Summary
Qui mostriamo la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano da cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) -derived cardiomiociti. Presentiamo un metodo per analizzare forza di contrazione e l'alterazione esemplare del modello di contrazione dal hERG inibitore canale E-4031. Questo metodo mostra elevato livello di resistenza e affidabilità screening di farmaci cardiaco.
Abstract
ingegneria tessuto cardiaco descrive tecniche per costituire tre tessuti ingegnerizzati genera forza dimensionali. Per l'attuazione di queste procedure in ricerca di base e lo sviluppo di farmaci preclinico, è importante sviluppare protocolli per la generazione e l'analisi automatizzata in condizioni standardizzate. Qui, presentiamo una tecnica per generare tessuto cardiaco Engineered (EHT) da cardiomiociti di specie differenti (ratto, topo, umane). La tecnica si basa sul complesso di fibrina gel contenente cardiomiociti dissociate tra polidimetilsilossano elastico (PDMS) posti in un formato a 24 pozzetti. Tridimensionali, EHTs forza generatrice costituiscono entro due settimane dopo la fusione. Questo procedimento consente la generazione di diverse centinaia EHTs settimana ed è tecnicamente limitato solo dalla disponibilità di cardiomiociti (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Valutazione delle contrazioni muscolari auxotonic viene eseguita in una camera di incubazione modificato con un meccaninterblocco ical per piastre da 24 pozzetti ed una telecamera posta sulla parte superiore di questa camera. Un software controlla una videocamera spostata su un sistema di assi XYZ a ciascun EHT. contrazioni EHT vengono rilevati da un algoritmo automatizzato figura riconoscimento, e la forza è calcolata sulla base accorciamento del EHT e la propensione elastica e geometria dei posti PDMS. Questa procedura permette di analisi automatica di un numero elevato di EHT in condizioni standardizzate e sterili. La rilevazione affidabile degli effetti della droga su cardiomiociti contrazione è cruciale per lo sviluppo di farmaci cardiaco e sicurezza farmacologica. Noi dimostriamo, con l'esempio della hERG inibitore canale E-4031, che il sistema EHT umano replica risposte farmacologiche sulla cinetica di contrazione del cuore umano, indicando che sia uno strumento promettente per lo screening sicurezza dei farmaci cardiaca.
Introduction
effetti collaterali cardiaci, come la sindrome del QT lungo indotta da farmaci hanno portato a ritiri dal mercato negli ultimi anni. Le statistiche indicano che circa il 45% di tutti i prelievi sono causa di effetti indesiderati sul sistema cardiovascolare 1. Questo fallimento della droga dopo il costoso processo di sviluppo e approvazione è lo scenario peggiore per le aziende farmaceutiche. reparti di ricerca e sviluppo, pertanto si concentrano sul rilevamento di tali effetti cardiovascolari indesiderati nella fase iniziale. Per preoccupazioni economiche ed etiche, gli sforzi per ridurre gli esperimenti sugli animali e sostituirli con nuovi test screening in vitro sono in corso.
Una serie di test stabiliti sono inclusi negli Stati Uniti Food and Drug Administration (FDA) e l'Agenzia europea per i medicinali (EMA) linee guida per la valutazione preclinica di effetti della droga proaritmici 2. La tecnologia di riprogrammazione delle cellule somatiche seguita dalla differenziazione delleindotte cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC) potenziato questo campo di ricerca 3. Esso offre ora la possibilità per lo screening di nuovi farmaci candidati su cardiomiociti umani in vitro ed evita problemi con differenze tra le specie. Protocolli di differenziamento cardiaco Recenti 4, 5 forniscono fornitura illimitata di cardiomiociti senza preoccupazione etica. Tuttavia, la misurazione della forza contrattile, il più importante e caratterizzato dal parametro vivo dei cardiomiociti, non è ben stabilita. Questo è legato alla relativa immaturità 6 dei cardiomiociti indotte umane staminali pluripotenti derivate da cellule (hiPSC-CM) rispetto al cardiomiociti adulti. Una possibile l'avanzamento è di ingegnere tessuto cardiaco 3-dimensionale da singole cellule 7 (tessuto cardiaco ingegnerizzato, EHT). Il protocollo si basa su EHT incorporare singolo murino o cardiomiociti umani 8 sup>, 9, 10 in fibrina idrogel tra due polidimetilsilossano flessibile (PDMS) posti 11 in formato a 24 pozzetti. Nel giro di pochi giorni i cardiomiociti iniziano a contrarsi spontaneamente come singole cellule e cominciano a formarsi le reti cellulari. Dopo 7-10 giorni, contrazioni macroscopiche di tutto il tessuto sono visibili. Durante questo processo la matrice extracellulare è rimodellato, che porta ad una diminuzione di diametro e lunghezza. L'accorciamento dei risultati EHT in flessione della PDMS caricare anche durante il riposo, sottoponendo cardiomiociti nel EHT sviluppo a carico continuo. EHTs continuano a svolgere le contrazioni muscolari auxotonic per diverse settimane. EHTs nell'uomo hanno dimostrato risposte a stimoli fisiologici e farmacologici che indicano la loro idoneità per lo screening di droga e la malattia di modellazione 7.
In questo manoscritto vi presentiamo un protocollo robusto e facile per i Generatisu EHT umana, e l'analisi automatizzata di contrattilità concentrazione cambiamenti a carico del pattern contrazione in presenza di inibitori del canale hERG.
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Protocol
NOTA: I seguenti passaggi descrivono un protocollo di coltura cellulare. Si prega di eseguire in condizioni sterili e utilizzare i media pre-riscaldato.
1. cardiaco Differenziazione dei hiPSC
- Coltivare la hiPSC
- Piastre cappotto 6 pozzetti (1 ml / pozzetto) o fiasche T75 (7 mL / fiasco) a matrice della membrana basale ridotto fattore di crescita (es geltrex, 1: 200; vedi tabella dei materiali) diluito in terreno Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) per 30 min a 37 ° C. Preparare FTDA mezzo 12 mescolando DMEM base / F-12 di media con 2 mM L-glutammina, 0,5% di penicillina / streptomicina, 5 mg / L transferrina, 5 ug / L di selenio, 0,1% di siero albumina umana, 1x lipide-mix, 5 mg / L di insulina, 50 nM dorsomorphin, 2,5 ng / mL activina A, 0,5 ng / mL umana TGFß1 e 30 ng / mL FGF2.
- HiPSC seme (~ 3 x 10 del 5/10 cm²) in terreno di coltura e FTDA a 37 ° C, 5% di CO 2, 21% O 2 con cambio medio giornaliero (Figura 1A). A 80% di confluenza, passaggio (1: 2-1: 6) con etilene diammina tetraacetico (EDTA; 0,5 mM; incubazione volta ~ 4 min).
- La formazione di corpi embrionali (EB)
- Coltivare hiPSC in fiasche T75 ad alta densità.
- Lavare palloni con cellule confluenti due volte con tampone fosfato senza calcio e magnesio (PBS) e incubare in 0,5 mM EDTA per ~ 10 min. Assicurarsi che le cellule non si staccano dal fondo del pallone.
- Rimuovere EDTA con pipetta di vetro, lavare le cellule con 10 ml di PBS, toccare flaconi al banco per staccare le cellule.
NOTA: Utilizzare raschietto cella se necessario. - Raccogliere le cellule in tubo da 50 ml, aggiungere ¼ di volume (per esempio 10 mL RMPI a 40 mL sospensione cellulare) RPMI 1640 (o qualsiasi altro mezzo standard contenente 1,8 mM di calcio) e centrifugare a 250 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare in terreno FTDA integrato con 4 mg / ml di alcool polivinilico (PVA) e10 pM Y27632 e contare le cellule in una camera di Neubauer.
- Riempire il matraccio filatore con la sospensione cellulare (30 x 10 6 cellule / 100 ml di mezzo supplementato con FTDA PVA e Y-27632; vedere il punto 1.2.2) e avviare EB formazione in fiasche filatore (regolare la velocità del rotore di agitatore magnetico a 40 rpm ) nell'incubatrice coltura cellulare (37 ° C, 5% di CO 2, 5% O 2) per tutta la notte.
- Coltivare hiPSC in fiasche T75 ad alta densità.
- differenziazione mesodermal
- Durante la formazione EB, coltura cellulare cappotto beute adatto per coltura in sospensione con tensioattivo non ionico (14 mL / T175) per una notte a 37 ° C.
- La mattina successiva, lavare fiaschi tensioattivi rivestite due volte con PBS (30 mL / T175). Aggiungere nuovo PBS e mantenere in incubatrice fino a quando necessario.
- Rimuovere la beuta filatore dall'incubatore.
NOTA: sospensione cellulare dovrebbe essere chiaro con piccole EBs macroscopicamente visibili (Figura 1B). - Trasferire 50 ml di sospensione di una vasca conica 50 mLE e lasciare EBs accontentarsi di 5-20 min.
- Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 7 ml di RPMI 1640 integrato con il 2% di PVA e 10 pM Y-27632. sospensione trasferimento ad un graduato 15 ml tubo conico e stima EB disponibilità (~ 50-100 microlitri).
- Trasferire il contenuto delle beute filatore per palloni T175 trattati e lasciarlo su cremagliera a V per sedimentazione fino a 20 min. Rimuovere il surnatante e lavare corpi embrionali come sopra indicato. Non riempire il pallone T175 con più di 200 ml di sedimentazione sarebbe troppo lungo. Se il volume iniziale pallone filatore superiore a 200 mL, raggruppati sospensione EB a diverse fiasche T175 e unire nuovamente EBs dopo il lavaggio.
- Rimuovere mezzo di lavaggio e risospendere in terreno per la differenziazione del mesoderma, cioè RPMI integrato con 4 mg / mL PVA, 0,5% di penicillina / streptomicina, 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 0,05% di siero umano albumina, 5 ug / ml di transferrina, 5 ng / mL selenito di sodio, 0,1% della miscela lipidica, 250 uM fosfo-ascorbato, 10 uM Y-27632, 10 ng / mL morphogenic proteina ossea-4 (BMP-4), e 3 ng / mL activina A, 5 ng / mL FGF2 stabile.
- Rimuovere PBS da fiasche T175 tensioattivi rivestite e riempire con sospensione cellulare (200 microlitri EBS in 40 mL). Utilizzare palloni più piccoli per il volume più piccolo EB.
- Coltivare EBS in sospensione per tre giorni (37 ° C, 5% di CO 2, 5% O 2). Scambio 50% del mezzo (stessa composizione nella fase 1.3.7) ogni giorno (cremagliera sedimentazione a V utilizzo). Preparare mezzo fresco ogni giorno prima dell'alimentazione.
- differenziazione cardiaca
- Preparare nuovi vasi tensioattivi rivestite il giorno prima e gestire come sopra (1.3.2).
- Dopo tre giorni di induzione di mesoderma, lasciate EBs accontentarsi di un massimo di 5 min a cremagliera sedimentazione. Rimuovere la maggior parte del mezzo e lavare con RPMI 1640 integrato con 0,5% di penicillina / streptomicina e 10 mM HEPES.
- Trasferimento 10 ml di sospensione EB al laureato15 ml tubo e stima del volume EB dopo la sedimentazione.
- Risospendere EBs attentamente in terreno di differenziamento cardiaco costituito da RPMI 1640 integrato con 0,5% di penicillina / streptomicina, 10 mM HEPES, 0,05% albumina di siero umano, 5 ug / ml di transferrina, 5 ng / mL di sodio selenito, 0,1% della miscela lipidica, 250 uM fosfo -ascorbate, 1 pM Y-27632, 100 nM Wnt-inibitore DS-I-7 13.
- Trasferimento EBS alle nuove fiasche di coltura cellulare tensioattivi rivestite (~ 200 microlitri EBS in 46 mL / T175).
- Incubare per tre giorni (37 ° C, 5% di CO 2, O 2 21%) con il 50% variazione media (tessitura media vedere fase 1.4.4) del secondo e terzo giorno. Non modificare il medium entro le prime 48 ore.
- Incubare in mezzo costituito da RPMI 1640 supplementato con 500 mM 1-tioglicerolo, 10 mM HEPES, 0,5% di penicillina / streptomicina, 1 pM Y-27632, 2% supplemento coltura delle cellule neurali senza siero (es B27) con insulina, 100 nM Wnt , inibitore DS-I-7 con cambio giornaliero del 50% medio per i prossimi quattro giorni. EBs dovrebbero iniziare battere entro questo periodo.
- Dopo una settimana di differenziazione cardiaca, passare al medesimo mezzo senza inibizione Wnt e con supplemento coltura delle cellule neurali senza siero. Cambiare il 50% della media tutti i giorni, tranne che per il primo giorno.
- La dissociazione dei cardiomiociti umani
NOTA: Dopo due settimane di protocollo di differenziazione, EBS dovrebbe mostrare contrazioni spontanee (Figura 1C). In tal caso, avviare la dissociazione e preparare la soluzione collagenasi.- Preparare una soluzione di collagenasi pesata e risolvendo 200 U / ml in soluzione salina bilanciata priva di calcio Hanks' senza calcio / magnesio (HBSS) e aggiungere 1 mM HEPES, 10 uM Y-27632, 30 uM sulfonamide N-benzil-p-toluene ( BTS). Sterilizzare mediante filtrazione (filtro da 0,2 micron) e aliquote conservare a -20 ° C. Scongelare aliquote a 4 ° C durante la notte.
- Settle EBS su rack di sedimentazione,medio aspirare e sostituirlo con 20-25 ml preriscaldata HBSS. Ripetere questa fase di lavaggio una volta di più.
- Aspirare HBSS e sostituirlo con soluzione di collagenasi pre-riscaldato (15 mL / T175). Incubare per 4 ore in incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% di CO 2, 21% O 2).
- Preparare tampone bloccante con DMEM integrato con 1% di penicillina / streptomicina e DNasi (12 ug / ml).
- Toccare le fiasche di coltura cellulare in panchina, dissociato EBs dovrebbe disintegrarsi e cadere a pezzi (in caso contrario, aumentare il tempo di incubazione). sospensione cellulare delicatamente triturate e trasferire in una provetta conica da 50 ml. Lavare palloni con tampone di bloccaggio (15 mL / T175) e trasferimento a tubo.
- Centrifugare per 10 min a 100 x g. Risospendere le cellule in DMEM caldo, triturate e contare le cellule.
2. Generazione di ingegneria tessutale Cuore (EHT)
- Autoclave disponibili in commercio cremagliere PDMS e Polytetrafluorethylene distanziatori (PTFE) (vedi Materiali eAttrezzature foglio di calcolo; Figura 2) e preparare le seguenti soluzioni in condizioni sterili, un giorno prima generazione EHT.
- Preparare 2% agarosio mediante pesatura e dissoluzione in volume appropriato di PBS, autoclave, immediatamente conservare a 60 ° C.
- Preparare aprotinina (33 mg / mL) di pesatura e dissoluzione in volume appropriato di aqua iniectabilia pubblicitarie, filtro sterile (filtro da 0,22 micron), aliquota e conservare a -20 ° C.
- Preparare fibrinogeno (200 mg / ml) sciogliendo fibrinogeno sterile in volume appropriato di sterile 0,9% NaCl (tiepida), aliquota e conservare a -20 ° C.
- Preparare trombina (100 U / ml) sciogliendo trombina sterile in tre parti PBS sterile e 2 parti iniectabilia ad aqua, aliquote di 3 ml di tubetti e conservare a -20 ° C.
- Preparare 10x DMEM sciogliendo 670 mg 10x DMEM polvere in 5 mL iniectabilia aqua pubblicitarie, filtrata sterile e conservare a 4 ° C.
- Preparare 2x DMEMmiscelando 2 mL 10x DMEM con 2 mL di siero di cavallo inattivato al calore, 0,2 mL di penicillina / streptomicina e 5,8 mL iniectabilia aqua pubblicitarie, filtrata sterile e conservare a 4 ° C.
- Preparare EHT-colata medio (ECM) miscelando DMEM con 10% di siero fetale inattivato al calore vitello, 1% di penicillina / streptomicina e 1% di L-glutammina (200 mM), conservare a 4 ° C.
- Preparare stampi da fonderia in piastre da 24 pozzetti pipettando 1,6 mL agarosio caldo (2%, PBS) e ponendo il distanziatore PTFE (Figura 2A) nei pozzetti.
NOTA: Posizionare spacer subito dopo pipettando in un massimo di 8 pozzetti - agarosio solidifica molto veloce. Non lasciare l'agarosio a temperatura ambiente per più di 5 minuti. - Dopo la solidificazione agarosio (~ 10 min, agarosio girerà opaco), rimuovere i distanziali PTFE (Figura 2C) e posizionare i PDMS cremagliere (Figura 2B) negli stampi di colata in modo tale che coppie di perni di PDMS raggiungono in ciascuno stampo (Figura 2D).
- Preparare 110% del volume stimato di mix ricostituzione in un fondo rotondo tubo da 15 ml a 24 ice.For EHTs, Pipetta mix ricostituzione elencate nella Tabella 1 per cardiomiociti umani, ratto o il topo, rispettivamente (10% in più è incluso).
NOTA: concentrazione cellulare del mix ricostituzione è diverso per umana (10 x 10 6 cellule / ml), ratto (4.1 x 10 6 cellule / ml) e mouse (6.8 x 10 6 cellule / ml) EHTs. A seconda della concentrazione della sospensione cellulare, aggiungere ulteriori ECM ad un volume finale di 2.640 ml. Il fibrinogeno deve essere tiepida per il pipettaggio. Lentamente riempire la punta della pipetta e non toccare la superficie del mix ricostituzione freddo con la pipetta fibrinogeno contenenti quando si aggiunge al mix fibrinogeno ricostituzione - la viscosità del fibrinogeno nel puntale aumenterebbe immediatamente. - Triturare il mix ricostituzione 10 - 15 volte con una pipetta sierologica fino a quando il coagulo di fibrinogeno si scioglie. Controllare il mix ricostituzione nella pipetta per l'omogeneità.
- Per ogni EHT, pipetta 100 microlitri della miscela ricostituzione in un'aliquota trombina (3 ml in tubo da 200 ml), miscelare e pipettare il composto nella agarosio-slots più rapidamente possibile (figura 2E). Utilizzare una nuova punta filtro per ogni EHT. Risospendere il mix ricostituzione (triturazione con sierologica pipetta 5-10 volte) dopo ogni 8 EHTs.
- Una volta che tutti gli slot sono riempiti con miscela ricostituzione, chiudere il coperchio del piatto di coltura cellulare e incubare a 37 ° C, 7% di CO 2 per 2 h.
- Rimuovere la piastra dall'incubatore e posto sotto cappa sterile. Coprire ogni pozzetto con una piccola quantità di mezzo (es DMEM, circa 200 - 500 microlitri), agitare delicatamente la piastra e incubare nuovamente a 37 ° C per almeno 10 min. L'aggiunta di DMEM faciliterà la cancellazione dal gel di fibrina da stampi di fusione agarosio.
- Rimuovere accuratamente i rack PDMS dagli stampi di colata agarosio e trasferirli alla piastra 24 pozzetti medio-riempita (Figura 2F). Porre la capsula posteriore nell'incubatrice (37 ° C, 7% di CO 2, il 40% O 2 per EHTs umano e di ratto, 21% O 2 per EHTs topo) e mangimi lunedì, mercoledì e venerdì con appena preparato EHT-medie. EHTs dovrebbero mostrare contrazioni spontanee deviatori montanti delle scaffalature PDMS 7-10 giorni dopo il getto (Figura 1D, 2G).
- Per topo EHTs aggiungono 25 ug / mL di βDarabinofuranoside 5-citosina di terreno di coltura per 48 h per limitare la proliferazione dei fibroblasti.
Analisi 3. Contrazione
NOTA: L'analisi contrazione si basa suVideo-ottico di registrazione in uno strumento di analisi EHT disponibile in commercio (vedi Tabella materiali). L'unità centrale di tale strumento è una camera di incubazione (Figura 3A). Il software fornito con lo strumento calcola forza di contrazione in base flessione delle PDMS post con noti modulo elastico e geometria 11 (figura complementare 1).
- Accendere il dispositivo di riscaldamento della macchina 2 h prima della misurazione. Attivare fornitura gas ed elettronica del sistema di assi immediatamente prima dell'analisi contrazione.
- Per registrazione di base (punto di riferimento per l'analisi), collocare il 24-a micropiastre con le EHTs in EHT-medio nello strumento di analisi EHT e avviare il software di analisi contrazione secondo il manuale fornitore.
- Fare clic sulla scheda "Protocol" sul pannello di destra e inserire le informazioni utili per quanto riguarda il nome dello studio, utente, specie, cetipo II, l'età, la lunghezza della registrazione e osservazioni aggiuntive.
- Fare clic sulla scheda "Vista Camera" sul pannello di sinistra e avviare la modalità Live telecamera con modalità di rilevamento figura automatica. Scegliere la scheda "Configurazione" sul pannello di destra andadjust la posizione della fotocamera con il xyz coordinate per ciascun pozzetto in 24-ben piatto. Assicurarsi che l'EHT si trova al centro della finestra e nella messa a fuoco della fotocamera.
- Assicurarsi che il coperchio del piatto coltura cellulare non è nebbia per non comprometterne il riconoscimento figura e l'analisi contrazione.
NOTA: L'algoritmo figura riconoscimento si basa sulla rilevazione aree ad alto contrasto e il controllo della loro cambiamento di posizione. Nel software queste aree di riconoscimento figura saranno contrassegnati con una traversa blu che si muove con le contrazioni del EHT. - Assicurarsi che le posizioni delle croci blu sono ad entrambe le estremità superiore e inferiore dei EHTs e muovendo solo verticalmente corrispondere le contrazioni dei EHTs (Figura 3B). Sposizioni di impostazione ave di ogni pozzetto premendo il tasto "posizione ok".
- Assicurarsi che il coperchio del piatto coltura cellulare non è nebbia per non comprometterne il riconoscimento figura e l'analisi contrazione.
- Avanti, fare clic sulla scheda "Parametri" sul pannello di sinistra. I parametri visualizzati qui definiscono i criteri con cui il software identifica una contrazione di picco e segna con un quadrato verde. Questi valori sono molto importanti per la corretta identificazione dei picchi di contrazione (Figura 3C) e senza punti di dati falsi (Figura 3E-F).
NOTA: un elenco di specie parametri dipendenti ed esempi è illustrato in Figura 3H. Per ulteriori informazioni, si prega di consultare il manuale del software. - Fare clic sulla scheda "Automatico" sul pannello di destra e di avviare l'analisi attivando il pulsante "Start". Il software si sposterà in sequenza da un bene per i prossimi, registrare EHT contrazioni e calcolare la forza durante la registrazione (visualizzato nella scheda "in tempo reale" sul pannello di sinistra). Al termine dell'analisi, un resoconto PDF summarizing i risultati verrà generato automaticamente.
- Salvare e analizzare il pdf segnalare il sistema generato per riassumere i risultati.
- Monitorare i parametri contrattili di misurazione ripetuta per diversi giorni. L'EHT aumenterà in forza di contrazione fino a quando non ha raggiunto un plateau (solitamente intorno al giorno 15 della cultura).
- lo screening di stupefacenti
- Preparare proteina soluzione di Tyrode libero un giorno prima misurazione ed equilibrare in piastre da 24 pozzetti (2 mL / pozzetto) in incubatrice coltura cellulare (37 ° C, 7% di CO 2, il 40% O 2) durante la notte: 120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0,1-5 mM CaCl 2, 0.4 mM NaH 2 PO 4, 22,6 mM NaHCO 3, 5 mM di glucosio, 0,05 mM Na 2 EDTA, 25 mM HEPES. Aggiungere il calcio fino a 1,8 mm o precedentemente determinato [CE 50] per indagare gli effetti inotropi positivi.
- Pesare e sciogliere il farmaco in DMSO e filtrata sterile, se necessario.Preparare 6 diverse soluzioni 1000x-sub-archivi (in DMSO) della concentrazione di lavoro (ad esempio, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 pM per il rispettivo nanomolare).
- Diluire il rispettivo magazzino nelle piastre Tyrode (2 ml ciascuna 2 mL pozzetto) e miscelare accuratamente. Posizionare le piastre di nuovo in incubatrice fino a quando necessario.
- Avviare la misurazione basale prendendo la prima 24 a micropiastre Tyrode-riempite sotto il cofano e la posizione carbonio sterili elettrodi nei pozzetti. Trasferire le cremagliere PDMS con EHTs posti sopra elettrodi di carbonio, chiudere il coperchio, mettere la piastra posteriore nell'incubatrice e attendere per un periodo di equilibrazione di circa 30 min.
- Trasferire i EHTs dal termostato al blocco nello strumento di analisi EHT. Chiudere lo strumento e registrare contrattilità basale spontanea (20 s / EHT).
- Collegare gli elettrodi di carbonio per il cavo di stimolazione e inizia la stimolazione elettrica delle EHTs (2,5 V, 4 ms durata dell'impulso, umano: ~ 1 Hz, ratto: ~ 2Hz, mouse: ~ 4 Hz). Registrare la linea di base "ritmo" (10 s / EHT). Assicurarsi che tutte le EHTs siano adeguatamente stimolati. frequenza di stimolazione e la tensione può variare da linea cellulare alla linea cellulare.
- Dopo registrazione di base, rimuovere i EHTs dallo strumento e trasferire gli elettrodi con le cremagliere PDMS in alto, al 24 pozzetti piastra con la prima concentrazione di farmaco. Trasferire l'EHTs nuovo sul blocco dello strumento di analisi EHT immediatamente e incubare lì (incubazione farmaco standard di tempo ad esempio 20 min).
- Ricollegare i cavi di stimolazione, regolare riconoscimento figura e registrare contrazioni EHT rispondono alla prima concentrazione di farmaco.
- Per le seguenti concentrazioni di farmaco, ripetere passaggio 3.5.7 e 3.5.8 con le piastre da 24 pozzetti contenenti concentrazioni di farmaco più elevate.
- Salvare tutte le registrazioni in formato pdf. Controllare ogni registrazione di riconoscimento figura, il corretto posizionamento di quadrati verdi identificare picchi di contrazione e artefatti (vedi 3.2.1 e la Figura 3
- Eseguire l'analisi offline supplementare se necessario.
- Scegli la rispettiva corsa dalla banca dati "corre" sul pannello di sinistra cliccando su "selezionare Esegui". Nella scheda "Parametri" sulla sinistra, cambiare il parametro per l'analisi contrazione. Ora scegliere "l'analisi non in linea" nella scheda "Offline" sul pannello di destra per rianalizzare i video.
- Per regolare il riconoscimento figura e quindi registrare un nuovo file video, scegliere "recensione campione" dopo aver regolato il riconoscimento figura nella scheda "in tempo reale". NOTA: recensione del campione può rianalizzare un solo bene alla volta, mentre l'analisi offline può applicare nuovo parametro per tutti i pozzetti facendo clic sul pulsante "Utilizzare il parametro su tutti i pozzetti" nel pannello "Parametri" sulla sinistra. Entrambi i tipi di analisi non in linea creeranno automaticamente nuovi file di dati e pdf visualizzazione dei risultati.
- Analizzare l'esperimento combinando i risultati della Biological replica e sintetizzare i dati delle curve concentrazione-risposta per la frequenza, la forza di contrazione, tempo di contrazione e tempo di rilassamento (Figura 5D) e / o visualizzazione grafica di picchi contrazione media (Figura 5C).
NOTA: deposito PDMS e PTFE distanziatore può essere usato ripetutamente (PDMS rack max 5 volte, e PTFE distanziale all'infinito.). Dopo l'uso, pulire manualmente con acqua, bollire due volte in acqua demineralizzata e autoclave. Essere consapevoli dei potenziali effetti di riporto, quando ri-utilizzando gli scaffali, come farmaci potrebbero essere assorbiti dai PDMS.
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Representative Results
Cardiaca Differenziazione e preparazione di EHT
HiPSC sono state estese su matrice membrana basale fattore di crescita ridotta, dissociata con EDTA e corpi embrionali (EBS) formate in fiasche filatore notte. Dopo l'induzione mesodermal per tre giorni, differenziazione cardiaca è stato avviato con l'inibitore Wnt. Dopo ~ 17 giorni di protocollo di differenziazione, EBS battendo state dissociate in singole cellule con collagenasi di tipo II (Figura 1). EHTs sono stati preparati da cardiomiociti isolati a fresco con 1,0 x 10 6 cellule per 100 microlitri tessuto immediatamente dopo EB dissociazione (Figura 2). Per la preparazione di cellule congelate (es fornitori commerciali), le cellule sono state scongelate da risospensione goccia a goccia in media e risospese in ECM dopo centrifugazione. Entro 48 ore, battito spontaneo di singole cellule è stato osservato al microscopio nel EHT. Nei prossimi giorni, cardiomiociti distribuite longitudinalmente lungo le linee di forza del tessuto, accoppiati e ha formato un EHT coerente battere. Le flessioni macroscopicamente visibili dei messaggi PDMS sono state misurate con lo strumento di analisi EHT.
Analisi contrazione
Analisi del EHT contrattilità era basata su registrazione video-ottico (Figura 3). All'interno del sistema, la piastra 24 pozzetti con EHTs stata posizionata nel gas ea camera di incubazione a temperatura controllata con un tetto di vetro. Una telecamera collegata ad un motore XYZ-asse è stato posizionato sopra l'unità, e XYZ coordinate sono state definite per ogni EHT con un programma software. Analisi di ogni EHT era basata sul riconoscimento figura alle estremità superiore e inferiore del tessuto. Un algoritmo software automatizzato analizzato le contrazioni EHT filmati e sviluppo della forza calcolata riferiscono al deflessione postale e elasticity / geometria dei montanti PDMS (figura complementare 1) 11. Dopo la determinazione di picchi secondo criteri predefiniti, un resoconto PDF sintetizzato parametri di contrattilità per tutti EHTs (Figura 2) complementare.
Stabilità in misura a lungo termine
misurazione lungo termine di EHTs è stata eseguita in modo continuo con automatizzata misurazione ripetuta ogni 20 min. Analisi contrazione ha mostrato variazioni dipendenti dal tempo (test post per il trend lineare è stato non significativo) in forza di contrazione, battendo frequenza, tempo T1 contrazione o tempo di rilassamento T2 per un massimo di 20 ore, indicando un elevato livello di stabilità (Figura 4). Come per ogni campione biologico però, i EHTs mostrano un certo livello di variabilità, come previsto per repliche biologiche. La variazione coefficienti all'inizio e alla fine di measu lungo terminerement erano 7/13% per forza 12/6% per la frequenza, 4/3% per tempo di contrazione e 4/3% per tempo di rilassamento, rispettivamente (n = 4). Questa variabilità tra repliche biologiche non è un artefatto di riconoscimento figura o analisi i risultati per ogni singolo EHT sono riproducibili ed hanno una bassa variabilità (Figura complementare 2).
screening di stupefacenti
lo screening di stupefacenti è stata eseguita in soluzione di Tyrode senza siero. curve di risposta alla concentrazione cumulativi sono stati generati con una concentrazione massima del veicolo di DMSO del 0,1%. Analisi contrazione basale ha mostrato molto poco irregolarità nel battere modello e molto bassa variabilità tra le repliche. L'esposizione al hERG antagonista E4031 determinato un prolungamento significativo del tempo di rilassamento (T2) a 10 nM e modello battito irregolare a concentrazioni più elevate (Figura 5). per frequencanalisi contrazione controllata y, le misure sono state eseguite opzionalmente con stimolazione elettrica usando elettrodi di carbonio.
Figura 1: differenziazione cardiaca. (A) umano indotto cellule staminali pluripotenti. bar scala = 100 pm. Corpi (B) embrionali all'inizio della differenziazione mesodermal. bar scala = 100 pm. Corpi (C) embryoid contraente alla fine della differenziazione cardiaca. bar scala = 100 pm. (D) umana ingegnerizzato tessuto cardiaco. bar scala = 1 mm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Generazione di EnginTessuto cardiaco eered (EHT). (A) distanziale PTFE. Rack (B) PDMS. A, (B) Scala bar = 1 cm (C) Vista superiore su un pozzo di un-ben piastra 24 con colata stampo in agarosio dopo la rimozione del distanziatore PTFE. (D) Coppia di colonnine dal rack PDMS posizionato nello stampo di colata. (E) Ricostituzione mix pipettati nello stampo di colata e in tutto i posti PDMS. (F) appena generato EHT al giorno 0, trasferito in un piatto di coltura con terreno. (G) Ristrutturato EHT in media al giorno 15. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi Contrazione di ingegneria tessutale Cuore (EHT). (A) EHTstrumento di analisi con fotocamera controllato dal computer sopra il gas e la camera di incubazione a temperatura controllata con EHTs in piatto da 24 pozzetti cultura in cima ad un pannello a LED. (B) Live view di un EHT durante l'analisi con il software automatizzato di analisi contrazione. (C) modello contrazione esemplare visualizzazione forza di contrazione nel tempo misurato con 100 fotogrammi al secondo e ingrandita contrazione di picco schematica, mostrando la forza analisi parametro, tempo di contrazione (T1), tempo di rilassamento (T2), velocità di contrazione (CV), velocità di rilassamento ( RV, questa figura è stato ristampato da 7 e 27). DH: Parametri per l'analisi contrazione. (D) Esempi di diversi livelli di filtro (blu linea filtrato) che interessano il riconoscimento figura. A sinistra: Livello di filtro = 0. Si noti che nessuna linea filtrato blu è visibile, ma solo la traccia originale rosso. Livello di filtro = 3, indicando l'ideale di riconoscimento / analisi dei th: Mediopicchi di contrazione e. A destra: Filtro livello = 20. Si noti che le linee filtrati blu sono molto più piccoli rispetto alle tracce originali che indicano scarsa analisi contrazione di picco. (E) Esempio di aritmici contrazioni EHT analizzati con una soglia di forza troppo elevata (a sinistra) e soglia di forza inferiore (a destra) con tutti i picchi riconosciuti. (F) Esempi tracce di EHTs esposti al sodio canale agonista ATX-II risultante in un tempo di rilassamento prolungato con presto dopo contrazioni. Si noti che la quarta contrazione di picco sul pannello di sinistra non è riconosciuto (nessun quadratino verde) a causa di un fattore minimo troppo basso. (G) Esempi di picchi di contrazione con (pannello destro) e senza (pannello destro) curva rosa (derivata prima della curva contrazione, contrazione e rilassamento velocità). (H) Sintesi delle raccomandazioni dei parametri per murine e umane EHTs. Si noti che questi parametri potrebbero aver bisogno di regolazione come i cambiamenti di pattern contrazione durante l'esposizione al farmaco (vedi E,F). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Tempo di controllo durante la Long Term Misura della Spontaneamente Battere ingegneria dei tessuti umani Cuore (EHT). Controllo del tempo durante la misurazione a lungo termine di spontaneamente battere tessuto cardiaco ingegnerizzato umano (EHT). EHTs stati posizionati nello strumento di analisi EHT e incubate per un periodo di 20 ore. analisi di contrazione automatizzate sono state effettuate ogni 20 minuti con non significativo post-test per il trend lineare (n = 4; dati rappresentano media + deviazione standard). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
t = "Figura 5" src = "/ files / ftp_upload / 55461 / 55461fig5.jpg" />
Figura 5: Effetto della hERG-antagonista E4031 su ingegneria dei tessuti umani Cuore (EHT).
(A) modello contrazione esemplare al basale. (B) modello contrazione esemplare dopo incubazione a 300 nM E4031. (C) contrazione di picco media (n = 4) di EHTs stimolati elettricamente al basale (nero) e dopo 30 minuti di incubazione a 100 nM E4031 (rosso). Analisi con 100 fotogrammi al secondo. Curve (D) concentrazione-risposta per E4031 a battere spontaneamente EHTs umani. Notare la dimensione minore effetto in T2 prolungamento nelle EHTs stimolate elettricamente (C) rispetto al EHTs spontaneamente battenti (D). ANOVA, misure ripetute con post-test di Dunnett vs basale; * P <0.05; n = 4. Fattore Z' 25 per prolungamento T2 a 300 nM E4031 è 0,75.pg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Umano | Ratto | Topo | |
| cellule | 26.4x10 6 | 10.8x10 6 | 18.0x10 6 |
| 2xDMEM [ml] | 147 | 147 | 147 |
| matrice membrana basale [ml] | 264 | - | 264 |
| Y-27632 [ml] | 2.6 | - | - |
| Il fibrinogeno [ml] | 66.8 | 66.8 | 66.8 |
| ECM [ml] | annuncio 2640 | annuncio 2640 | annuncio 2640 |
Tabella 1: Schema per pipettaggio Priparazione di Ricostituzione Mix per 24 EHTs umani, ratto e nel topo. concentrazione di fibrinogeno è 5 mg / mL per tutti EHTs. Si noti che la concentrazione cellulare è diverso per ciascuna specie. Per EHTs umani, aggiungere matrice membrana basale (es matrigel, vedi Materiali Tavolo) e inibitore della Rho-chinasi Y-27632 alla miscela. Per EHTs del mouse, aggiungere matrice membrana basale. A seconda della concentrazione iniziale della sospensione cellulare, aggiungere ulteriori ECM per raggiungere un volume totale di 2.640 microlitri miscela ricostituzione.
Figura supplementare 1: Formula di calcolo per la contrazione della forza Basato su Post Flessione 26. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura integrativa 2: esemplare estratto dati dal Analysis Report Contrazione del Software.
Picchi di contrazione più di 20 s di tempo registrato con 100 immagini / s: Top (rosso: forza di contrazione; rosa: velocità di contrazione). Bottom: analizzata parametro contrazione mostrando minimo, valore massimo medio e la deviazione standard dei 18 analizzati picchi di contrazione contrassegnate con un quadrato verde (in alto). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
tessuto cardiaco ingegnerizzato offre una valida opzione per la cassetta degli attrezzi della ricerca cardiovascolare. EHTs nel formato a 24 pozzetti sono dimostrati utili per malattia modellazione 8, 14, della sicurezza del farmaco 7, 8, 10, 11, 15, o ricerca cardiovascolare di base 16, 17.
Potenziali modifiche dei protocolli di base EHT includono studi sulle interazioni cellulari con miscele definite di cardiomiociti e non cardiomiociti 18 e valorizzazione afterload 14. Aspetti importanti per la risoluzione dei problemi comprendono la qualità della popolazione cella di input e la qualità del fibrinogeno. Se la formazione di gel iniziale è irregolare o non abbastanza da attaccare t compattoo post PDMS, o se il gel è rapidamente degenerata entro pochi giorni dopo la colata a causa di bassa concentrazione di aprotinina, generazione EHTs non sarà successo.
Le seguenti limitazioni devono essere considerati. (I) La velocità in formato a 24 pozzetti non è adatto per una configurazione screening primario, ma è sufficiente per uno schermo di conferma secondaria. (Ii) La lettura integrata di forza, la cinetica di contrazione e ritmo hanno una bassa specificità, che rende difficile collegare modifiche vigenti ai meccanismi molecolari specifici. (Iii) Mentre il formato cultura 3D e il tratto imposto dal PDMS piegate messaggi migliorare aspetti morfologici e funzionali di maturazione, la mancanza di veri dischi intercalati, battito spontaneo e inferiore normali risposte adrenergici indicano che la maturazione cardiaco completo non è ancora raggiunto con questo protocollo. (iv) PDMS ha dimostrato di assorbire farmaci diversi a vari estendere 19 e l'effettiva efficacia concentrationi sulle EHTs può variare. Questo pregiudizio potrebbe essere più prominente nella tossicità cronica studia 15 di quelli investigare gli effetti acuti della droga 7, 8 e chiaramente dipende il farmaco a portata di mano. Di conseguenza, qualsiasi rack PDMS esposta ai farmaci deve essere eliminata dopo l'uso e dovrà essere preso in considerazione quando si analizza i dati del potenziale assorbimento di diversi farmaci. (v) Dato che 1x10 6 hiPSCs sono richiesti per EHT i costi per punto dati sono elevati.
L'importanza di questo protocollo rispetto a ex vivo dell'analisi cuore contrattilità è la possibilità di lavorare in un sistema umano, la mancanza di sperimentazione run-down, e la produzione standardizzata di EHTs che permette la creazione di ampi studi su specifici background genetico (ad esempio modelli di malattia ). In confronto ad altri sistemi di test hiPSC (Multi sistema di elettrodi, impedenza), questo sistema analizzares forza contrattile come il più importante parametro fisiologico dei cardiomiociti in una struttura tridimensionale e permette la coltivazione sotto carico definito. contratto EHTs regolarmente e stabile forza, la frequenza e il ritmo per molte ore e settimane, permettendo misure e la valutazione della tossicità cronica a lungo termine. Analisi EHT può essere eseguita in stimolazione elettrica che è importante per quanto riguarda il rapporto forza-frequenza di contrazione del muscolo e la sua potenziale influenza sugli effetti della droga. Per quanto riguarda lo stato immaturo del hiPSC-CM, stimolazione elettrica ha il potenziale per spingere le cellule verso un fenotipo più matura 20, 21 e potrebbe essere inclusa nella EHT manutenzione. Inoltre, il sistema di prova EHT fornisce alta lettura contenuti tra tutti i parametri istologici standard così come biochimica (RNA, DNA, isolamento delle proteine) 11. potenziali applicazioni future includono aspetti di sviluppo del farmaco (validazione del target, sicurezza farmacologica) e modelli di malattia in particolare in combinazione con CRISPR / Cas9 generazione mediata dei controlli isogenici.
Durante la manutenzione di EHTs e prestazioni di curve concentrazione-risposta, è importante seguire attentamente le istruzioni per le procedure di coltura cellulare sterili per evitare contaminazioni fungine durante il trasferimento delle cremagliere PDMS tra piastre da 24 pozzetti. La fase più critica con EHT però, è il protocollo di differenziazione dei cardiomiociti. Per i EHTs per formare coerentemente strisce muscolari battendo, la popolazione di ingresso deve essere composto da almeno 60% cardiomiociti. Fortunatamente, i protocolli di differenziazione è diventato più robusto ed efficiente nel corso degli anni e cardiomiociti sono facilmente reperibili in commercio ormai. Il ruolo dei non miociti nello sviluppo del tessuto cardiaco ingegnerizzato hiPSC-derivato non è pienamente compreso, ancora. Esperimenti con hiPSC-CM di elevata purezza ha portato alla sorprendentemente buono EHTass = "xref"> 7, ma l'integrazione di altri tipi di cellule nel tessuto ha dimostrato di migliorare la funzione del tessuto e potrebbe spingere verso il fenotipo una fisiologia maturo 22, 23, 24. Come i tessuti sono generati in un ben-formato 24 con un milione di cellule per il tessuto, questa piattaforma è ancora piuttosto costoso. Ridimensionamento in un formato a 96 pozzetti viene aspirato, ma la robustezza finora outbalances questa lacuna. Il protocollo presentato in questo manoscritto è tecnicamente molto robusto con poca variabilità tra le repliche. La variabilità intra-batch è molto basso per la cinetica (media coefficiente di variazione = 5%), e piuttosto grande per la frequenza battito spontaneo (media coefficiente di variazione 10%) e la forza di contrazione (media coefficiente di variazione 17%). La tecnica è molto robusto. Attraverso diversi sperimentatori, l'efficienza per generare EHTs battere è> 90% degli idrogel colate.
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Disclosures
IM, TE e AH sono co-fondatori di EHT Technologies GmbH, Germania.
Acknowledgments
Gli autori sono grati ad Alessandra Moretti e Dennis Schade per la gentile apporto di materiale. Riconosciamo il grande supporto del gruppo di lavoro IPS e EHT presso il Dipartimento di Farmacologia Sperimentale e Tossicologia della UKE. Il lavoro degli autori è sostenuto da sovvenzioni dal DZHK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare) ed il Ministero dell'Istruzione tedesco e della ricerca (BMBF), la Fondazione tedesca per la ricerca (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), Centro nazionale britannico per la sostituzione Affinamento & Riduzione degli animali nella ricerca (NC3Rs CRACK-IT concedere 35.911-259.146), la British Heart Foundation RM / 13/30157, il Consiglio europeo della ricerca (Advanced Grant IndivuHeart), la Fondazione tedesca Cuore e la Freie und Hansestadt Hamburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 mL falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
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- EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.
