Summary
人工多能性幹細胞（hiPSC）が心筋細胞に由来からここでは、人間工学的心臓組織の生成を示しています。我々は、hERGチャネル阻害剤E-4031によって収縮力と収縮パターンの典型的な変化を分析するための方法を提示します。この方法は、心臓薬物スクリーニングのための堅牢性と適合性の高いレベルを示しています。
Abstract
心臓組織工学は、三次元力発生工学的組織を構成する技術が記載されています。基礎研究および前臨床医薬品開発におけるこれらの手順の実装のために、標準化された条件下での自動生成および解析のためのプロトコルを開発することが重要です。ここでは、異なる種（ラット、マウス、ヒト）の心筋細胞からエンジニア心臓組織（EHT）を生成する手法を提示します。技術は、24ウェルフォーマットで弾性ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポスト間解離、心筋細胞を含むフィブリンゲルのアセンブリに依存しています。三次元の、力発生EHTsは、鋳造後2週間以内に構成します。この手順では、週に数百EHTsの生成を可能にし、技術的に心筋細胞の利用可能性によってのみ制限される（0.4〜1.0×10 6 / EHT）。 auxotonic筋収縮の評価はmechanで変性インキュベーションチャンバーで行われますiCalの24ウェルプレートのためのインターロックと、このチャンバの上に配置カメラ。ソフトウェアは、カメラが各EHTにXYZ軸システムに移動制御します。 EHT収縮は、自動図形認識アルゴリズムによって検出され、そして力がEHTの短縮及びPDMSポストの弾性性質および形状に基づいて算出されます。この手順は、標準化された無菌条件下でEHTの高い番号の自動分析が可能になります。心筋細胞の収縮に対する薬物効果の確実な検出は、心臓薬の開発や安全性薬理のために重要です。私たちは、それが心臓の薬の安全性スクリーニングのための有望なツールであることを示す、人間EHTシステムは、人間の心臓の収縮速度で薬物応答を複製することを、hERGチャネル阻害剤E-4031の例を、示しています。
Introduction
例えば、薬物誘発性QT延長症候群のような心臓の副作用は、過去数年間にわたり、市場の撤退につながっています。統計は、すべての引き出しの約45％が心血管系1上の不要な影響によるものであることを示しています。高価な発達過程および承認した後に、この薬の失敗は、製薬会社にとって最悪のシナリオです。研究開発部門は、したがって、早期に不要な心血管系への影響の検出に焦点を当てています。経済的、倫理的な問題、動物実験を削減し、新しいin vitroスクリーニングアッセイでそれらを置き換えるための努力のために進行中です。
確立されたアッセイのセットは、米国食品医薬品局（FDA）と欧州医薬品庁（EMA）催不整脈薬の効果2の前臨床評価のためのガイドラインに含まれています。の分化に続いて体細胞を再プログラミングする技術人間の人工多能性幹細胞（hiPSC）は、この研究分野3を押し上げました。現在では、 インビトロでヒト心筋細胞の新薬候補をスクリーニングする可能性を提供し、種間の違いの問題を回避できます。最近の心臓分化プロトコル4、 図5は、倫理的な懸念せずに心筋細胞の無制限の供給を提供します。しかし、収縮力の測定は、心筋細胞の生体パラメータの中で最も重要かつ最も特徴付けられ、十分に確立されていません。これは、成人心筋細胞と比較して、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（hiPSC-CM）の相対的な未熟6に関連しています。可能な進歩は、単一のセル7（操作心臓組織、EHT）から3次元心臓組織を操作することです。 EHTプロトコルは単一のマウスまたはヒト心筋8を埋め込むことに基づいていますSUP>、2つの可撓性ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポスト24ウェル形式で11の間にフィブリンヒドロゲル9、10。数日以内に心筋細胞を単一細胞として自発的に収縮し始めると、セルラーネットワークを形成し始めます。 7-10日後、組織全体の巨視的収縮が表示されます。このプロセスの間に細胞外マトリックスは、直径と長さの減少につながる、改造されています。 PDMSの曲げEHT結果の短縮は、連続負荷に開発EHTで心筋細胞を施す、残りの間にも投稿してください。 EHTsは数週間にわたってauxotonic筋肉の収縮を実行し続けます。ヒトEHTsは、薬物スクリーニングおよび疾患モデリング7のためのそれらの適合性を示す生理学的および薬理学的刺激に対する応答を示します。
本稿では、我々はgeneratiための堅牢かつ簡単なプロトコルを提示します人間EHT、およびhERGチャネル阻害剤の存在下での収縮パターンの濃度依存性の変化を自動的に収縮分析の上。
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Protocol
注：次の手順は、細胞培養プロトコルを記述します。無菌条件下で実行し、予熱したメディアを使用してください。
hiPSCの1.心臓分化
- hiPSCを育成
- 成長因子低減基底膜マトリックスで被覆6ウェルプレート（1ミリリットル/ウェル）又はT75フラスコ（7ミリリットル/フラスコ）（ 例えば geltrex、1：200;材料の表を参照）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中に希釈するための37°Cで30分間。基本2mMのL-グルタミンを含むDMEM / F-12培地、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、5 mg / Lのトランスフェリン、5μgの/ Lセレン、0.1％ヒト血清アルブミン、1×脂質ミックス、5を混合することにより媒体FTDA 12を準備mg / Lのインスリン、50nMのドルソモルフィン、2.5 / mlのアクチビンA、0.5 / mlのヒトTGFß1及び30 / mlのFGF2。
- 37°C、5％CO 2、毎日培地を交換しながら、21％のO 2（AT FTDA培地と培養におけるシードhiPSC（〜3×10 5月 10日cm2で）図1A）。 （：2-1：6 1）（0.5ミリモル;インキュベーション時間〜4分EDTA）エチレンジアミン四酢酸と80％の密集度、通路で。
- 胚様体（EB）の形成
- 高密度にT75フラスコにhiPSCを育成。
- （PBS）カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水で二回コンフルエント細胞とフラスコを洗浄し、約10分間、0.5mMのEDTA中でインキュベートします。細胞がフラスコの底から外していないことを確認してください。
- ガラスピペットを用いてEDTAを除去10mLのPBSで細胞をオフフラッシュし、細胞を分離するためにベンチにフラスコをタップ。
注：必要に応じて、セルスクレーパーを使用してください。 - 体積の1/4を追加し、50 mLコニカルチューブに細胞を採取（ 例えば 、10 mLのRMPI 40mLの細胞懸濁液に）RPMI 1640培地（または任意の他の標準的な1.8 mMのカルシウムを含む培地）で5分間250×gで遠心。
- FTDA培地に再懸濁細胞ペレットを4mg / mLのポリビニルアルコール（PVA）を補充し10μMY27632とノイバウアー室で細胞を数えます。
- 細胞懸濁液をスピナーフラスコを埋める（30×10 6細胞/ PVA及びY-27632を補充した100mLのFTDA媒体、ステップ1.2.2を参照）、スピナーフラスコ内EB形成を開始（40 RPMに磁気撹拌機のローター速度を調整します）一晩細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、5％O 2）です。
- 高密度にT75フラスコにhiPSCを育成。
- 中胚葉分化
- EB形成の間、コート細胞培養物を37℃で一晩、非イオン性界面活性剤（14ミリリットル/ T175）との懸濁培養に適したフラスコ。
- 翌朝は、PBS（30ミリリットル/ T175）で2回界面活性剤でコーティングされたフラスコを洗浄します。再びPBSを追加し、必要になるまでインキュベータに保ちます。
- インキュベーターからスピナーフラスコを取り外します。
注：細胞懸濁液は、小さな肉眼で見えるのEB（ 図1B）を有する透明であるべきです。 - 50 mLコニカル浴槽に50 mLの懸濁液を転送しますEBを5〜20分間沈降Eとしましょう。
- 上清を除去し、2％のPVAおよび10μMのY-27632を添加したRPMI 1640 7 mLでペレットを洗浄します。目盛り15 mLのコニカルチューブに移し懸濁液及びEBの体積（〜50〜100μL）を推定します。
- コーティングされていないT175フラスコにスピナーフラスコの内容を転送し、最大20分間の沈降のためにV字型ラックにこれを残します。上清を除去し、上記のように胚様体を洗います。沈降が時間がかかりすぎるとして、200以上のmLでT175フラスコを記入しないでください。最初のスピナーフラスコの容積は200mLのを超えた場合、いくつかのT175フラスコにEB懸濁液を分割し、洗浄後に再度EBSを組み合わせます。
- 、中胚葉分化用培地中でそれを洗浄媒体と再懸濁を除去RPMI 4 mg / mlとPVAを補充された、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、0.05％のヒト血清アルブミン、5μg/ mlのトランスフェリン、5 / mlの亜セレン酸ナトリウム、0.1％の脂質混合物、250μMリン酸アスコルビン酸塩、10μMのY-27632、10ng / mLの骨形成タンパク質-4（BMP-4）、および3 / mlのアクチビンA、5 / mlの安定したFGF2。
- 界面活性剤で被覆されたT175フラスコからPBSを除去し、細胞懸濁液（40mLの200μLのEB）で埋めます。小さいEBボリュームの小さいフラスコを使用してください。
- 三日間（37℃、5％CO 2、5％O 2）のための懸濁液中のEBを養います。交換（ステップ1.3.7と同じ組成）中の50％毎日（使用V字状の沈降ラック）。給餌前に毎日メディア新鮮を準備します。
- 心臓分化
- 前日の新しい界面活性剤でコーティングされた血管を準備し、（1.3.2）上記のように扱います。
- 中胚葉誘導の3日後、EBを沈降ラックで最大5分間沈降してみましょう。媒体の大部分を除去し、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10mM HEPESを補充したRPMI 1640で洗浄します。
- 目盛りにEB懸濁液の10mLのを転送します15mLのチューブ及び沈降後のEBの量を推定します。
- 再懸濁EBを注意深く心臓分化培地中0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、10mMのHEPES、0.05％ヒト血清アルブミン、5μg/ mlのトランスフェリン、5 / mlの亜セレン酸ナトリウム、0.1％の脂質混合物、250μMのリン酸を添加したRPMI1640からなります-ascorbate、1μMY-27632、100nMでのWnt阻害剤DS-I-7 13。
- 新しい界面活性剤コーティングされた細胞培養フラスコ（46ミリリットル/ T175で〜200μLのEB）にEBSを移します。
- 50％の培地を交換しながら3日間（37℃、5％CO 2、21％O 2）インキュベート第二および第三日目（培地組成は、ステップ1.4.4を参照します）。最初の48時間以内にメディアを変更しないでください。
- 500μM1-チオグリセロール、インスリンと10mMのHEPES、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、1μMY-27632、2％無血清神経細胞培養用サプリメント（ 例えば B27）、100 nMでのWntを補充したRPMI 1640からなる培地中でインキュベート-inhibitor DS-I次の4日間、50％培地の毎日の為替と-7。 EBは、この期間内に暴行を開始すべきです。
- 心臓分化の1週間後は、Wnt阻害せず、無血清の神経細胞培養サプリメントと同じ培地に切り替えます。初日を除いて、毎日培地を50％に変更します。
- 人間の心筋細胞の解離
注：分化プロトコルの2週間後、EBは自発収縮（ 図1C）を示すべきです。もしそうなら、解離を開始し、コラゲナーゼ溶液を準備します。- （（HBSS）を秤量し、カルシウム/マグネシウムを含まないカルシウムを含まないハンクス平衡塩溶液中で200 U / mLのを解くことで、コラゲナーゼ溶液を調製し、1mMのHEPES、10μMのY-27632、30μMのN-ベンジル-p-トルエンスルホンアミドを追加BTS）。 -20℃で濾過（0.2μmのフィルタ）とストアアリコートによって滅菌します。一晩4℃でアリコートを解凍。
- 沈降ラックにEBSをセトル、吸引媒体及び20〜25 mLを予め温めておいたHBSSと交換してください。もう一度この洗浄工程を繰り返します。
- 吸引HBSSと予め温めコラゲナーゼ溶液（15ミリリットル/ T175）で置き換えます。細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、21％O 2）中で4時間インキュベートします。
- 1％ペニシリン/ストレプトマイシン及びデオキシリボヌクレアーゼ（12μgの/ mL）で補充したDMEMでブロッキング緩衝液調製。
- ベンチ上の細胞培養フラスコをタップし、EBを崩壊し、バラバラに（ない場合は、インキュベーション時間を増やす）必要があり解離しました。穏やか円錐50mLチューブに細胞懸濁液と転送を粉砕します。バッファ（15ミリリットル/ T175）を遮断すると共にフラスコを洗浄し、チューブに移します。
- 100×gで10分間遠心分離。暖かいDMEM、粉砕物中の細胞を再懸濁し、細胞をカウントします。
エンジニア心臓組織の2世代（EHT）
- 市販のPDMSラック及びポリテトラフルオロエチレン（PTFE）スペーサをオートクレーブ（ 材料を参照機器のスプレッドシート。 図2）と一日前EHT生成するために、無菌条件下で、以下の溶液を調製します。
- 計量及びPBS、オートクレーブの適切な容量に溶解して2％アガロースを調製し、直ちに60℃で保存。
- アプロチニンを調製秤量し、アクア広告iniectabiliaの適切な容量に溶解して（33ミリグラム/ mL）を、-20℃での滅菌（0.22ミクロンフィルター）、アリコートとストアをフィルタリングします。
- -20℃で無菌の0.9％NaCl（ぬるま湯）、アリコートし、店舗の適切な体積で無菌フィブリノゲンを溶解することによりフィブリノーゲン（200ミリグラム/ ml）を調製します。
- 三つの部分に無菌トロンビンを溶解することにより、トロンビン（100U / ml）を調製し、-20℃でPBS及び2部アクア広告iniectabilia、小管3μLのアリコート部分とストアを無菌。
- 5mLのアクア広告iniectabiliaに670 mgの10×DMEM粉末を溶解することにより10倍DMEMを調製し、4℃で無菌かつストアをフィルタリングします。
- 2X DMEMを準備2 mLの熱不活性化ウマ血清、0.2 mLのペニシリン/ストレプトマイシンおよび5.8 mLのアクア広告iniectabiliaと2mLの10×DMEMを混合し、4℃で無菌かつストアをフィルタリングします。
- 、10％熱不活化ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミン（200mMの）と4℃で保存するDMEMを混合することにより、EHT-鋳造媒体（ECM）を準備。
- 1.6 mLの温かいアガロース（2％、PBS）をピペッティングし、ウェルにPTFEスペーサー（ 図2A）を配置することによって、24ウェルプレートで鋳型を調製します。
注：すぐに8つの井戸の最大にピペッティング後にスペーサー - アガロースは非常に速く凝固します。 5分よりも長く、室温でアガロースを放置しないでください。 - アガロース凝固（〜10分間、アガロース不透明になります）後、PTFEスペーサ（ 図2C）を除去し、PDMSポストの対が各鋳型（ 図2D）に達するように鋳型にPDMSラック（ 図2B）を配置します。
- ice.For 24 EHTsに丸底の15 mLチューブに再構成混合物の推定量の110％を準備し、ピペットヒト、ラットまたはマウスの心筋細胞は、表1に列挙された再構成ミックス、それぞれ（10％余分に含まれています）。
注：再構成混合物の細胞濃度は、ヒト（10×10 6細胞/ mL）、ラット（4.1×10 6細胞/ mL）およびマウス（6.8×10 6細胞/ mL）EHTsで異なります。細胞懸濁液の濃度に応じて、2,640μLの最終容量まで追加のECMを加えます。フィブリノゲンは、ピペッティングのためにぬるま湯にする必要があります。ゆっくりピペットの先端を記入し、再構成ミックスにフィブリノゲンを追加する際にフィブリノゲン含有ピペットで冷たい再構成ミックスの表面には触れないでください - フィブリノーゲンの粘度をピペットチップですぐに増加するであろう。 - 再構成ミックスを粉砕する1血清学的ピペットで15回フィブリノゲン凝塊が溶解するまで - 0。均質性のために、ピペットで再構成ミックスを確認してください。
- 1つのトロンビンのアリコート（200μLチューブ3μL）中の各EHT、ピペット100μLの再構成混合のために、可能な限り迅速に（ 図2E）アガローススロットに混合物を混合し、ピペット。各EHTのための新しいフィルターチップを使用してください。すべての8 EHTs後に再構成ミックス（血清ピペットで粉砕し、5〜10回）を再懸濁します。
- 一度すべてのスロットを再構成混合物が充填され、細胞培養皿の蓋を閉め、2時間、37℃、7％CO 2でインキュベートします。
- 無菌フード下インキュベーターと場所からプレートを取り外し。各ウェルの培地の少量（ 例えば、DMEM、約200から500μL）を覆う、穏やかプレートを振盪し、少なくとも10分間、37℃で再びインキュベートします。 DMEMの添加は、アガロース鋳型からフィブリンゲルからの除去を容易にします。
- 注意深くアガロース鋳型からPDMSラックを除去し、培地で満たされた24ウェルプレート（図2F）に転送します。バックインキュベーターに皿を置き（37℃、7％CO 2、ヒトおよびラットEHTs 40％のO 2、マウスEHTs 21％のO 2）新たに調製EHT-媒体とし、フィード月曜日、水曜日および金曜日。 EHTs（図1D、2G）を鋳造後PDMSラック7-10日の記事を偏向自発収縮を示すべきです。
- マウスについてEHTsは、線維芽細胞の増殖を制限するために、48時間の培養培地に5-シトシンβDarabinofuranoside25μgの/ mLを加え。
3.収縮解析
注：収縮分析はに基づいています市販のEHT分析装置における映像光記録（ 材料の表を参照のこと）。この器具の中央部は、インキュベーションチャンバー（ 図3A）です。機器に付属のソフトウェアは、既知の弾性率及び幾何11（ 補足図1）を有するPDMSポストの偏向に基づいて収縮力を算出します。
- 測定に先立って機械2時間の加熱装置をオン。直前の収縮解析へのガス供給及び軸システムの電子供給をオンにします。
- ベースライン記録（分析中の基準点）のために、EHT分析機器にEHT-培地中EHTs有する24ウェルプレートを配置し、供給業者のマニュアルに従って収縮解析ソフトウェアを起動。
- 右側のパネルの「プロトコル」タブをクリックし、スタディ名、ユーザー、種、CEに関する関連情報を入力します。LLタイプ、年齢、記録長と追加の発言。
- 左側のパネルの「カメラビュー」タブをクリックし、自動フィギュア検出モードでカメラのライブモードを開始します。 XYZとカメラ位置を24ウェルディッシュに、各ウェルの座標andadjust右側のパネルの「設定」タブをクリックします。 EHTは、ウィンドウの中央に、カメラの焦点であることを確認してください。
- これは、図形認識や収縮解析を損なうだろうとして、細胞培養皿の蓋が霧ではないことを確認してください。
注：図形認識アルゴリズムは、コントラストの高い領域を検出した位置にその変化を監視に基づいています。ソフトウェアで図形認識のこれらの領域は、EHTの収縮に伴って移動青い十字マークが付きます。 - 青十字の位置がEHTsの両方の頂部及び底部の端部にあり、（ 図3B）EHTsの収縮と一致する垂直にのみ移動することを確認してください。 S「OKポジション」ボタンを押して、各ウェルのAVE設定位置。
- これは、図形認識や収縮解析を損なうだろうとして、細胞培養皿の蓋が霧ではないことを確認してください。
- 次に、左側のパネルにある「パラメータ」タブをクリックします。ここに表示されるパラメータは、ソフトウェアが収縮ピークを識別し、緑の四角でそれをマークしたことにより、基準を定義します。これらの値は、収縮ピーク（ 図3C）、ノー偽のデータ点（ 図3E-F）の正しい識別のために非常に重要です。
注：種依存パラメータおよび例のリストは、図3Hに示されています。詳細については、ソフトウェアのマニュアルを参照してください。 - 右側のパネルの「自動」タブをクリックし、「スタート」ボタンを活性化することにより、分析を開始します。ソフトウェアは、次のレコードEHT収縮への1つのウェルから順番に移動し、（左側のパネルに「リアルタイム」タブに表示）録音中に力を計算します。分析、PDFレポートの終わりにsummari結果をシュッと、自動的に生成されます。
- システムは、結果を要約するために生成されたPDFレポートを保存し、分析します。
- 数日間にわたって繰り返し測定による収縮パラメータを監視します。それは（通常は文化の日15前後）プラトーに達するまでEHTは、収縮力に増加します。
- 薬剤スクリーニング
- 一日測定前に無タンパク質タイロード溶液を調製し、24ウェルプレート中で平衡化（2ミリリットル/ウェル）を細胞培養インキュベーター中（37℃、7％CO 2、40％O 2）一晩：120のNaCl、 5.4ミリモルのKCl、1mMのMgCl 2、0.1~5ミリモルのCaCl 2、0.4mMののNaH 2 PO 4、22.6ミリモルのNaHCO 3、5mMグルコース、0.05ミリモルのNa 2 EDTA、25mMのHEPES。陽性変力効果を調査するために、[EC 50] 1.8mMのまたは以前に決定までのカルシウムを加えます。
- 計量及びDMSO中の薬物を溶解し、必要に応じて、滅菌フィルター。作業濃度（ 例えば、0.3、1、3、10、30、それぞれナノモル範囲の100μM）の（DMSOで）6つの異なる1000倍サブストック溶液を調製します。
- タイロードプレート（各ウェル2ml中2μL）の各ストックを希釈し、十分に混合します。必要になるまでインキュベーターにプレートをバックに置きます。
- ウェル中の無菌フードと位置カーボン電極の下に第一タイロード充填された24ウェルプレートをとることによって、ベースライン測定を開始します。炭素電極の上に置かEHTsとPDMSラックを移し、蓋を閉じて、バックインキュベーターでプレートを置き、〜30分の平衡期間を待ちます。
- EHTの分析機器でインターロックをインキュベーターからEHTsを転送します。器具を閉じ、自発的ベースライン収縮（20秒/ EHT）を記録します。
- ペーシングケーブルに炭素電極を接続し、EHTsの電気刺激を開始（2.5 V、4ミリ秒のインパルス持続時間、人間：〜1ヘルツ、ラット：2〜ヘルツ、マウス：〜4ヘルツ）。 "ペース" ベースライン（10秒/ EHT）を記録します。すべてEHTsが適切にペーシングされることを確認してください。刺激周波数と電圧は、細胞株からの細胞株に異なる場合があります。
- ベースライン記録後、器具からEHTsを除去し、第一の薬物濃度で24ウェルプレートに、上部にPDMSラックと電極を転送します。すぐEHT分析機器のインターロックに戻しEHTsを転送し、そこ（標準薬のインキュベーション時間例えば 20分間）インキュベートします。
- ペーシングケーブルを接続し、最初の薬物濃度に応答して図形認識とレコードEHT収縮を調整します。
- 以下の薬物濃度のために、より高い薬物濃度を含む24ウェルプレートを用いて、ステップ3.5.7および3.5.8を繰り返します。
- すべてのPDFの録音を保存します。各図形認識、収縮ピークとアーチファクトを識別緑色の正方形の正確な位置決めのための記録をチェックし（3.2.1及び図3を参照してください
- 必要に応じて追加のオフライン解析を実行します。
- 「選択実行」をクリックすると、左側のパネルの「ラン」のデータベースからそれぞれの実行]を選択します。左側の「パラメータ」タブでは、収縮解析のためのパラメータを変更します。今すぐ動画を再分析するために右のパネルに「オフライン」タブにある「オフライン解析」を選択します。
- 図形認識を調整するため、新しいビデオファイルを記録するには、「リアルタイム」タブで図形認識を調整した後、「サンプル・レビュー」を選択します。注：オフライン解析は、左の「パラメータ」パネルにボタン「すべてのウェルの使用パラメータ」をクリックすると、すべてのウェルのための新しいパラメータを適用することができ、一方、サンプルのレビューは、一度に1つのウェルを再分析することができます。オフライン解析の両方のタイプの結果を自動的に表示する新しいデータファイルとPDFファイルが作成されます。
- Bの結果を組み合わせることにより、実験を分析iological複製し（ 図5D）周波数、収縮力、収縮時間及び緩和時間についての濃度応答曲線のデータを要約し、および/または平均収縮ピーク（ 図5C）のグラフ表示。
注：PDMSラックとPTFEスペーサーを繰り返し使用することができます（PDMSラック最大5倍、およびPTFEスペーサー延々と。）。使用後、脱イオン水およびオートクレーブ内で二回沸騰、水を使って手動でそれらをきれいに。ラックを再使用するときに薬がPDMSによって吸収される可能性があるとして、潜在的なキャリーオーバー効果の点に注意してください。
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Representative Results
EHTの心臓分化と準備
HiPSCは、成長因子低減基底膜マトリックス上に展開EDTA、一晩スピナーフラスコに形成された胚様体（EB）を用いて解離させました。 3日間、中胚葉誘導後、心臓分化はのWnt阻害剤で開始しました。分化プロトコルの〜17日後、拍動EBをコラゲナーゼタイプII（ 図1）を用いて単一細胞に分離しました。 EHTsを直ちにEB解離（ 図2）の後、100μLの組織あたり1.0×10 6細胞を新たに単離した心筋細胞から調製しました。凍結した細胞（ 例えば 、商業的供給業者）からの調製のために、細胞を培地に滴下再懸濁により解凍し、遠心分離した後、ECMに再懸濁しました。 48時間以内に、単一細胞の自発的な拍動は、EHTに顕微鏡観察されました。次の日に、心筋細胞は、組織の力線に沿って縦方向に広がって結合され、コヒーレントに暴行EHTを形成しました。 PDMSポストの肉眼で見えるたわみはEHTの分析機器を用いて測定しました。
収縮解析
EHT収縮の分析は、映像光記録（ 図3）に基づいていました。システム内で、EHTs有する24ウェルプレートは、ガラス屋根の気体及び温度制御インキュベータチャンバ内に配置しました。電動XYZ軸に接続されたカメラは、このユニットの上方に位置し、XYZ座標は、ソフトウェアプログラムを用いて各EHTのために定義されました。各EHTの分析は、組織の上端及び下端に図形認識に基づいていました。自動化されたソフトウェアアルゴリズムは、ポストたわみやELAに基づいて撮影EHT収縮と計算された力の発達を分析しましたPDMSポストのsticity /ジオメトリー（ 補足図1）11。所定の基準に従ったピークの決意した後に、PDFレポートは、すべてのEHTs（ 補足図2）のための収縮性のパラメータをまとめます。
長期測定での安定性
EHTsの長期測定は20分毎に自動化された繰り返し測定と連続モードで行いました。収縮解析は、高レベルの安定性を示し、最大20時間、周波数、収縮時間T1又は緩和時間T2を破って、（ 図4）の収縮力には経時変化（線形トレンドのためのポストテストしていない有意な）を示しませんでした。しかし、すべての生物学的サンプルと同様の生物学的複製のために予想されるように、EHTsは、変動のいくつかのレベルを示しています。最初と長期measuの終わりの変動係数リーメントは、緩和時間のための収縮時間の周波数に対する％、4/3％及び4/3％は、それぞれ、12月6日、7月13日力用％であった（N = 4）。各単一EHTの結果は再現可能であり、低い変動性（ 補足図2）を有するように生物学的複製物間のこの変動は、図形認識や分析のアーチファクトではありません。
薬物スクリーニング
薬物スクリーニングは、無血清タイロード液中で行いました。累積濃度応答曲線は、0.1％の最大DMSOビヒクル濃度で生成されました。ベースライン収縮分析は、反復間のパターンと非常に低い変動を破っに非常に小さな不規則性を示しました。 hERGチャネル遮断E4031への曝露は、より高い濃度（ 図5）で10 nmおよび不規則な拍動パターンにおける緩和時間（T2）の有意な延長をもたらしました。 FREQUENC用Y制御収縮解析、測定値は、必要に応じて炭素電極を用いて電気刺激を用いて行きました。
図1：心臓分化。 （A）ヒト人工多能性幹細胞。スケールバー=100μmです。中胚葉分化の開始時に（B）胚様体。スケールバー=100μmです。 （C）心臓分化の終了時に、胚様体を締約。スケールバー=100μmです。 （D）ヒト心臓組織を操作しました。スケールバー= 1ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ENGINの世代eered心臓組織（EHT）。 （A）PTFEスペーサ。 （B）PDMSラック。 PTFEスペーサを除去した後、アガロースモールドを鋳造すると、24ウェルプレートのウェルに、（B）スケールバー= 1センチ（C）は上面図。 （D）鋳型内に配置PDMSラックから支柱のペア。 （E）の再構成のミックスは、鋳造金型にとPDMSの柱の周りにピペットで入れ。培地を新しい培養皿に移し、0日目（F）を新たに生成EHT、。 15日目で培地中でEHT改造（G） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：エンジニア心臓組織の収縮解析（EHT）。 （A）EHTLEDパネルの上に24ウェル培養皿中EHTsと気体と温度制御インキュベーションチャンバー上記コンピュータ制御カメラで分析機器。 （B）、自動収縮解析ソフトウェアで分析中EHTのライブビュー。 （C）は、第2及び拡大概略収縮ピークあたり100のフレームで測定された時間にわたって収縮力を表示する例示的な収縮パターン、分析パラメータ力、収縮時間（T1）、緩和時間（T2）、収縮速度（CV）、緩和速度（表示RVは、この数字は7と27）から転載されています。 DH：収縮解析のためのパラメータ。図形認識に影響を及ぼす異なるフィルタレベル（青濾過ライン）の（D）として。左：フィルタレベル= 0ない青色濾過ラインが表示されないことに注意が、唯一の赤のオリジナルのトレース。中央：フィルタレベル= 3番目の理想的な認識/分析を示します電子収縮ピーク。右：青色濾過ラインが乏しい収縮ピーク分析を示す元のトレースよりもはるかに小さいこと= 20注フィルタレベル。高すぎる力閾値（左）と認識された全てのピークを有する下部力閾値（右）で分析不整脈EHT収縮の（E）の例。 （F）収縮後の初期との長時間の緩和時間を生じるナトリウムチャネルアゴニストATX-IIに露出EHTsの例トレース。左のパネルの第四収縮ピークが低すぎる最小要因に（何の緑の四角）を認識していないされていないことに注意してください。 （G）（右パネル）との収縮ピークの例および無し（右パネル）ピンクの曲線（収縮曲線、収縮および弛緩速度の一次導関数）。 （H）マウスおよびヒトEHTsのパラメータの推奨の概要。 、これらのパラメータは、薬物曝露の際に収縮パターンの変化に応じて調整する必要があることに注意してください（Eを参照してくださいF）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：自然発症ヒト操作心臓組織を打つの長期測定（EHT）時間コントロール。自発的に人間工学心臓組織（EHT）を破っての長期測定時の時間制御。 EHTsはEHT分析装置内に配置し、20時間の期間インキュベートしました。自動収縮分析は線形トレンドのために重要ではない事後テストで20分毎に行った（N = 4;データは平均±標準偏差を表します）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
トン= "図5" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 55461 / 55461fig5.jpg" />
図5：人間のエンジニア心臓組織上のhERGチャンネルブロッカーE4031（EHT）の効果。
（A）ベースラインでの典型的な収縮パターン。 （B）300 nMのE4031におけるインキュベーション後の典型的な収縮パターン。 （C）平均収縮ピーク（N = 4）ベースラインで電気的に刺激EHTs（ブラック）および100nM E4031（赤）で30分間のインキュベーション後。毎秒100のフレームと分析。自発的にヒトEHTsを破っにE4031のための（D）の濃度応答曲線。自発的に拍動EHTs対電気刺激EHTs（C）（D）でT2延長が小さい効果の大きさに注意してください。ベースライン対Dunnettの事後検定と一元配置ANOVA、反復測定。 * P <0.05; N = 300 nMでのE4031でT2延長4. Z」因子25が 0.75です。PG」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 人間 | ラット | マウス | |
| 細胞 | 26.4x10 6 | 10.8x10 6 | 18.0x10 6 |
| 2xDMEM [μL] | 147 | 147 | 147 |
| 基底膜マトリックス[μL] | 264 | - | 264 |
| Y-27632 [μL] | 2.6 | - | - |
| フィブリノゲン[μL] | 66.8 | 66.8 | 66.8 |
| ECM [μL] | 広告2640 | 広告2640 | 広告2640 |
表1：Pのためのピペッティングスキーム24ヒト、ラットおよびマウスEHTsための再構成ミックスの賠償。フィブリノーゲン濃度は、すべてのEHTsために5mg / mLです。細胞濃度は、それぞれの種ごとに異なることに注意してください。ヒトEHTsため、基底膜マトリックスを追加する（ 例えばマトリゲル、 材料表を参照）、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632混合します。マウスEHTsについて、基底膜マトリックスを追加します。細胞懸濁液の初期濃度に依存して、2640μLの再構成ミックスの総量に到達するために追加的なECMを追加します。
補足図1：ポストたわみ 26 に基づいて、収縮力のための計算式 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足図2：ソフトウェアの収縮解析レポートからの典型的なデータの抜粋。
上部：100フレーム/秒（：、：収縮速度ピンク収縮力赤）で記録された時間の20秒を超える収縮ピーク。底：最小、平均、最大値、および緑の正方形（上部）の付いた18の分析収縮ピークの標準偏差を示す分析収縮パラメータ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
エンジニア心臓組織は、心血管研究のツールボックスに貴重なオプションを提供しています。 24ウェルフォーマットにおけるEHTsは、疾患のモデリング8、14、薬剤の安全性スクリーニング7、8、10、11、15、または基本的な心臓血管研究16、17のために価値のあることが証明されています。
基本EHTプロトコルの潜在的な変更は、心筋細胞と非心筋細胞18および後負荷増強14の定義された混合物との細胞相互作用の研究が挙げられます。トラブルシューティングのための重要な側面は、入力された細胞集団の品質およびフィブリノーゲンの質が含まれます。初期のゲル形成が不規則またはトンを固執するのに十分にコンパクトではない場合ゲルは急速低アプロチニン濃度にキャストした後、数日以内に縮退されている場合のポストPDMS O、または、EHTs生成は成功しません。
以下の制限を考慮しなければなりません。 （i）は、24ウェルフォーマットにおけるスループットは、一次スクリーニングの設定に適していないが、二次確認画面に十分です。 （ii）の力、収縮速度とリズムの統合読み出しが困難特定の分子機構に力の変化をリンクすることを可能にする低い特異性を有しています。 3D培養形式屈曲PDMS支柱によって課さストレッチは成熟の形態学的および機能的側面を改善しながら（iii）は、通常アドレナリン応答より真介在板、自発拍動の欠如、および下部は、完全な心臓の成熟をまだ用いて達成されていないことを示しますこのプロトコル。 （IV）PDMSは、種々の延び19と実際の有効concentratに異なる薬物を吸収することが示されていますEHTsのイオンは異なる場合があります。このバイアスは7、8、はっきりとは手元に薬に依存急性薬物効果を調査したものより15を研究する慢性毒性でより顕著かもしれません。その結果、薬にさらされる任意のPDMSラックは、使用後に廃棄されなければならないと異なる薬剤の潜在的な吸収は、データを分析する際に考慮される必要があります。 （v）は1×10 6 hiPSCsは、データポイントあたりのコストが高いEHTごとに必要とされているという事実を考えます。
ex vivoでの心臓収縮の解析に比べて、このプロトコルの重要性は、特定の遺伝的背景に大きな研究を設定することができます人間のシステムで作業する可能性、実験運転ダウンの欠如、およびEHTsの標準化生産（ 例えば疾患モデルであります）。他のhiPSCテストシステム（マルチ電極アレイ、インピーダンス）と比較して、このシステムは、分析しますS三次元構造における心筋細胞の最も重要な生理学的パラメータとして収縮力と定義された負荷の下で培養することが可能となります。 EHTs契約を定期的および長期的な測定および慢性毒性の評価を可能に多くの時間と数週間にわたって安定した力、周波数とリズムで。 EHT分析は、筋収縮や薬物の影響に対する潜在的影響力 - 周波数関係にに関して重要である電気刺激下で行うことができます。 hiPSC-CMの未熟状態に関して、電気刺激は、より成熟した表現型20に向かって細胞をプッシュする可能性を有する21及びEHTメンテナンスに含めることができます。また、EHTテストシステムは、全ての標準的な組織学的パラメータ、並びに生化学（RNA、DNA、タンパク質の単離）11を含む高含量読み出しを提供します。潜在的な将来のアプリケーションには、側面が含まれます同系対照のCRISPR / Cas9媒介世代と組み合わせて、特に薬剤開発（標的検証、安全性薬理）及び疾病モデルの。
EHTsおよび濃度 - 応答曲線の性能のメンテナンス時に、慎重に24ウェルプレート間のPDMSラックの転送中の真菌汚染を避けるために、無菌の細胞培養手順のための指示に従うことが重要です。 EHTとの最も重要なステップは、しかし、心筋細胞分化プロトコルです。 EHTsがコヒーレント拍動筋肉ストリップを形成するため、入力された集団は、少なくとも60％の心筋細胞で構成しなければなりません。幸いなことに、分化プロトコルは、年間でより堅牢かつ効率的になり、心筋細胞は、今では容易に市販されています。 hiPSC由来設計心臓組織の発達における非筋細胞の役割はまだ完全には理解されていません。高純度のhiPSC-CMを用いた実験では、驚くほど良いEHTにつながりました組織への他の細胞型のお尻=「外部参照」> 7が、統合は組織の機能を改善することが示されており、成熟した生理学22、23、24に向けて表現型を押すかもしれません。組織は、組織ごとに百万細胞を24ウェルフォーマットで生成されるため、このプラットフォームは、まだかなり高価です。 96ウェルフォーマットにスケールダウンする熱望が、この欠点outbalancesこれまで堅牢されます。この原稿で提示プロトコルは、技術的反復の間にはほとんど変動と非常に堅牢です。イントラバッチ変動は、（変化= 5％の係数を意味する）動態のために非常に低く、自発拍動周波数（変化の10％の係数を意味する）と、収縮力（変形17％の係数を意味する）のために幾分大きいです。技術は非常に堅牢です。異なる実験者横切って、叩解EHTsを生成する効率が鋳造ヒドロゲルの> 90％です。
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Disclosures
IM、TEとAHはEHT Technologies GmbH社、ドイツの共同設立者です。
Acknowledgments
著者は、材料の彼らの現物出資のためのアレッサンドラ・モレッティとデニス・シャーデに感謝しています。私たちは、実験薬理学およびUKEの毒性の部門でのiPSとEHTワーキンググループの素晴らしいサポートを認めます。著者の作品はDZHK（循環器病研究のためのドイツ語センター）と教育のドイツの研究省（BMBF）、ドイツの研究財団（DFGエス88 / 12-1、HA 3423 / 5-1からの助成金によってサポートされています）、研究中の動物の交換洗練＆リダクション（NC3Rsクラック-ITの助成金35911から259146）のために英国のナショナルセンター、英国心臓財団RM / 30157分の13、欧州研究評議会（アドバンスト・グラントIndivuHeart）、ドイツ心臓財団そしてFreieウントHansestadtハンブルク。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 mL falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
References
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- EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.
