. Durante los próximos días, los cardiomiocitos se extienden longitudinalmente a lo largo de las líneas de fuerza del tejido, acoplados y formaron un EHT coherente de latir. Las deflexiones macroscópicamente visibles de los mensajes de PDMS se midieron con el instrumento de análisis EHT.
Análisis de la contracción
Análisis de EHT contractilidad se basó en la grabación de vídeo-óptico (Figura 3). Dentro del sistema, la placa de 24 pocillos con técnicos en salud ambiental se posicionó en el gas y la cámara de la incubadora de temperatura controlada con un techo de vidrio. Una cámara conectada a un XYZ-eje motorizado se coloca por encima de esta unidad, y XYZ coordenadas se define para cada EHT con un programa de software. El análisis de cada EHT se basa en el reconocimiento figura en los extremos superior e inferior del tejido. Un algoritmo de software automatizado analizado la contracciones EHT filmado y desarrollo de la fuerza calcula en base a la desviación de correos y elasticity / geometría de los puestos de PDMS (Figura 1) 11. Después de la determinación de los picos de acuerdo con criterios predefinidos, un informe resumido pdf parámetros de contractilidad para todos los técnicos en salud ambiental (Figura 2).
Medición de la estabilidad en el largo plazo
medición a largo plazo de técnicos en salud ambiental se realizó en el modo continuo con medición repetida automatizado cada 20 min. Análisis contracción no mostró cambios dependientes del tiempo (posterior a la prueba de tendencia lineal no fue significativa) en la fuerza de contracción, superando la frecuencia, T1 tiempo de contracción o tiempo de relajación T2 para hasta 20 h, lo que indica un alto nivel de estabilidad (Figura 4). Al igual que con todas las muestras biológicas sin embargo, los técnicos en salud ambiental muestran un cierto grado de variabilidad, como se esperaba para réplicas biológicas. El Coeficientes de Variación al principio y al final de measu largo plazoRe-Ment eran 7/13% para la fuerza, 12/6% para la frecuencia, 4/3% para el tiempo de contracción y 4/3% para el tiempo de relajación, respectivamente (n = 4). Esta variabilidad entre repeticiones biológica no es un artefacto de reconocimiento o análisis figura como los resultados para cada sola EHT son reproducibles y tienen una baja variabilidad (Figura 2).
La detección de drogas
la detección de drogas se realizó en solución de Tyrode libre de suero. curvas de respuesta de concentración acumulativa se generaron con una concentración máxima del vehículo DMSO de 0,1%. análisis de la contracción basal mostró muy poca irregularidad en la batalla contra el patrón y muy baja variabilidad entre las repeticiones. La exposición a la E4031 bloqueador de los canales hERG dio como resultado una prolongación significativa del tiempo de relajación (T2) a 10 nM y el patrón de latido irregular en concentraciones más altas (Figura 5). para frequencanálisis contracción controlada y, las mediciones se llevaron a cabo opcionalmente con la estimulación eléctrica utilizando electrodos de carbono.
Figura 1: diferenciación cardíaca. (A) humano indujo células madre pluripotentes. Barra de escala = 100 m. Cuerpos (B) embrioides en el comienzo de la diferenciación mesodérmica. Barra de escala = 100 m. Cuerpos (C) embrioides contratante al final de la diferenciación cardiaca. Barra de escala = 100 m. (D) humano modificado tejido del corazón. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Generación de EnginTejido cardíaco eered (EHT). (A) spacer PTFE. Estante (B) PDMS. A, (B) Escala bar = 1 cm (C) Vista superior de un pocillo de una placa de 24 pocillos con molde de colada en agarosa después de la eliminación del espaciador PTFE. (D) par de postes del bastidor PDMS posicionado en el molde de fundición. (E) La reconstitución mezcla pipeta en el molde de fundición y alrededor de los postes de PDMS. (F) recién generada EHT en el día 0, se transfirió a una nueva placa de cultivo con medio. (G) Remodelado EHT en el medio el día 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de contracción del tejido Engineered corazón (EHT). (A) EHTinstrumento de análisis con la cámara controlado por ordenador sobre el gas y la cámara de incubación de temperatura controlada con técnicos en salud ambiental en el plato de 24 pocillos de cultivo en la parte superior de un panel de LED. (B) Vista en vivo de un EHT durante el análisis con el software de análisis automatizado contracción. (C) patrón de contracción Ejemplar presentan la fuerza de contracción en el tiempo medido con 100 cuadros por segundo y ampliada pico contracción esquemática, que muestra la fuerza de análisis de los parámetros, el tiempo de contracción (T1), el tiempo de relajación (T2), la velocidad de contracción (CV), la velocidad de relajación ( RV, cifra que se ha reproducido de 7 y 27). DH: Parámetros para el análisis de la contracción. (D) Ejemplos de diferentes niveles de filtro (línea azul filtrada) que afectan al reconocimiento figura. Izquierda: Nivel de filtro = 0. Obsérvese que hay una línea azul filtrada es visible, pero sólo la traza original de color rojo. Nivel de filtro = 3, lo que indica reconocimiento / análisis ideal de th: Medioe Las crestas contracción. Derecha: Filtro nivel = 20. Nótese que las líneas azules filtradas son mucho menores que las trazas originales que indican análisis de los picos de contracción pobres. (E) Ejemplo de contracciones EHT arrítmicos analizados con un umbral de fuerza demasiado alta (izquierda) y umbral de fuerza inferior (derecha) con todos los picos reconocidos. (F) Ejemplos trazas de técnicos en salud ambiental expuestas al agonista del canal de sodio ATX-II que resulta en un tiempo de relajación prolongado con temprano después de las contracciones. Tenga en cuenta que el cuarto pico contracción en el panel de la izquierda no se reconoce (sin cuadrado verde) debido a un factor mínimo demasiado bajo. (G) Ejemplos de los picos de contracción con (panel de la derecha) y sin (panel derecho) curva rosa (primera derivada de la curva de contracción, la contracción y la velocidad de relajación). (H) Resumen de las recomendaciones de parámetros para murina y técnicos en salud ambiental humanos. Tenga en cuenta que estos parámetros podrían necesitar un ajuste como cambios en el patrón de contracción durante la exposición al fármaco (véase E,F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Control de tiempo Durante Long Term Medición de latido espontáneo Tissue Engineered Human Heart (EHT). Control de tiempo durante la medición a largo plazo de latido espontáneo tejido del corazón ingeniería humana (EHT). Técnicos en salud ambiental se colocaron en el instrumento de análisis EHT y se incubaron durante un período de 20 h. análisis de contracción automatizadas se realizaron cada 20 min con post-test no es significativa para la tendencia lineal (n = 4; datos representan la desviación estándar media +). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
t = "Figura 5" src = "/ files / ftp_upload / 55461 / 55461fig5.jpg" />
Figura 5: Efecto de hERG Bloqueador del canal de E4031 en Tissue Engineered Human Heart (EHT).
(A) patrón de contracción Ejemplar al inicio del estudio. (B) patrón de contracción Ejemplar después de la incubación en 300 nM E4031. (C) de pico media de contracción (n = 4) de técnicos en salud ambiental estimulados eléctricamente en la línea base (negro) y después de 30 min de incubación en 100 nM E4031 (rojo). Análisis con 100 cuadros por segundo. Curvas (D) de concentración-respuesta para E4031 en latido espontáneo técnicos en salud ambiental humanos. Tenga en cuenta el tamaño del efecto más pequeño en T2 prolongación en los técnicos en salud ambiental estimulados eléctricamente (C) frente a los técnicos en salud ambiental latido espontáneo (D). ANOVA de un factor de medidas repetidas, con post-test de Dunnett frente a la línea de base; * P <0,05; n = 4. Factor Z' 25 para la prolongación T2 a 300 nM E4031 es 0,75.pg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Humano | Rata | Ratón | |
| Células | 26.4x10 6 | 10.8x10 6 | 18.0x10 6 |
| 2xDMEM [l] | 147 | 147 | 147 |
| matriz de la membrana basal [l] | 264 | - | 264 |
| Y-27632 [l] | 2.6 | - | - |
| El fibrinógeno [l] | 66.8 | 66.8 | 66.8 |
| ECM [l] | ad 2640 | ad 2640 | ad 2640 |
Tabla 1: Esquema de pipeteo para Preparación de reconstitución de la mezcla durante 24 técnicos en salud ambiental humano, de rata y de ratón. la concentración de fibrinógeno es de 5 mg / ml para todos los técnicos en salud ambiental. Tenga en cuenta que la concentración de células es diferente para cada especie. Para técnicos en salud ambiental humanos, añadir matriz de membrana basal (por ejemplo, matrigel, ver Materiales Tabla) y el inhibidor de Rho-quinasa Y-27632 a la mezcla. Para técnicos en salud ambiental de ratón, añadir matriz de membrana basal. Dependiendo de la concentración inicial de la suspensión de células, añadir ECM adicional para alcanzar un volumen total de 2.640 l de mezcla de la reconstitución.
Complementario Figura 1: Fórmula de cálculo para la contracción Fuerza Basado en el poste de desviación 26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementaria Figura 2: Ejemplar Extracto de datos del Informe de Análisis La contracción del software.
Contracción picos de más de 20 s de tiempo registrados con 100 cuadros / s: la parte superior (rojo: la fuerza de contracción, de color rosa: la velocidad de contracción). Inferior: Analizado parámetro contracción que muestra mínimo, valor medio, máximo y la desviación estándar de los 18 picos de contracción analizados marcados con un cuadrado verde (parte superior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
tejido cardíaco ingeniería ofrece una opción valiosa para la caja de herramientas de la investigación cardiovascular. Técnicos en salud ambiental en el formato de 24 pocillos han demostrado valiosa para el modelado de la enfermedad 8, 14, Presentación de seguridad de medicamentos 7, 8, 10, 11, 15, o investigación cardiovascular básica 16, 17.
Modificaciones potenciales de los protocolos básicos EHT incluyen estudios sobre la interacción celular con mezclas definidas de los cardiomiocitos y los no cardiomiocitos 18 y mejora la poscarga 14. Aspectos importantes para la solución de problemas incluyen la calidad de la población de células de entrada y de la calidad de fibrinógeno. Si la formación de gel inicial es irregular o no lo suficiente para pegarse t compactoo mensajes de PDMS, o si el gel se degeneró rápidamente dentro de unos pocos días después de la fundición debido a la baja concentración de aprotinina, la generación de técnicos en salud ambiental no tendrá éxito.
Las siguientes limitaciones tienen que ser considerados. (I) El rendimiento en formato de 24 pocillos no se adapta bien para una configuración de cribado primario, pero es suficiente para una pantalla de confirmación secundario. (Ii) La lectura integrada de la fuerza, la cinética de la contracción y ritmo tienen baja especificidad, lo que hace difícil para enlazar los cambios en la fuerza para mecanismos moleculares específicos. (Iii) Mientras que el formato de cultivo 3D y el tramo impuesta por mensajes PDMS dobladas mejorar aspectos morfológicos y funcionales de la maduración, la falta de verdaderos discos intercalados, superando espontánea, y más bajo que las respuestas adrenérgicas normales indican que la maduración cardiaca total aún no se consigue con este protocolo. (iv) PDMS se ha demostrado para absorber diferentes fármacos a diferentes extender 19 y la concentrat eficaz realion en los técnicos en salud ambiental podría variar. Este sesgo puede ser más prominente en la toxicidad crónica estudia 15 de los que investigan agudos efectos de drogas 7, 8 y claramente depende del medicamento a la mano. Como consecuencia, cualquier rack PDMS expuesto a las drogas, debe desecharse después del uso y tendrá que ser tenido en cuenta cuando se analizan los datos de la absorción potencial de diferentes drogas. (v) Teniendo en cuenta el hecho de que se requieren 1x10 6 hiPSCs por EHT los costes por punto de datos son altas.
La importancia de este protocolo en comparación con el análisis ex vivo de la contractilidad del corazón es el potencial para trabajar en un sistema humano, la falta de experimental carrera hacia abajo, y la producción estandarizada de técnicos en salud ambiental que permite la creación de grandes estudios sobre fondos genéticos específicos (por ejemplo, modelos de enfermedades ). En comparación con otros sistemas de prueba hiPSC (matriz multi electrodo, impedancia), este sistema analizars fuerza contráctil como el parámetro fisiológico más importante de los cardiomiocitos en una estructura tridimensional y permite el cultivo bajo carga definida. contrato técnicos en salud ambiental regularmente y en fuerza estable, la frecuencia y el ritmo durante muchas horas y semanas, lo que permite mediciones y evaluación de la toxicidad crónica a largo plazo. análisis EHT se puede realizar bajo la estimulación eléctrica que es importante con respecto a la relación fuerza-frecuencia de la contracción muscular y su potencial influencia sobre los efectos de la droga. Con respecto al estado inmaduro de la hiPSC-CM, la estimulación eléctrica tiene el potencial para empujar las células hacia un fenotipo más maduro 20, 21 y podría ser incluido en el mantenimiento EHT. Además, el sistema de prueba EHT proporciona una alta lectura de contenido incluyendo todos los parámetros histológicos estándar, así como la bioquímica (RNA, DNA, aislamiento de proteínas) 11. futuras aplicaciones potenciales incluyen aspectos del desarrollo de fármacos (la validación de dianas, farmacología de seguridad) y el modelado de la enfermedad en particular en combinación con CRISPR / Cas9 generación mediada de los controles isogénicas.
Durante el mantenimiento de técnicos en salud ambiental y el rendimiento de las curvas de concentración-respuesta, es importante seguir cuidadosamente las instrucciones para los procedimientos de cultivo de células estériles para evitar contaminaciones fúngicas durante la transferencia de bastidores de PDMS entre las placas de 24 pocillos. El paso más crítico con EHT embargo, es el protocolo de diferenciación de cardiomiocitos. Para los técnicos en salud ambiental para formar coherentemente tiras de músculo de latir, la población de entrada tiene que consistir en al menos 60% cardiomiocitos. Afortunadamente, los protocolos de diferenciación se hicieron más robusto y eficiente con los años y los cardiomiocitos están fácilmente disponibles en el mercado por ahora. El papel de los no miocitos en el desarrollo de los tejidos del corazón ingeniería derivado de hiPSC no se entiende completamente, aún. Los experimentos con hiPSC-CM de alta pureza llevaron a sorprendentemente bueno EHTculo = "xref"> 7, pero la integración de otros tipos de células en el tejido se ha demostrado que mejora la función del tejido y podría empujar el fenotipo hacia una fisiología madura 22, 23, 24. A medida que los tejidos se generan en un pocillos de formato 24 con un millón de células por tejido, esta plataforma es todavía bastante caro. Alineándose con un formato de 96 pocillos se aspira, pero robustez hasta ahora sobrepasa a esta deficiencia. El protocolo presentado en este manuscrito es técnicamente muy robusto, con poca variabilidad entre las repeticiones. La variabilidad intra-lote es muy bajo para la cinética (media coeficiente de variación = 5%), y algo grande para la frecuencia de latido espontáneo (media coeficiente de variación 10%) y la fuerza de contracción (significa coeficiente de variación 17%). La técnica es muy robusto. A través de diferentes experimentadores, la eficiencia para generar técnicos en salud ambiental golpeando es> 90% de hidrogeles emitidos.
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Disclosures
IM, TE y AH son co-fundadores de EHT Technologies GmbH, Alemania.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Alessandra Moretti y Dennis Schade por su amable aportación de material. Reconocemos el gran apoyo del grupo de trabajo iPS y EHT en el Departamento de Farmacología y Toxicología Experimental de la UKE. El trabajo de los autores es apoyado por becas de la DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular) y el Ministerio de Educación alemán e Investigación (BMBF), la Fundación Alemana de Investigación (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), Centro Nacional británico para el reemplazo de refinamiento y reducción de animales en la investigación (NC3Rs Crack-otorgará 35.911 a 259.146), la Fundación británica del corazón RM / 13/30157, el Consejo Europeo de Investigación (Advanced Grant IndivuHeart), la Fundación alemana del corazón y la Freie und Hansestadt Hamburgo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 mL falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
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