Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatisert Sammentrekning Analysis of Human Engineered hjertevev for Cardiac Drug Safety Screening

Published: April 15, 2017 doi: 10.3791/55461
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

Summary

Her viser vi generering av human konstruert hjertevev fra induserte pluripotente stamceller (hiPSC) -avledede kardiomyocytter. Vi presenterer en metode for å analysere kontraksjonskraft og eksempelvise endring av sammentrekning mønster av hERG kanal inhibitor E-4031. Denne fremgangsmåten viser høy grad av robusthet og egnethet for hjertelegemiddelscreening.

Abstract

Hjertevev teknikk beskrives teknikker for å danne tredimensjonale kraftgenerer utviklet vev. For gjennomføring av disse prosedyrene i grunnforskning og prekliniske narkotika utvikling, er det viktig å utvikle protokoller for automatisert produksjon og analyse under standardiserte betingelser. Her presenterer vi en teknikk for å generere Engineered hjertevevet (EHT) fra kardiomyocytter fra forskjellige arter (rotte, mus, menneske). Teknikken er basert på montering av en fibrin-gel inneholdende dissosierte kardiomyocytter mellom elastisk polydimetylsiloksan (PDMS) poster i en 24-brønners format. Tredimensjonal, kraftgenererende EHTs utgjør i løpet av to uker etter støping. Denne prosedyren tillater generering av flere hundre EHTs per uke og er teknisk begrenset av tilgjengeligheten av cardiomyocytes (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluering av auxotonic muskelsammentrekninger blir utført i en modifisert inkubasjon kammer med en mechanical sperre for 24-brønners plater og et kamera plassert på toppen av dette kammer. En programvare styrer et kamera beveget på en XYZ aksesystem til hver EHT. EHT trekningene detekteres ved hjelp av en automatisk gjenkjennelse figur algoritme, og kraft blir beregnet basert på forkortning av høyspenningen og den elastiske tilbøyelighet og geometri av PDMS innlegg. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for automatisk analyse av et høyt antall EHT under standardiserte og sterile betingelser. Den pålitelige påvisning av narkotika effekter på cardiomyocyte sammentrekning er avgjørende for hjertelegemiddelutvikling og sikkerhetsfarmakologi. Vi viser, med det eksempel på den hERG kanal inhibitor E-4031, som det menneskelige EHT-systemet reproduserer legemiddel svarene på sammentrekningskinetikken til det menneskelige hjerte, noe som indikerer at det skal være et viktig verktøy for hjerte medikament sikkerhet screening.

Introduction

Hjerte bivirkninger som legemiddelindusert lang QT-syndrom har ført til markeds uttak i løpet av de siste årene. Statistikk viser at ca 45% av alle uttak skyldes uønskede effekter på det kardiovaskulære systemet 1. Dette stoffet svikt etter den dyre utviklingsprosess og godkjenning er det verst tenkelige scenario for farmasøytiske selskaper. Forskning og utvikling avdelinger fokuserer derfor på påvisning av slike uønskede kardiovaskulære effekter tidlig. Av økonomiske og etiske hensyn, innsats for å redusere dyreforsøk og erstatte dem med nye in vitro screening-analyser er pågående.

Et sett av etablerte analyser er inkludert i USA Food and Drug Administration (FDA) og European Medicines Agency (EMA) retningslinjer for preklinisk vurdering av Proarytmisk virkninger av rusmidler 2. Teknologien for omprogrammering av somatiske celler, etterfulgt av differensiering avhumane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) styrket dette forskningsområde 3. Det tilbyr nå muligheten til å screene nye legemiddelkandidater om menneske cardiomyocytes in vitro og unngår problemer med inter-artsforskjeller. Siste hjerte differensiering protokoller 4, 5 gir ubegrenset tilførsel av cardiomyocytes uten etisk bekymring. Imidlertid måling av kontraktile kraft, den viktigste og best karakteriserte in vivo parameter av kardiomyocytter, er ikke godt etablert. Dette er relatert til den relative umodenhet 6 av menneskeskapte pluripotent stamcelle-avledet kardiomyocytter (hiPSC-CM) som sammenlignet med den voksne cardiomyocyte. En mulig forbedring er å konstruere tre-dimensjonale hjertevev fra enkeltceller 7 (utviklet hjertevevet, EHT). Den EHT-protokollen er basert på innstøping enkelt murine eller humane kardiomyocytter 8 sup>, 9, 10 i fibrin hydrogel mellom to fleksible polydimetylsiloksan (PDMS) innlegg 11 i 24-brønners format. Innen få dager cardiomyocytes begynner å trekke seg sammen spontant som enkeltceller og begynne å danne mobilnettverk. Etter 7-10 dager ble makroskopiske sammentrekninger av hele vev er synlige. Under denne prosessen den ekstracellulære matriks er ombygd, noe som fører til en minskning av diameter og lengde. Forkortelsen av EHT resulterer i bøying av PDMS legge til og med under hvile, underkaste kardiomyocytter i fremkallings EHT til kontinuerlig belastning. EHTs fortsette å utføre auxotonic muskelsammentrekninger over flere uker. Humane EHTs viser respons på fysiologisk og farmakologisk stimulering indikerer at de er egnet for legemiddelscreening og sykdom modellering 7.

I dette manuskriptet presenterer vi en robust og enkel protokoll for generasjon avpå fra human EHT, og den automatiserte kontraktilitet analyse av konsentrasjonsavhengige forandringer i den sammentrekning mønster i nærvær av hERG kanal inhibitorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Følgende trinn beskriver en cellekultur protokoll. Vennligst utføre under sterile forhold og bruke forvarmet medier.

1. Cardiac Differensiering av hiPSC

  1. Dyrke hiPSC
    1. Coat 6-brønners plater (1 ml / brønn) eller T75-kolber (7 ml / kolbe) med redusert vekstfaktor basalmembran matriks (f.eks geltrex, 1: 200; se tabell material) fortynnet i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) for 30 minutter ved 37 ° C. Forbered FTDA medium 12 ved blanding av basisk DMEM / F-12 medium med 2 mM L-glutamin, 0,5% penicillin / streptomycin, 5 mg / l transferrin, 5 ug / l selen, 0,1% humant serum albumin, 1x lipid-blanding, 5 mg / l insulin, 50 nM dorsomorphin, 2,5 ng / mL aktivin A, 0,5 ng / ml humant TGFß1 og 30 ng / ml FGF2.
    2. Seed hiPSC (~ 3 x 10 5/10 cm²) i FTDA medium og kulturen ved 37 ° C, 5% CO2, 21% O2 med daglig medium endring (Figur 1A). Ved 80% konfluens, passasje (1: 2-1: 6) med etylendiamintetraeddiksyre (EDTA; 0,5 mM; inkubasjonstid ~ 4 min).
  2. Dannelse av embryoide legemer (EB)
    1. Dyrke hiPSC i T75-kolber til høy tetthet.
      1. Vask kolber med konfluente cellene to ganger med fosfatbuffret saltløsning uten kalsium og magnesium (PBS) og inkuber i 0,5 mM EDTA i ~ 10 minutter. Sørg for at cellene ikke løsner fra bunnen av kolben.
      2. Fjern EDTA med glass pipette, skylles av celler med 10 ml PBS, trykker kolber på benken for å løsne cellene.
        MERK: Bruk celle skraper hvis det er nødvendig.
      3. Samle celler i 50 ml konisk rør, tilsett fjerdedel av volumet (f.eks 10 ml RMPI til 40 ml cellesuspensjon) RPMI 1640-medium (eller hvilket som helst annet standard medium inneholdende 1,8 mM kalsium) og sentrifuger ved 250 xg i 5 minutter.
    2. Resuspender cellepelleten i FTDA medium supplert med 4 mg / ml polyvinylalkohol (PVA) og10 uM Y27632 og telle cellene i et Neubauer kammer.
    3. Fyll den roterende kolbe med cellesuspensjon (30 x 10 6 celler / 100 ml FTDA medium supplert med PVA og Y-27632; se trinn 1.2.2) og initiere EB dannelse i spinnerflasker (justere rotorhastighet på magnetisk rører til 40 omdr./min ) i cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) over natten.
  3. mesodermal differensiering
    1. Under EB formasjon, krukker belegge cellekultur egnet for suspensjonskultur med ikke-ionisk overflateaktivt middel (14 ml / T175) over natten ved 37 ° C.
    2. Den neste morgen, vasker surfaktant-belagte kolber to ganger med PBS (30 ml / T175). Legg PBS igjen og holde i inkubatoren inntil nødvendig.
    3. Fjern den roterende kolbe fra inkubatoren.
      MERK: Cellesuspensjonen bør være klart med små makroskopisk synlige EBS (figur 1B).
    4. Overfør 50 ml suspensjon til et 50 ml konisk kare og la EBS takke med 5-20 min.
    5. Fjern supernatanten og vask bunnfallet med 7 ml av RPMI 1640 supplert med 2% PVA og 10 uM Y-27632. Overføre suspensjonen til en gradert 15 ml konisk rør og anslaget EB volum (~ 50 til 100 ul).
    6. Overfør innholdet i spinnerflasker til ubelagte T175-kolber og forlate denne på V-formet stativ for sedimentering i opp til 20 min. Fjern supernatanten og vask embryoide legemer som nevnt ovenfor. Ikke fyll T175 kolbe med mer enn 200 ml som sedimente ville ta for lang tid. Hvis utgangsspinnerflaske volum overstiger 200 ml, delt EB suspensjon til flere T175-kolber og kombinere EBS igjen etter vask.
    7. Fjerne vaskemedium og resuspendert i medium for mesodermal differensiering, er det RPMI supplert med 4 mg / ml PVA, 0,5% penicillin / streptomycin, 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES), 0,05% humant serum albumin, 5 ug / ml transferrin, 5 ng / ml natriumselenitt, 0,1% lipid blanding, 250 pM fosfo-askorbat, 10 pM Y-27632, 10 ng / mL benmorfogent protein-4 (BMP-4), og 3 ng / ml aktivin A, 5 ng / ml FGF2 stabil.
    8. Fjern PBS fra surfaktant-belagte T175-kolber og fyll med cellesuspensjon (200 pl EBS i 40 ml). Anvende mindre flasker i mindre EB volum.
    9. Dyrke EBS i suspensjon i tre dager (37 ° C, 5% CO2, 5% O2). Utveksling 50% av mediet (samme sammensetning som i trinn 1.3.7) hver dag (bruk V-formet sedimente rack). Forbered medium fersk hver dag før fôring.
  4. Cardiac differensiering
    1. Klargjør ny surfaktant-belagte fartøy dagen før og håndtere som angitt ovenfor (1.3.2).
    2. Etter tre dagers mesodermal induksjon, la EBS sedimentere i opp til 5 minutter til sedimente rack. Fjern mesteparten av mediet og vask med RPMI 1640 supplert med 0,5% penicillin / streptomycin og 10 mM HEPES.
    3. Overføring 10 ml EB suspensjon til gradert15 ml rør og anslaget EB volum etter sedimentering.
    4. Resuspender EBS nøye i hjerte differensiering medium bestående av RPMI 1640 supplert med 0,5% penicillin / streptomycin, 10 mM HEPES, 0,05% humant serumalbumin, 5 ug / ml transferrin, 5 ng / ml natriumselenitt, 0,1% lipid blanding, 250 pM fosfo -ascorbate, 1 uM Y-27632, 100 nM Wnt-inhibitor DS-I-7 13.
    5. Overfør EBS til nye surfaktant-belagte cellekulturflasker (~ 200 ul EBS i 46 ml / T175).
    6. Inkuber i tre dager (37 ° C, 5% CO2, 21% O 2) med 50% utskiftning av medium (medium sammensetning se trinn 1.4.4) på den andre og tredje dag. Ikke endre medium i løpet av første 48 timer.
    7. Inkuber i medium bestående av RPMI 1640 supplert med 500 pM 1-tioglycerol, 10 mM HEPES, 0,5% penicillin / streptomycin, 1 uM Y-27632, 2% serum-fritt neurale cellekultur supplement (for eksempel B27) med insulin, 100 nM Wnt -hemmer DS-I-7 med daglig utveksling av 50% medium for de neste fire dager. EBS bør begynne å slå i løpet av denne perioden.
    8. Etter en uke av hjerte differensiering, skifte til det samme medium uten Wnt hemming og med serumfritt neurale cellekultur supplement. Endre 50% av mediet hver dag, med unntak av den første dagen.
  5. Dissosiasjon av menneskelige cardiomyocytes
    MERK: Etter to uker med differensiering protokoll, skal EBS viser spontane kontraksjoner (figur 1C). Hvis dette skjer, starter dissosiasjon og forberede kollagenaseoppløsning.
    1. Fremstill kollagenase oppløsning ved å veie og å løse 200 U / ml i kalsium-fri Hanks balanserte saltoppløsning uten kalsium / magnesium (HBSS) og tilsett 1 mM HEPES, 10 mM Y-27632, 30 mM N-benzyl-p-toluen sulfonamid ( BTS). Steriliser ved filtrering (0,2-um filter) og lagre aliquoter ved -20 ° C. Tine alikvoter ved 4 ° C over natten.
    2. Bosette EBS på sedimente rack,aspirate medium og erstatte med 20-25 ml forvarmet HBSS. Gjenta dette vasketrinn gang.
    3. Aspirer HBSS og erstatte med forvarmet kollagenase-løsning (15 ml / T175). Inkuber i 4 timer i cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO2, 21% O 2).
    4. Forbered blokkeringsbuffer med DMEM supplementert med 1% penicillin / streptomycin og DNase (12 ug / ml).
    5. Trykk på cellekulturflasker på benken, dissosiert EBS skal smuldre og falle fra hverandre (hvis ikke, øke inkubasjonstid). Forsiktig triturate cellesuspensjon og overføring til en konisk 50 ml tube. Vask kolber med blokkeringsbuffer (15 ml / T175) og overføres til røret.
    6. Sentrifuger i 10 minutter ved 100 x g. Resuspender cellene i varm DMEM, triturer og telle celler.

2. Frembringelse av Engineered hjertevev (EHT)

  1. Autoklaver kommersielt tilgjengelige PDMS stativer og polytetrafluoretylen (PTFE) avstandsstykker (se Materialer ogUtstyr regneark; Figur 2), og fremstille de følgende løsningene under sterile betingelser, en dag før EHT generasjon.
    1. Fremstille 2% agarose ved å veie og å oppløse i et passende volum av PBS, autoklav, straks lagres ved 60 ° C.
    2. Forbered aprotinin (33 mg / ml) ved å veie og å oppløse i et passende volum av aqua ad iniectabilia, filtrerer sterilt (0,22 um filter), alikvoter og oppbevar ved -20 ° C.
    3. Forbered fibrinogen (200 mg / ml) ved oppløsning steril fibrinogen i et passende volum av steril 0,9% NaCl (lunken), alikvoter og oppbevar ved -20 ° C.
    4. Forbered trombin (100 U / ml) ved oppløsning steril trombin i tre deler steril PBS og 2 deler aqua ad iniectabilia, delmengder på 3 ul i små rør og oppbevares ved -20 ° C.
    5. Forbered 10x DMEM ved å oppløse 670 mg 10x DMEM pulver i 5 ml aqua ad iniectabilia, filtrerer sterilt og oppbevares ved 4 ° C.
    6. Forbered 2x DMEMved å blande 2 ml 10x DMEM med 2 ml varme-inaktivert hesteserum, 0,2 ml penicillin / streptomycin, og 5,8 ml aqua ad iniectabilia, filtrerer sterilt og oppbevares ved 4 ° C.
    7. Forbered EHT-casting medium (ECM) ved blanding av DMEM med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum, 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin (200 mM), oppbevar ved 4 ° C.
  2. Tilberede støpeformer i 24-brønners plater ved å pipettere 1,6 ml varm agarose (2%, PBS) og plassere den PTFE-avstandsstykket (figur 2A) til brønnene.
    MERK: Plasser avstands umiddelbart etter pipettering inn maksimalt 8 brønner - agarose stivner veldig fort. Ikke la agarose i romtemperatur i mer enn 5 min.
  3. Etter agarose størkning (~ 10 min, vil agarose vende ugjennomsiktig), fjerne PTFE-avstandsstykker (figur 2C) og plassere de PDMS stativene (figur 2B) inn i støpeformene, slik at parene av PDMS poster nå inn i hver støpeform (figur 2D).
    4. 6 celler / ml.
  4. Forbered 110% av det beregnede volum av rekonstituering blandingen i en rundbunnet 15-ml tube på ice.For 24 EHTs, pipette rekonstituering blanding som er oppført i tabell 1 for humane, rotter eller mus kardiomyocytter, henholdsvis (10% mer er inkludert).
    MERK: Celle konsentrasjon av rekonstituering blandingen er forskjellig for human (10 x 10 6 celler / ml), rotte (4,1 x 10 6 celler / ml) og mus (6,8 x 10 6 celler / ml) EHTs. Avhengig av konsentrasjonen av cellesuspensjonen, tilsette ytterligere ECM til et sluttvolum på 2640 pl. Fibrinogen må være lunken til pipettering. fylle langsomt spissen av pipetten og ikke berøre overflaten av den kalde blandingen rekonstituering med fibrinogen-inneholdende pipette ved å tilsette fibrinogen til rekonstituering mix - viskositeten av fibrinogen i pipettespissen vil øke umiddelbart.
  5. Triturer tilberedning mix 10 - 15 ganger med en serologisk pipette inntil fibrinogen klumpen blir oppløst. Sjekk tilberedning miks i pipette for homogenitet.
  6. For hver EHT, pipette 100 ul rekonstituering blanding i en trombin aliquot (3 ul i 200 ul rør), bland og pipettér blandingen i agarose-sporene så raskt som mulig (figur 2E). Bruke en ny filtertupp for hver EHT. Resuspender tilberedning mix (behandling med serologisk pipette 5-10 ganger) etter hver 8 EHTs.
  7. Når alle sporene er fylt med rekonstituering blanding, lukke lokket av celledyrkningsskål og inkubert ved 37 ° C, 7% CO2 i 2 timer.
  8. Fjern platen fra inkubatoren og anbring under en steril hette. Dekk hver brønn med en liten mengde av medium (DMEM f.eks, ca 200 til 500 uL), riste platen forsiktig og inkuberes igjen ved 37 ° C i minst 10 min. Tilsetningen av DMEM vil lette fjerningen fra fibrin-geler av agarose støpeformer. Fremstill en ny 24-brønners plate med 1,5 ml EHT-medium pr brønn bestående av DMEM supplert med 10% varme-inaktivert hesteserum, 1% penicillin / streptomycin, 10 ug / ml insulin, 33 ug / ml aprotinin.
  9. Fjern forsiktig PDMS stativene fra agarose støpeformene og overføre dem til mediet fylte 24-brønners plate (figur 2F). Sett fatet tilbake i inkubatoren (37 ° C, 7% CO2, 40% O 2 for humane og rotte EHTs, 21% O 2 for mus EHTs) og mate mandag, onsdag og fredag med nyfremstilt EHT-medium. EHTs bør vise spontane sammentrekninger avbøyende stillinger som PDMS stativene 7-10 dager etter støping (figur 1D, 2G).
    1. For mus EHTs legge til 25 ug / ml 5-cytosin βDarabinofuranoside til kulturmediet i 48 timer for å begrense fibroblast proliferasjon.

3. Sammentrekning Analyse

MERK: sammentrekning Analysen er basert påvideo-optisk innspilling i en kommersielt tilgjengelig EHT analyseinstrument (se Tabell over materialer). Den sentrale enhet av dette instrumentet er en inkubering kammer (figur 3A). Programvaren som leveres sammen med instrumentet beregner kontraksjonskraften basert på bøyning av PDMS innlegg med kjent elastisitetsmodul og geometri 11 (Supplementary figur 1).

  1. Slå på oppvarmingsanordningen for maskinen 2 timer før målingen. Slå på gasstilførsel og elektronisk tilførsel av aksesystemet umiddelbart før sammentrekning analyse.
  2. For baseline opptak (referansepunkt i analysen), sett 24-brønn-plate med EHTs i EHT-medium inn i EHT analyseinstrumentet og start sammentrekning analyseprogramvare i henhold til leverandøren manuell.
    1. Klikk på fanen "Protokoll" på høyre panel og angi relevant informasjon om studiet, brukernavn, arter, cell type, alder, opptakslengde og ytterligere bemerkninger.
    2. Klikk på "Camera view" fanen på venstre panel og starte kamera live mode med automatisk figur deteksjon modus. Klikk på "Oppsett" -kategorien på høyre panel andadjust kameraposisjonen med xyz koordinater for hver brønn i 24-brønn-parabolen. Kontroller at EHT ligger i sentrum av vinduet og i fokus på kameraet.
      1. Pass på at lokket på cellekultur fatet ikke er uklar, da dette vil svekke tallet anerkjennelse og sammentrekning analyse.
        MERK: Figuren gjenkjenningsalgoritme er basert på deteksjon av høy kontrast områder og overvåkning av deres forandring i stilling. I programvare i disse områder i figuren anerkjennelse vil bli markert med et blått kors som beveger seg med sammentrekningene av høyspenningen.
      2. Sørge for at posisjonene for de blå kors er både på øvre og nedre ender av EHTs og bevegelige bare vertikalt som samsvarer med kontraksjoner av EHTs (figur 3B). Save oppsett posisjonene til hver brønn ved å trykke på knappen "posisjon ok".
    3. Deretter klikker du på "Parameters" -kategorien på venstre panel. Parametrene som vises her, definerer hvilke kriterier som programvaren identifiserer en sammentrekning topp og markerer det med en grønn firkant. Disse verdier er meget viktig for korrekt identifisering av sammentreknings topper (figur 3C) og ingen falske datapunkter (figur 3E-F).
      MERK: En liste over artsavhengige parametre og eksempler er vist i figur 3H. For ytterligere informasjon, ta kontakt med programvarehåndboken.
    4. Klikk på "Automatic" fanen på høyre panel og starte analysen ved å aktivere "Start" -knappen. Programvaren vil bevege seg sekvensielt fra en brønn til den neste, rekord EHT sammentrekninger og beregne kraften under opptak (vises i "sanntid" fanen på venstre panel). Ved slutten av analysen, en pdf rapport summarizing resultatene vil bli generert automatisk.
  3. Lagre og analysere pdf rapportere systemet genererte å oppsummere resultatene.
  4. Overvåke kontraktile parametere ved gjentatte målinger over flere dager. Den EHT vil øke i sammentrekning kraft før den har nådd et platå (vanligvis rundt dag 15 av kultur).
  5. Drug screening
    1. Forbered protein fri Tyrode-oppløsning en dag før måling og ekvilibrere i 24-brønners plater (2 ml / brønn) i cellekulturinkubator (37 ° C, 7% CO2, 40% O 2) over natten: 120 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1 mM MgCl2, 0,1 til 5 mM CaCl2, 0,4 mM NaH 2PO 4, 22,6 mM NaHCO3, 5 mM glukose, 0,05 mM Na2EDTA, 25 mM HEPES. Legg kalsium opp til 1,8 mM eller den tidligere bestemte [EC50] for å undersøke positive inotrope effekter.
    2. Vei og oppløse medikamentet i DMSO og filtrerer sterilt, hvis det er nødvendig.Forbered 6 forskjellige 1000x-sub-stamløsninger (i DMSO) av arbeidskonsentrasjon (for eksempel 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 uM for den respektive nanomolare området).
    3. Fortynn den respektive lager i Tyrode platene (2 ul i hver brønn 2 ml) og bland grundig. Plasser platene tilbake i inkubatoren inntil nødvendig.
    4. Start baseline målingen ved å ta den første Tyrode-fylte 24-brønn-plate under sterile hette og posisjon karbonelektroder i brønnene. Overfør PDMS stativer med EHTs plassert på toppen av karbonelektroder, lukker lokket, satte plate tilbake i inkubatoren og vente for en ekvilibreringsperiode på ~ 30 minutter.
    5. Overfør EHTs fra inkubatoren til sperre i EHT analyseinstrumentet. Lukk instrumentet og ta spontane baseline kontraktilitet (20 s / EHT).
    6. Koble karbonelektrodene til pacing kabelen og starte elektrisk stimulering av EHTs (2,5 V, 4 ms impulsvarighet, human: ~ 1 Hz, rotte: ~ 2Hz, mus: ~ 4 Hz). Spill på "tempo" baseline (10 s / EHT). Sørg for at alle EHTs er riktig tempo. Stimulering frekvens og spenning kan variere fra cellelinje til cellelinje.
    7. Etter grunnlinje opptak, fjerne EHTs fra instrumentet og overføre elektrodene med PDMS stativer på toppen, til 24-brønn-plate med det første medikamentkonsentrasjonen. Overfør den EHTs tilbake på sperre av EHT analyseinstrumentet umiddelbart og inkuberes der (standard medikament inkubasjonstid for eksempel 20 minutter).
    8. Koble pacing kabler, juster figur erkjennelse og registrer EHT sammentrekninger som reagerer på det første medikamentkonsentrasjonen.
    9. For de følgende legemiddelkonsentrasjonene, gjenta trinn 3.5.7 og 3.5.8 med de 24-brønnplater inneholdende høyere medikamentkonsentrasjoner.
    10. Lagre alle pdf opptak. Sjekk hver opptak for figur gjenkjennelse, korrekt posisjonering av grønne rutene identifisere sammentreknings topper og gjenstander (se 3.2.1 og figur 3
    11. Utføre ekstra offline analyse hvis nødvendig.
      1. Velg den respektive løp fra "Kjører" database på venstre panel ved å klikke på "Velg run". I "Parameter" fanen til venstre, endre parameteren for sammentrekning analyse. Nå velger "Offline analyse" i "Offline" fanen på høyre panel til Analyser på nytt videoene.
      2. For å justere tallet anerkjennelse og derfor spille inn en ny video-fil, velger du "Sample anmeldelse" etter justering figuren anerkjennelse i "real time" -kategorien. MERK: Prøve gjennomgang kan bare Analyser på nytt én brønn på en gang, mens offline analyse kan søke ny parameter for alle brønner ved å klikke på knappen "Bruk parameter på alle brønner" i "Parameter" panel på venstre side. Begge typer offline analyser vil automatisk opprette nye datafiler og pdf som viser resultatene.
    12. Analyser eksperiment ved å kombinere resultatene av biological replikerer og oppsummerer dataene i konsentrasjonsresponskurver for frekvens, kontraksjonskraft, sammentrekning tid og relaksasjonstid (figur 5D) og / eller grafisk fremstilling av gjennomsnittlig sammentreknings topper (figur 5c).
      MERK: PDMS stativer og PTFE-avstandsstykket kan brukes flere ganger (PDMS stenger max 5 ganger, og PTFE-avstandsstykke uendelige.). Etter bruk, rengjør dem manuelt med vann, kok to ganger i demineralisert vann og autoklav. Vær oppmerksom på mulige bære-over effekter, når gjenbruk av stativene, som narkotika kan bli absorbert av PDMS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cardiac Differensiering og fremstilling av EHT

HiPSC ble ekspandert på grunn av redusert vekstfaktor basalmembran matrise, dissosiert med EDTA og embryoidlegemer (EBS) dannet i spinnerflasker over natten. Etter mesodermal induksjon i tre dager, ble hjerte differensiering initiert med Wnt inhibitor. Etter ~ 17 dager med differensiering protokollen, ble slo EBS dissosiert til enkeltceller med kollagenase type II (figur 1). EHTs ble fremstilt fra nylig isolerte kardiomyocytter med 1,0 x 10 6 celler pr 100 ul vev umiddelbart etter EB dissosiasjon (figur 2). For tilberedning av frosne celler (f.eks kommersielle leverandører), ble cellene tint ved dråpevis resuspensjon i medium og resuspendert i ECM etter sentrifugering. I løpet av 48 timer, ble spontant bankende enkeltceller observert mikroskopisk i EHT. I løpet av de neste dagene, kardiomyocytter spredt ut i lengderetningen langs kraftlinjene i vevet, kombinert og dannet en koherent slå EHT. De makroskopisk synlige bøyninger av PDMS innlegg ble målt med EHT analyseinstrumentet.

sammentrekning Analysis

Analyse av EHT-kontraktilitet var basert på video-optisk opptak (figur 3). Innenfor systemet, ble 24-brønners plate med EHTs anbragt i gass- og temperaturregulert inkubator kammer med et glasstak. Et kamera er koblet til en motorisert XYZ-aksen er plassert over denne enhet, og XYZ koordinater ble definert for hver EHT med et software program. Analyse av hver EHT var basert på figuren erkjennelse ved den øvre og nedre ender av vevet. En automatisert programvarealgoritme analysert filmet EHT sammentrekninger og beregnede kraft utvikling basert på stolpen nedbøyning og elasticity / geometri av PDMS innleggene (Supplementary figur 1) 11. Etter bestemmelse av topper i henhold til forhåndsdefinerte kriterier, en pdf rapport oppsummert parametere av kontraktiliteten for alle EHTs (Supplementary figur 2).

Stabilitet i Long Term måling

Langtids måling av EHTs ble utført i kontinuerlig drift med automatisk gjentatte målinger hvert 20. min. Sammentrekning analyse viste ingen tidsavhengige endringer (Post test for lineær trend var ikke signifikante) i kontraksjonskraft, slo frekvens, sammentrekning tid T1 eller T2-relaksasjonstid i opp til 20 timer, noe som indikerer et høyt nivå av stabilitet (figur 4). Som med alle biologisk prøve skjønt, EHTs viser en viss grad av variasjon, som forventet for biologiske replikater. Variasjonen koeffisienter ved begynnelsen og slutten av langtidsmåleREMENT var 7/13% for kraft, 12/6% for frekvens, av 4/3% for sammentrekning tid og av 4/3% for relaksasjonstid, henholdsvis (n = 4). Denne variabiliteten mellom biologiske replikater er ikke en artifakt av figur anerkjennelse eller analyse som resultatene for hver enkelt EHT er reproduserbare og har lav variabilitet (Supplementary figur 2).

Drug Screening

Drug screening ble utført i serumfritt Tyrodes løsning. Kumulative konsentrasjonsresponskurver ble generert med en maksimal DMSO-bærer-konsentrasjon på 0,1%. Baseline sammentrekning analyse viste svært lite uregelmessighet i å slå mønster og svært lav variasjon mellom replikatene. Eksponering for den hERG-kanalblokkeren E4031 resulterte i en signifikant forlengelse av relaksasjonstiden (T2) ved 10 nM og uregelmessig vibrerende mønster ved høyere konsentrasjoner (figur 5). for Frekvensy kontrollert sammentrekning analyse, eventuelt målinger ble utført med elektrisk stimulering ved hjelp av karbonelektroder.

Figur 1
Figur 1: Cardiac differensiering. (A) Humant induserte pluripotente stamceller. Skala bar = 100 um. (B) embryoidlegemer ved begynnelsen av mesodermal differensiering. Skala bar = 100 um. (C) Contracting embryoidlegemene ved slutten av hjerte differensiering. Skala bar = 100 um. (D) Humant konstruert hjertevevet. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Generering av Engineered hjertet vev (EHT). (A) PTFE-avstandsstykket. (B) PDMS rack. A, (B) Skala bar = 1 cm (C) sett ovenfra, på en brønn i en 24-brønn-plate med støpeform i agarose etter fjernelse av PTFE-avstandsstykket. (D) Sammenkoblingen av poster fra PDMS stang er plassert i støpeformen. (E) Tilberedning blanding pipettert inn i støpeformen og rundt innleggene PDMS. (F) friskt generert EHT ved dag 0, overført til en ny kulturskål med medium. (G) Ombygd EHT i medium på dag 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Sammentrekning Analyse av Engineered hjertevev (EHT). (A) EHTanalyse instrument med datastyrt kamera over gass- og temperaturkontrollerte kammer inkubering med EHTs i 24-brønns-dyrkningsskål på toppen av en LED panel. (B) Levende riss av en EHT under analysen med den automatiserte sammentrekning analyseprogramvare. (C) Eksempler sammentrekning mønster viser kontraksjonskraften over tid målt med 100 bilder per sekund, og forstørret, skjematisk sammentrekning topp, viser analysen parameter kraft, sammentrekning tid (T1), relaksasjonstid (T2), sammentrekning hastighet (CV), avslapping hastighet ( RV, og dette tallet har blitt gjengitt fra 7 og 27). DH: Parametere for sammentrekning analyse. (D) Eksempler på forskjellige filternivåer (blå linje), filtrert påvirker figuren anerkjennelse. Venstre: Filter nivå = 0. Merk at ingen blå filtrert linjen er synlig, men bare den røde opprinnelige spor. Midten: Filternivå = 3, noe som indikerer gjenkjennelse ideell / analyse av the sammentrekning topper. Høyre: filternivået = 20. Merk at de blå filtrerte linjene er mye mindre enn den opprinnelige traser indikerer dårlig sammentrekning topp analyse. (E) Eksempel på arytmiske EHT kontraksjoner analysert med en for høy kraftterskel (til venstre) og nedre kraftterskel (til høyre) med alle topper gjenkjent. (F) Eksempler spor av EHTs eksponert for natriumkanal-agonisten ATX-II som resulterer i en lengre relaksasjonstid med tidlig etter sammentrekninger. Legg merke til at den fjerde sammentrekning toppen på venstre panelet ikke blir gjenkjent (ingen grønn firkant) på grunn av for lav minimum faktor. (G) Eksempler på sammentreknings topper med (høyre panel) og uten (høyre panel) rosa kurve (første deriverte av sammentrekningskurve, sammentrekning og avslapning hastighet). (H) Sammendrag av parameter anbefalinger for murine og humane EHTs. Legg merke til at disse parametrene kan være nødvendig å justere som sammentrekning mønster endrer seg under legemiddeleksponering (se E,F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Tidsstyring under Long Term Måling av spontant bankende humant Engineered hjertevevet (EHT). Tidskontroll under langtidsmåling av spontant bankende humant konstruert hjertevevet (EHT). EHTs ble plassert i EHT analyseinstrumentet og inkubert i en periode på 20 timer. Automatiserte sammentrekning analyser ble utført hvert 20. min med ikke betydelige post-test for lineær trend (n = 4, og data representerer gjennomsnitt ± standardavvik). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

t = "Figur 5" src = "/ files / ftp_upload / 55461 / 55461fig5.jpg" />
Figur 5: Effekt av hERG-kanalblokker E4031 on Human Engineered hjertevevet (EHT).
(A) Eksempler sammentrekning mønster på grunnlinjen. (B) Eksempler sammentrekning mønster etter inkubering i 300 nM E4031. (C) Gjennomsnittlig sammentrekning topp (n = 4) av elektrisk stimulerte EHTs ved basislinje (svart) og etter 30 min inkubering på 100 nM E4031 (rød). Analyse med 100 bilder per sekund. (D) Konsentrasjon-responskurver for E4031 på spontant slående humane EHTs. Legg merke til den mindre effekt størrelse i T2 forlengelse i de elektrisk stimulerte EHTs (C) sammenlignet med de spontant bankende EHTs (D). Enveis ANOVA, gjentatte målinger med Dunnett post-test vs baseline; * P <0,05; n = 4 Z' faktor 25 for T2 forlengelse ved 300 nM E4031 er 0,75.pg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Menneskelig Rotte Mus
celler 26.4x10 6 10.8x10 6 18.0x10 6
2xDMEM [pl] 147 147 147
Basalmembran matrisen [pl] 264 - 264
Y-27632 [pl] 2.6 - -
Fibrinogen [pl] 66.8 66.8 66.8
ECM [pl] annonse 2640 annonse 2640 annonse 2640

Tabell 1: pipettering Ordning for Poppreisning av Rekonstituering Bland i 24 menneske, rotter og mus og EHTs. Fibrinogenkonsentrasjonen er 5 mg / ml for alle EHTs. Legg merke til at cellekonsentrasjonen er forskjellig for hver art. For humane EHTs, legge til basalmembran matriks (f.eks Matrigel, se Materialer tabell) og Rho-kinase inhibitor Y-27632 til blandingen. For mus EHTs, legge basalmembran matrix. Avhengig av den opprinnelige konsentrasjon av cellesuspensjonen, tilsette ytterligere ECM for å oppnå et totalvolum på 2640 pl rekonstituering blanding.

Supplerende Figur 1
Supplerende Figur 1: Beregning Formel for kontraksjonskraften Basert på Post Deflection 26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Supplerende Figur 2: Eksemplarisk data Utdrag fra Sammentrekning analyserapport av programvaren.
Topp: Sammentrekning topper over 20 s med tiden tatt opp med 100 rammer / s (red: kontraksjonskraften; rosa: sammentrekning hastighet). Nederst: Analysert sammentrekning parameter som viser minimum, midlere, maksimumsverdien og standardavvik av de 18 analyserte sammentreknings topper som er merket med en grønn firkant (øverst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Konstruert hjertet vev tilbyr en verdifull mulighet til verktøykasse av kardiovaskulær forskning. EHTs i 24-brønners-formatet har vist seg verdifull for sykdom modellering 8, 14, narkotika sikkerhet screening 7, 8, 10, 11, 15, eller basisk Cardiovascular Research 16, 17.

Mulige modifikasjoner av de grunnleggende EHT protokoller inkluderer studier på cellulær interaksjon med definerte blandinger av kardiomyocytter og ikke-kardiomyocytter 18 og etterbelastning forbedring 14. Viktige aspekter for feilsøking omfatter kvaliteten på input celle befolkning og kvaliteten av fibrinogen. Dersom den innledende geldannelse er uregelmessig eller ikke er kompakt nok til å stikke to PDMS innlegg, eller hvis gelen hurtig degenerert i løpet av få dager etter støping på grunn av lav konsentrasjon aprotinin, EHTs generasjon vil ikke være vellykket.

De følgende begrensninger må tas i betraktning. (I) Gjennom-i 24-brønners-formatet er ikke godt egnet for en primær screening oppsett, men er tilstrekkelig for en sekundær bekreftelse. (Ii) Den integrerte utlesning av kraft, sammentrekning kinetikk og rytme har lav spesifisitet, noe som gjør det vanskelig å koble endringer i styrken til spesifikke molekylære mekanismer. (Iii) Selv om 3D-kulturen format og strekningen pålagt av bøyde PDMS innleggene forbedre morfologiske og funksjonelle aspekter ved modning, mangel på sanne innskutte plater, spontan juling, og under det normale adrenerge reaksjoner tyder på at full kardial modning ennå ikke er oppnådd med denne protokollen. (iv) PDMS har vist seg å absorbere forskjellige stoffer til forskjellige forlenge 19 og den faktiske effektive Konsentraterion på EHTs kan variere. Denne forspenningen kan være mer fremtredende i kroniske toksisitetsstudier 15 enn dem som undersøker akutte legemiddeleffekter 7, 8 og avhenger klart medikament for hånden. Som en følge av dette bør helst PDMS stativet utsettes for medikamenter kastes etter bruk, og den potensielle absorpsjonen av forskjellige stoffer må tas i betraktning ved analyse av dataene. (v) Gitt det faktum at 1x10 6 hiPSCs er nødvendig pr EHT kostnadene per datapunkt er høye.

Betydningen av denne protokollen i forhold til ex vivo hjerte-kontraktilitet analyse er mulighet for å arbeide i et menneskelig system, mangel på eksperimentelle nedslitt, og den standardiserte produksjon av EHTs som gjør det mulig å sette opp store studier på spesifikke genetiske bakgrunner (f.eks sykdom modellering ). I forhold til andre hiPSC testsystemer (flerelektrodesystem, impedans), dette systemet analyseres kontraktile kraft som den viktigste fysiologiske parameter av kardiomyocytter i en tre-dimensjonal struktur og tillater dyrking under definerte belastning. EHTs kontrakt med jevne mellomrom og ved stabil kraft, frekvens og rytme over mange timer og uker, slik at langvarige målinger og evaluering av kronisk toksisitet. EHT-analyse kan utføres under elektrisk stimulering som er viktig med hensyn til kraft-frekvens forholdet av muskelkontraksjon og dets potensielle innvirkning på legemiddeleffekter. Med hensyn til den umodne status for hiPSC-CM, har elektrisk stimulering potensial til å presse cellene mot en mer moden fenotype 20, 21 og kan være inkludert i EHT vedlikehold. I tillegg gir den EHT testsystemet høyt innhold utlesning inkludert alle standard histologiske parametere så vel som biokjemi (RNA, DNA, protein isolasjon) 11. Potensielle fremtidige applikasjoner inkluderer aspekter av legemiddelutvikling (mål-vurdering, farmakologiske sikkerhets) og sykdom modellering spesielt i kombinasjon med CRISPR / Cas9 mediert generering av isogene kontroller.

Under vedlikehold av EHTs og resultatene for konsentrasjon-respons kurver, er det viktig å nøye følge instruksjonene for sterile celledyrkningsfremgangsmåter for å unngå sopp forurensninger under overføring av PDMS holdere mellom 24-brønners plater. Den mest kritiske trinnet med EHT er imidlertid den cardiomyocyte differensiering protokollen. For EHTs til å danne koherent muskel strimler, har inngangs befolkningen til å bestå av minst 60% kardiomyocytter. Heldigvis differensierings protokollene ble mer robust og effektiv i løpet av årene og kardiomyocytter er lett kommersielt tilgjengelige nå. Rollen til ikke-myocytter i utviklingen av hiPSC-avledet konstruert hjertevevet er ikke fullt ut forstått, men. Forsøk med hiPSC-CM med høy renhet førte til overraskende god EHTass = "ekstern referanse"> 7, men integrering av andre celletyper i vevet har vist seg å forbedre vev funksjon og vil kunne presse fenotypen til en moden fysiologi 22, 23, 24. Ettersom vevene er generert i en 24-brønns-format med en million celler pr vev, er denne plattformen fortsatt er ganske dyrt. Skalere ned til en 96-brønners format er håpet, men så langt robusthet outbalances dette brist. Protokollen presentert i dette manuskriptet er teknisk meget robust med liten variasjon mellom replikater. Den intra-batch-variabilitet er meget lav for kinetikken (gjennomsnittlig variasjonskoeffisient = 5%), og noe stort for den spontane vibrerende frekvens (gjennomsnittlig variasjonskoeffisient 10%) og kontraksjonskraft (gjennomsnittlig variasjonskoeffisient 17%). Teknikken er meget robust. På tvers av forskjellige forskere, er effektiviteten for å generere male EHTs er> 90% av støpte hydrogeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

IM, TE og AH er co-grunnleggerne av EHT Technologies GmbH, Tyskland.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for Alessandra Moretti og Dennis Schade for deres type bidrag materiale. Vi erkjenner den store støtte fra iPS og EHT arbeidsgruppe ved Institutt for eksperimentell farmakologi og toksikologi ved UKE. Arbeidet med forfatterne er støttet med tilskudd fra DZHK (tysk Center for Cardiovascular Research) og den tyske departementet for utdanning og forskning (BMBF), den tyske Research Foundation (DFG Es 88 / 12-1 HA 3423 / 5-1 ), British National Centre for Replacement Refinement & Reduksjon av dyr i forskning (NC3Rs CRACK-IT innvilge 35911-259146), British Heart Foundation RM / 13/30157, European Research Council (Advanced Grant IndivuHeart), den tyske Heart Foundation og Freie und Hansestadt Hamburg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EHT analysis intrument EHT Technologies GmbH A0001 Software is included
EHT PDMS rack EHT Technologies GmbH C0001
EHT PTFE spacer EHT Technologies GmbH C0002
EHT electrode EHT Technologies GmbH P0001
EHT pacing adapter/cable EHT Technologies GmbH P0002
24-well-plate Nunc 144530
6 well-cell culture plate Nunc 140675
15 mL falcon tube, graduated  Sarstedt 62,554,502
Cell scraper Sarstedt 831,830
Spinner flask Integra 182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct  Thermo scientific 70101 Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask  Sarstedt  831,812,002
V-shaped sedimentation rack  Custom made at UKE Hamburg na
10× DMEM Gibco 52100
1-Thioglycerol  Sigma Aldrich M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma Aldrich 49752
Activin-A  R&D systems 338-AC
Agarose  Invitrogen 15510-019
Aprotinin Sigma Aldrich A1153
Aqua ad injectabilia Baxter GmbH 1428
B27 PLUS insulin  Gibco 17504-044
BMP-4 R&D systems 314-BP
Collagenase II  Worthington LS004176
DMEM Biochrom F0415
DMSO  Sigma Aldrich D4540
DNase II, type V (from bovine spleen) Sigma  D8764
Dorsomorphin  abcam ab120843
EDTA  Roth 8043.2
Fetal calf serum Gibco 10437028
FGF2 Miltenyi Biotec 130-104-921
Fibrinogen (bovine) Sigma Aldrich F8630
Geltrex  Gibco A1413302 For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+  Gibco 14175-053
HEPES  Roth 9105.4
Horse serum Life technologies 26050088
Human serum albumin  Biological Industries 05-720-1B
Insulin, human Sigma Aldrich I9278
L-Glutamin Gibco 25030-024
Lipidmix  Sigma Aldrich L5146
Matrigel BD Biosciences 354234 For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide TCI B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2 Biochrom 14190
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Pluronic F-127  Sigma Aldrich P2443
Polyvinyl alcohol  Sigma Aldrich P8136
RPMI 1640  Gibco 21875
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261
TGFß1 Peprotech 100-21
Thrombin Sigma Aldrich T7513
Transferrin  Sigma Aldrich T8158
Y-27632 Biorbyt orb6014
hiPSC Custom made at UKE hamburg na
iCell cardiomyocytes kit Cellular Dynamics International CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit Pluriomics PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit Axiogenesis AG Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes Takara Bio USA, Inc. Y10075

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  6. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  7. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  8. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).
  9. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  10. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
  11. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  12. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958 (2012).
  13. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  14. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  15. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).
  16. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  17. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).
  18. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  19. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  20. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  21. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312 (2016).
  22. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  23. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  24. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

Tags

Bioteknologi Engineered hjertet vev cardiomyocytes tissue engineering hjertestans differensiering narkotika sikkerhet farmakologi
Automatisert Sammentrekning Analysis of Human Engineered hjertevev for Cardiac Drug Safety Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mannhardt, I., Saleem, U., Benzin,… More

Mannhardt, I., Saleem, U., Benzin, A., Schulze, T., Klampe, B., Eschenhagen, T., Hansen, A. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. J. Vis. Exp. (122), e55461, doi:10.3791/55461 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter