Summary
Hier zeigen wir die Herstellung von humanen konstruierte Herzgewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten. Wir stellen eine Methode Kontraktionskraft und beispielhafte Veränderung der Kontraktionsmuster durch den hERG-Kanal-Hemmer E-4031 zu analysieren. Dieses Verfahren zeigt hohe Robustheit und die Eignung für das Herz Wirkstoff-Screening.
Abstract
Cardiac Tissue Engineering beschreibt Techniken dreidimensionale Krafterzeugungs engineered Gewebe zu bilden. Für die Umsetzung dieser Verfahren in der Grundlagenforschung und die präklinische Entwicklung von Medikamenten, ist es wichtig, Protokolle zur automatisierten Generierung und Analyse unter standardisierten Bedingungen zu entwickeln. Hier präsentieren wir eine Technik Engineered Herzgewebe (EHT) von Kardiomyozyten verschiedener Spezies zu erzeugen (Ratte, Maus, Mensch). Die Technik beruht auf der Anordnung eines Fibrin-Gel, das dissoziiert Kardiomyozyten zwischen elastischer Polydimethylsiloxan (PDMS) Einträgen in einem 24-Well-Format. Dreidimensionale, krafterzeugende EHTs bilden innerhalb von zwei Wochen nach dem Gießen. Dieses Verfahren ermöglicht die Erzeugung von mehreren hundert EHTs pro Woche und ist technisch nur durch die Verfügbarkeit von Kardiomyozyten (0,4-1,0 × 10 6 / EHT) begrenzt. Bewertung der auxotonisches Muskelkontraktionen in einem modifizierten Inkubationskammer mit einem mechan durchgeführtische Verriegelung für 24-Well-Platten und eine Kamera auf der Oberseite dieser Kammer angeordnet. Eine Software steuert eine Kamera auf einem XYZ-Achsensystem an jede EHT bewegt. EHT Kontraktionen werden durch eine automatisierte Figur Erkennungsalgorithmus erkannt wird, und wird eine Kraft berechnet, basierend auf Verkürzung der EHT und die elastische Neigung und die Geometrie der PDMS Beiträge. Dieses Verfahren ermöglicht die automatisierte Analyse von hohen Zahl von EHT unter standardisierten und sterilen Bedingungen. Die zuverlässige Erkennung von Arzneimittelwirkungen auf Kardiomyozyten Kontraktion ist von entscheidender Bedeutung für die Herzarzneimittelentwicklung und Sicherheitspharmakologie. Wir zeigen, mit dem Beispiel der hERG Kanalinhibitor E-4031, dass das menschliche EHT System Arzneimittelantworten auf der Kontraktion Kinetik des menschlichen Herzens nachbildet, angibt, dass es ein vielversprechendes Werkzeug für die kardialen Arzneimittelsicherheit Screening sein.
Introduction
Herznebenwirkungen wie die Arzneimittel-induzierte Long-QT-Syndrom haben Rücknahme aus dem Markt in den letzten Jahren geführt. Statistiken zeigen , dass etwa 45% aller Abhebungen fällig sind , um unerwünschte Auswirkungen auf das Herz - Kreislauf - System 1. Dieses Medikament Versagen nach dem teueren Entwicklungsprozess und die Genehmigung ist das Worst-Case-Szenario für Pharmaunternehmen. Forschungs- und Entwicklungsabteilungen konzentrieren sich daher auf dem Nachweis von solchen unerwünschten kardiovaskulären Wirkungen frühzeitig zu erkennen. Aus wirtschaftlichen und ethischen Bedenken, die Bemühungen um Tierversuche zu reduzieren und ersetzen sie durch neue in - vitro - Screening - Tests sind im Gange.
Eine Reihe von etablierten Assays sind in den Vereinigten Staaten Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel - Agentur (EMA) Richtlinien für die präklinische Bewertung von proarrhythmischen Arzneimittelwirkungen 2 enthalten. Die Technologie von somatischen Zellen durch Differenzierung gefolgt Umprogrammierung vonmenschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) verstärkt dieses Forschungsgebiet 3. Es bietet nun die Möglichkeit , neue Medikamentenkandidaten auf dem menschlichen Kardiomyozyten in vitro zu screenen und vermeidet Probleme mit Wechselwirkungen zwischen den Arten Unterschieden. Aktuelle Herzdifferenzierungsprotokolle 4, 5 bieten unbegrenzte Versorgung von Kardiomyozyten ohne ethische Bedenken. Die Messung der Kontraktionskraft ist die wichtigste und am besten charakterisierte jedoch in vivo Parameter von Kardiomyozyten, nicht gut etabliert. Dies hängt mit der relativen Unreife 6 des menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) im Vergleich zu dem erwachsenen Kardiomyozyten. Eine mögliche Weiterentwicklung ist 3-dimensionale Herzgewebe aus einzelnen Zellen zu konstruieren , 7 (engineered Herzgewebe, EHT). Das EHT - Protokoll basiert auf einzelnen murinen oder humanen Kardiomyozyten Einbettung 8 sup>, 9, 10 in Fibrinhydrogel zwischen zwei flexiblen Polydimethylsiloxan (PDMS) Pfosten 11 in 24-Well - Format. Innerhalb von wenigen Tagen beginnen die Kardiomyozyten spontan als einzelne Zellen zu kontrahieren und starten Mobilfunknetze zu bilden. Nach 7-10 Tagen sind makroskopische Kontraktionen des gesamten Gewebes sichtbar. Während dieses Prozesses wird die extrazelluläre Matrix umgestaltet, was zu einer Abnahme des Durchmessers und der Länge führt. Die Verkürzung der EHT Ergebnisse in der PDMS Biege Post auch während der Ruhe, Kardiomyozyten in der Entwicklung von EHT zu Dauerbelastung ausgesetzt wird. EHTs weiterhin auxotonisches Muskelkontraktionen über mehrere Wochen durchzuführen. Human EHTs zeigen Reaktionen auf physiologische und pharmakologische Stimulation anzeigt , deren Eignung für Wirkstoff - Screening und Krankheit 7 modellieren.
In diesem Manuskript präsentieren wir ein robustes und einfaches Protokoll für die Generatiauf der menschlichen EHT, und die automatisierten Analyse von Kontraktilität konzentrationsabhängigen Veränderungen des Kontraktionsmusters in Gegenwart von hERG Kanalinhibitoren.
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Protocol
HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben ein Zellkultur-Protokoll. Bitte führen Sie unter sterilen Bedingungen und Verwendung vorgewärmten Medien.
1. Cardiac Differenzierung von hiPSC
- Pflegen Sie den hiPSC
- Mantel 6-Well - Platten (1 ml / Well) oder T75 - Kolben (7 ml / Kolbe) mit reduziertem Wachstumsfaktor Basalmembranmatrix (zB geltrex, 1: 200; siehe Tabelle von Materialien) , verdünnt in Dulbeccos modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) für 30 min bei 37 ° C. Bereiten FTDA Medium 12 durch Mischen von Grund DMEM / F-12 Medium mit 2 mM L-Glutamin, 0,5% Penicillin / Streptomycin, 5 mg / l Transferrin, 5 ug / l Selen, 0,1% menschliches Serumalbumin, 1x Lipid-Mischung, 5 mg / l Insulin, 50 nM Dorsomorphin, 2,5 ng / mL Activin A, 0,5 ng / ml menschliches TGFß1 und 30 ng / mL FGF-2.
- Seed hiPSC (~ 3 × 10 5/10 cm²) in FTDA Medium und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2, 21% O 2 mit täglichem Mediumwechsel (Abbildung 1a). Bei 80% Konfluenz, Durchgang (1: 2-1: 6) mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 0,5 mM; Inkubationsdauer ~ 4 min).
- Die Bildung von Embryoidkörpern (EB)
- Pflegen hiPSC in T75-Flaschen zu hohen Dichte.
- Waschen Kolben mit konfluenten Zellen zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Calcium und Magnesium (PBS) gewaschen und in 0,5 mM EDTA für ~ 10 min inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht vom Boden des Kolbens lösen.
- Entfernen EDTA mit Glaspipette, wegzuspülen Zellen mit 10 ml PBS, tap-Kolbe bei der Bank Zellen abzulösen.
HINWEIS: Verwenden Sie Zellschaber, falls erforderlich. - Collect Zellen in 50 ml konischen Röhrchen, fügt ¼ des Volumens (zB 10 ml RMPI auf 40 ml Zellsuspension) RPMI 1640 - Medium (oder ein beliebiges anderes Standardmedium enthaltend 1,8 mM Calcium) und Zentrifuge bei 250 × g für 5 min.
- Resuspendieren Zellpellet in FTDA Medium, das mit 4 mg / ml Polyvinylalkohol (PVA), ergänzt und10 uM Y27632 und die Zellen in einer Neubauer Kammer zählen.
- Füllen Sie das Rührkolben mit der Zellsuspension (30 x 10 6 Zellen / 100 ml Medium mit PVA FTDA ergänzt und Y-27632; siehe Schritt 1.2.2) und initiieren EB Bildung in spinner flasks (justieren Rotordrehzahl von Magnetrührers bis 40 Umdrehungen pro Minute ) im Zellkultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 5% O 2) über Nacht.
- Pflegen hiPSC in T75-Flaschen zu hohen Dichte.
- mesodermalen Differenzierung
- Während EB Bildung mantel Zellkulturflaschen für Suspensionskultur mit nicht-ionischem Tensid (14 ml / T175) über Nacht bei 37 ° C geeignet.
- Am nächsten Morgen, wasche Tensid beschichteten Kolben zweimal mit PBS (30 ml / T175). In PBS wieder und halten in den Inkubator, bis sie benötigt.
- Entfernen Sie die Spinnerflasche aus dem Inkubator.
HINWEIS: Die Zellsuspension sollte mit kleinem makroskopisch sichtbarem EBs (Abbildung 1B) klar sein. - Übertragung von 50 ml Suspension zu einer 50 ml konischen tubEBs e und lassen Sie regeln für 5-20 min.
- Entfernen Sie den Überstand und wäscht das Pellet mit 7 ml RPMI 1640, ergänzt mit 2% PVA und 10 & mgr; M Y-27632. Transfer Suspension zu einem graduierten 15 ml konischen Röhrchen und Schätzung EB Volumen (~ 50-100 ul).
- Übertragen Sie Inhalte der Spinnerflaschen zu unbeschichteten T175-Flaschen und lassen diese auf V-förmige Gestell für die Sedimentation für bis zu 20 min. Überstand entfernen und waschen Embryoidkörpern wie oben angegeben. Sie nicht den T175-Kolben mit mehr als 200 ml füllen, wie Sedimentation zu lange dauern würde. Wenn anfängliches Rührkolben Volumen 200 ml überschreitet, aufgeteilt EB Suspension auf mehr T175-Flaschen und kombiniert EBs nach dem Waschen wieder.
- Entfernen Waschmedium und Resuspension in Medium für mesodermalen Differenzierung, dh RPMI mit 4 mg ergänzt / ml PVA, 0,5% Penicillin / Streptomycin, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 0,05% Humanserum Albumin, 5 ug / ml Transferrin, 5 ng / ml Natriumselenit, 0,1% Lipid-Mischung, 250 uM phospho-Ascorbat, 10 uM Y-27632, 10 ng / mL knochenmorphogenen Protein-4 (BMP-4), und 3 ng / mL Activin A, 5 ng / ml stabil FGF2.
- Entfernen von PBS Tensid beschichteten T175-Kolben und füllt mit Zellsuspension (200 ul EBs in 40 ml) zugegeben. Verwenden Sie kleinere Flaschen für kleinere EB Volumen.
- Kultivieren EBs in Suspension für drei Tage (37 ° C, 5% CO 2, 5% O 2). Austausch von 50% des Mediums (gleiche Zusammensetzung wie in Schritt 1.3.7) jeden Tag (Verwendung V-förmige Sedimentation Rack). Bereiten Medium täglich frisch vor der Fütterung.
- Herzdifferenzierung
- Bereiten Sie neue Tensid-beschichtete Gefäße am Tag vor und zu handhaben, wie oben (1.3.2) angegeben.
- Nach drei Tagen der mesodermalen Induktion, lassen EBs für bis zu 5 min auf Sedimentation Rack absetzen. Entfernen der größte Teil des Mediums und Waschen mit RPMI 1640, ergänzt mit 0,5% Penicillin / Streptomycin und 10 mM HEPES.
- Transfer 10 ml EB Suspension graduierte15 ml-Röhrchen und Schätzung EB Volumen nach der Sedimentation.
- Resuspendieren EBs sorgfältig in Medium kardiale Differenzierung, bestehend aus RPMI 1640, ergänzt mit 0,5% Penicillin / Streptomycin, 10 mM HEPES, 0,05% Humanserumalbumin, 5 ug / ml Transferrin, 5 ng / ml Natriumselenit, 0,1% Lipid-Mischung, 250 & mgr; M phospho -ascorbate, 1 uM Y-27632, 100 nM Wnt-Inhibitor DS-I-7 13.
- Übertragen EBs neue tensidhaltige beschichteten Zellkulturflaschen (~ 200 & mgr; l EBs in 46 mL / T175).
- 3 Tage inkubieren (37 ° C, 5% CO 2, 21% O 2) mit 50% Mediumwechsel am zweiten und dritten Tag (mittlere Zusammensetzung Schritt 1.4.4 sehen). ändert das Medium nicht in den ersten 48 Stunden.
- Inkubiere in Medium , bestehend aus RPMI 1640 , ergänzt mit 500 & mgr; M 1-Thioglycerin, 10 mM HEPES, 0,5% Penicillin / Streptomycin, 1 & mgr; M Y-27632, 2% serumfreien neurale Zellkultur - Ergänzung (zB B27) mit Insulin, 100 nM Wnt -Inhibitor DS-I-7 mit täglichem Austausch von 50% Medium für die nächsten vier Tage. EBs sollte schlagen innerhalb dieser Frist beginnen.
- Nach einer Woche der Herzdifferenzierung, wechselt auf das gleiche Medium ohne Wnt-Hemmung und mit serumfreiem Ergänzung neurale Zellkultur. Ändern Sie 50% des Mediums jeden Tag, außer für den ersten Tag.
- Die Dissoziation von menschlichen Kardiomyozyten
HINWEIS: Nach zwei Wochen Differenzierung Protokoll, EBs spontane Kontraktionen (1C) zeigen. Wenn ja, Dissoziation beginnen und Kollagenase-Lösung herzustellen.- Bereiten Kollagenase-Lösung durch Auswiegen und Lösung von 200 U / ml in calciumfreier balanced salt solution Hanks ohne Calcium / Magnesium (HBSS) und füge 1 mM HEPES, 10 & mgr; M Y-27632, 30 & mgr; M N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid ( BTS). Sterilisieren durch Filtration (0,2 um Filter) und Speicher-Aliquots bei -20 ° C. Auftauen Aliquots bei 4 ° C über Nacht.
- Settle EBs auf Sedimentation Rack,Aspirat Medium und Ersetzen mit 20-25 ml vorgewärmtem HBSS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal.
- Aspirat HBSS und ersetzen mit vorgewärmtem Kollagenase-Lösung (15 ml / T175). Inkubieren für 4 h in dem Zellkultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 21% O 2).
- Bereiten Blockierungspuffer mit DMEM, ergänzt mit 1% Penicillin / Streptomycin und DNase (12 & mgr; g / ml).
- Tippen Sie auf die Zellkulturflaschen auf der Bank, distanzierten EBs sollte auseinander zerfallen und fällt (wenn nicht, erhöht Inkubationszeit). Sanft triturate Zellsuspension und in ein konisches 50 ml-Röhrchen. Waschen Kolben mit Blockierungspuffern (15 ml / T175) aufnehmen und in Röhrchen.
- Zentrifuge für 10 min bei 100 x g. Die Zellen in warmer DMEM, verreiben und Zellen zählen.
2. Erzeugung von Engineered Herzgewebe (EHT)
- Autoklaviert handelsüblichen PDMS Gestellen und Polytetrafluorethylen (PTFE) Abstandshalter (siehe Materialien undAusrüstung Tabelle; Abbildung 2) und die folgenden Lösungen unter sterilen Bedingungen vorbereitet, ein Tag vor der EHT - Generation.
- Bereiten 2% Agarose durch Abwiegen und Auflösen in geeigneten Volumen PBS, Autoklaven, sofort lagern bei 60 ° C.
- Bereiten Aprotinin (33 mg / mL) und durch Wägung in geeigneten Volumen an Aqua ad iniectabilia gelöst wird, Filter steril (0,22-um-Filter), Aliquot und Lagerung bei -20 ° C.
- Bereiten Fibrinogen (200 mg / ml) durch sterile Fibrinogen in geeigneten Volumen von sterilen 0,9% NaCl (lauwarmer) Auflösen, Aliquot und Lagerung bei -20 ° C.
- Bereiten Thrombin (100 E / ml) durch Auflösen sterile Thrombin in drei Teilen sterilem PBS und 2 Teilen Aqua ad iniectabilia, aliquoten Teilen von 3 & mgr; l in Röhrchen und Lagern bei -20 ° C.
- Bereiten 10x DMEM durch Auflösen von 670 mg 10-fach DMEM Pulver in 5 ml Aqua ad iniectabilia, das Filter steril und lagere bei 4 ° C.
- Bereiten Sie 2x DMEMdurch Mischen von 2 ml 10x DMEM mit 2 ml hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 0,2 ml Penicillin / Streptomycin und 5,8 ml Aqua ad iniectabilia, das Filter steril und lagert bei 4 ° C.
- Bereiten EHT gießenden Medium (ECM) durch DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% L-Glutamin (200 mM) bei 4 ° C gemischt wird.
- Bereiten von Gießformen in Platten mit 24 Vertiefungen pipettiert , 1,6 ml warmem Agarose (2%, PBS) und Platzieren des PTFE - Abstandshalter (2A) in die Vertiefungen.
HINWEIS: Legen Sie Abstandshalter unmittelbar nach dem Pipettieren in maximal 8 Vertiefungen - Agarose erstarrt sehr schnell. Sie nicht die Agarose bei Raumtemperatur für länger als 5 Minuten verlassen. - Nach Agarose Erstarren (~ 10 min, Agarose wird opake Umdrehung), entfernen Sie die PTFE Abstandshalter (2C) und die PDMS - Gestellen (2B) in die Gießformen platzieren , so dass Paare von PDMS - Stellen in jede Form (2D) erreichen.
- Bereiten 110% des geschätzten Volumens der Rekonstitution Mischung in einem Rundboden-15-ml-Röhrchen auf ice.For 24 EHTs pipettieren die Rekonstitution Mischung, die in Tabelle 1 für Menschen, Ratte oder Maus-Cardiomyocyten, bzw. (10% zusätzliches ist enthalten).
HINWEIS: Die Zellkonzentration der Rekonstitution Mischung ist unterschiedlich für humane (10 x 10 6 Zellen / ml), Ratte (4,1 x 10 6 Zellen / ml) und Maus (6,8 x 10 6 Zellen / ml) EHTs. In Abhängigkeit von der Konzentration der Zellsuspension, fügen Sie zusätzliche ECM zu einem Endvolumen von 2640 ul. Fibrinogen hat zum Pipettieren lauwarm sein. Füllen langsam die Spitze der Pipette und nicht über die Oberfläche der kalt Rekonstitution Mischung mit dem Fibrinogen-enthaltenden pipet berühren, wenn Fibrinogen an die Rekonstitution Mischung Zugabe von - die Viskosität des Fibrinogens in der Pipettenspitze sofort erhöhen würde. - Verreibe den Rekonstitution mix 10 - 15 mal mit einer serologischen Pipette bis zum Fibrinogen Gerinnsel aufgelöst wird. Überprüfen Sie die Rekonstitution Mischung in der Pipette auf Homogenität.
- Für jede EHT, Jeweils 100 & mgr; l der Rekonstitution Mischung in einem Thrombin - Aliquot (3 ul in 200 ul Röhrchen), mischen und die Mischung in den Agarose-Schlitze so schnell wie möglich (Figur 2E) pipettieren. Verwenden Sie für jede EHT eine neue Filterspitze. Resuspendieren der Rekonstitution Mischung (Verreibung mit serologischen Pipette 5-10mal) nach jeweils 8 EHTs.
- Sobald alle Schlitze mit Rekonstitution Mischung gefüllt sind, schließen den Deckel der Zellkulturschale und inkubieren bei 37 ° C, 7% CO 2 für 2 h.
- Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und unter einer sterilen Haube. Jeden Auftrag mit einer kleinen Menge an Medium (zB DMEM, etwa 200 bis 500 & mgr; l) und schüttelt die Platte vorsichtig und inkubiere wieder bei 37 ° C für mindestens 10 min. Die Zugabe von DMEM wird die Entfernung von Fibringelen aus Agarose-Gussformen erleichtern.
- Entfernen Sie vorsichtig die PDMS - Racks aus den Agarose - Gußformen und sie auf das Medium gefüllten 24-Well - Platte (2F). Die Schale zurück in den Inkubator (37 ° C, 7% CO 2, 40% O 2 für die menschliche und Ratten - EHTs, 21% O 2 für Maus EHTs) und Futter montags, mittwochs und freitags mit frisch hergestelltem EHT-Medium. EHTs sollten spontane Kontraktionen zeigen die Beiträge des PDMS - Racks 7-10 Tage nach dem Gießen (Figur 1D, 2G) ablenkt.
- Für Maus EHTs hinzuzufügen 25 ug / ml 5-Cytosin βDarabinofuranoside zu Kulturmedium für 48 h Fibroblastenproliferation zu begrenzen.
3. Übersetzung Analyse
HINWEIS: Die Kontraktion Analyse basiert aufVideo-optische Aufzeichnungs in einem kommerziell erhältlichen Analysegerät EHT (siehe Tabelle der Materialien). Die Zentraleinheit dieses Instruments ist eine Inkubationskammer (3A). Die Software mit dem Instrument zur Verfügung gestellt berechnet Kontraktionskraft basierend auf Durchbiegung der PDMS Pfosten mit bekannten Elastizitätsmodul und die Geometrie 11 (Supplementary Abbildung 1).
- Schalten Sie die Heizungseinrichtung der Maschine 2 h vor der Messung. Einschalten Gasversorgung und elektronische Versorgung des Achsensystems unmittelbar vor der Kontraktionsanalyse.
- Zur Basislinienaufzeichnung (Referenzpunkt in der Analyse) werden die 24-Well-Platte mit dem EHTs in EHT-Medium in das Analyseinstrument EHT und die Kontraktion Analysesoftware gemäß Anbietern manuell starten.
- Klicken Sie auf das Register „Protokoll“ auf der rechten Seite und geben Sie relevanten Informationen über Studiennamen, Benutzer, spezies, cell Typ, Alter, Aufzeichnungslänge und zusätzliche Bemerkungen.
- Klicken Sie auf den „Kamera-Ansicht“ -Reiter auf der linken Seite und startet Kamera-Live-Modus mit automatischem Bild-Erfassungsmodus. Auf die „Setup“ Register auf der rechten Seite andadjust die Kameraposition mit der xyz-Koordinaten für jeden gut in der 24-Well-Schale. Stellen Sie sicher, dass das EHT in der Mitte des Fensters ist und im Fokus der Kamera.
- Stellen Sie sicher, dass der Deckel der Zellkulturschale nicht neblig ist als diese Zahl Anerkennung und Kontraktion Analyse beeinträchtigen.
HINWEIS: Die Abbildung Erkennungsalgorithmus auf der Erfassung hohen Kontrastbereiche basiert und die Überwachung ihrer Positionsänderung. In der Software dieser Bereiche der Figurenerkennung werden mit einem blauen Kreuz markiert werden, die mit den Kontraktionen des EHT bewegt. - Vergewissern Sie sich, dass die Positionen der blauen Kreuz beide sind an den oberen und unteren Enden der EHTs und nur vertikal Bewegen die Kontraktionen der EHTs (3B) übereinstimmt. Save Einrichtpositionen jede Vertiefung durch den Button „Position ok“ drücken.
- Stellen Sie sicher, dass der Deckel der Zellkulturschale nicht neblig ist als diese Zahl Anerkennung und Kontraktion Analyse beeinträchtigen.
- Als nächstes klicken Sie auf die Registerkarte „Parameter“ auf der linken Seite. Die Parameter hier angezeigt definieren die Kriterien, nach denen die Software eine Kontraktion Spitze identifiziert und markiert sie mit einem grünen Quadrat. Diese Werte sind sehr wichtig für die korrekte Identifizierung der Kontraktion Peaks (Figur 3C) und keine falschen Datenpunkte (3E-F).
HINWEIS: Eine Liste von Arten abhängigen Parameter und Beispiele ist in Abbildung 3 H dargestellt. Weitere Einzelheiten finden Sie in der Software-Handbuch. - Klicken Sie auf die „Automatik“ Reiter auf der rechten Seite und starten Sie die Analyse durch die Schaltfläche „Start“ aktiviert wird. Die Software bewegt sich sequenziell von einer gut auf die nächste, Rekord EHT Kontraktionen und Kraft berechnen während der Aufnahme (angezeigt in der „Echtzeit“ Registerkarte auf der linken Seite). Am Ende der Analyse, ein PDF-Berichts summaridie Ergebnisse Zing wird automatisch generiert.
- Speichern und analysieren das pdf des Systems berichten erzeugt, um die Ergebnisse zusammenzufassen.
- Überwachen Sie die Kontraktionsparameter durch wiederholte Messung über mehrere Tage. Die EHT wird in Kontraktionskraft zu erhöhen, bis sie ein Plateau (in der Regel um Tag 15 der Kultur) erreicht haben.
- Drogentest
- Bereiten proteinfreien Tyrode - Lösung eines Tag vor der Messung und äquilibrieren in Platten mit 24 Vertiefungen (2 ml / Vertiefung) in dem Zellkultur - Inkubator (37 ° C, 7% CO 2, 40% O 2) über Nacht: 120 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0,1-5 mM CaCl 2, 0,4 mM NaH 2 PO 4, 22,6 mM NaHCO 3, 5 mM Glucose, 0,05 mM Na 2 EDTA, 25 mM HEPES. In Kalzium bis zu 1,8 mM oder das zuvor ermittelten [EC 50] positiv inotrope Effekte zu untersuchen.
- Wiegen und das Arzneimittel in DMSO auflösen und Sterilfilter, falls notwendig.Bereiten 6 verschiedene 1000x-Sub-Stammlösungen (in DMSO) der Arbeitskonzentration ( zum Beispiel 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 & mgr; M für den entsprechenden nanomolaren Bereich).
- Verdünne das jeweilige Lager in den Tyrode Platten (2 & mgr; L in jeweils 2 ml well) und gründlich mischen. Legen Sie die Platten in den Inkubator zurück, bis sie benötigt.
- Starten Sie die Basislinienmessung, indem die erste Tyrode-gefüllten 24-Well-Platte unter den sterilen Haube und die Position von Kohlenstoffelektroden in den Vertiefungen nehmen. Übertragen der PDMS-Racks mit dem EHTs auf der Oberseite der Kohlenstoffelektroden gelegt, den Deckel schließen, legt die Platte wieder in dem Inkubator und wartet auf einen Äquilibrierungszeitraum von ~ 30 min.
- Übertragen Sie die EHTs aus dem Inkubator auf die Verriegelung im EHT Analyseinstrument. Schließt das Instrument und aufzuzeichnen spontane Kontraktionsbasislinie (20 s / EHT).
- Eine Verbindung, die Kohlenstoffelektroden mit dem Schrittmacherkabel und beginnen elektrische Stimulation der EHTs (2,5 V, 4 ms Impulsdauer, human: ~ 1 Hz, Ratte: ~ 2Hz, Maus: ~ 4 Hz). Notieren Sie sich die "Tempo" Baseline (10 s / EHT). Stellen Sie sicher, dass alle EHTs richtig Tempo sind. Stimulationsfrequenz und Spannung kann variieren von Zelllinie zu Zelllinie.
- Nach Baseline-Aufzeichnung, die EHTs aus dem Gerät entfernen und die Elektroden mit dem Gestellen PDMS über Übergang auf die 24-well-Platte mit der ersten Wirkstoffkonzentration. Übertragen der EHTs zurück auf die Verriegelung des Analyseinstruments EHT sofort und inkubieren dort (Standard Arzneimittel Inkubationszeit zB 20 min).
- Schrittmacherkabel verbinden, Figur Erkennung anzupassen und EHT Kontraktionen Datensatz in der ersten Arzneimittelkonzentration reagiert.
- Für die folgenden Wirkstoffkonzentrationen Wiederholen Sie Schritt 3.5.7 und 3.5.8 mit den 24-Well-Platten, enthaltend höhere Arzneimittelkonzentrationen.
- Speichern Sie alle PDF-Aufnahmen. Überprüfen jeder Aufnahme für Fig Erkennung, die korrekte Positionierung der grünen Quadrate Kontraktionsspitzen identifiziert und Artefakte (siehe 3.2.1 und 3
- Führen Sie zusätzliche Offline - Analyse , wenn nötig.
- Wählen Sie den entsprechenden Lauf aus der „Runs“ Datenbank auf der linken Seite von „Select Run“ klicken. Im Register „Parameter“ auf der linken Seite, ändern Parameter für die Kontraktion Analyse. Wählen Sie nun „Offline-Analyse“ in der „Offline“ Reiter auf der rechten Seite die Videos erneut zu analysieren.
- Zur Einstellung Anerkennung Figur und damit eine neue Videodatei aufnehmen, wählen Sie „Sample Bewertung“ nach der Zahl Anerkennung in der „Echtzeit“ Registerkarte Einstellung. HINWEIS: Beispiel Bewertung kann nur eine gut zu einem Zeitpunkt erneut analysieren, während der Offline-Analyse neue Parameter für alle Vertiefungen anwenden kann, indem Sie die Taste „auf allen Vertiefungen Mit dem Parameter“ klicken Sie im „Parameter“ auf dem linken. Beiden Arten von Offline-Analysen werden automatisch neue Dateien und pdf erstellen, um die Ergebnisse anzuzeigen.
- Analysieren Sie den Versuch durch die Ergebnisse der b Kombinationiologische repliziert und die Daten in Konzentrations - Wirkungskurven für Frequenz, Kontraktionskraft, Kontraktionszeit und Relaxationszeit (5D) und / oder graphische Anzeige des durchschnittlichen Kontraktionsspitzen (5C) zusammenfassen.
HINWEIS: PDMS-Racks und PTFE Abstandshalter können mehrfach verwendet werden (PDMS Racks max 5mal, und PTFE-Abstandshalter endlos.). Nach dem Gebrauch reinigen Sie sie von Hand mit Wasser, kocht zweimal in demineralisiertem Wasser und Autoklaven. Seien Sie sich bewusst von möglichen Verschleppungseffekten, wenn wieder mit dem Racks, als Medikamente könnten durch die PDMS absorbiert werden.
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Representative Results
Herzdifferenzierung und Herstellung von EHT
HiPSC wurde auf reduziertem Wachstumsfaktor Basalmembranmatrix erweitert, dissoziiert mit EDTA und embryoid bodies (EBs) über Nacht in Spinnerflaschen gebildet. Nach mesodermalen Induktion für drei Tage wurde kardiale Differenzierung mit dem Wnt-Inhibitor ausgelöst. Nach ~ 17 Tagen Differenzierung Protokoll wurde schlagen EBs in einzelne Zellen dissoziiert mit Kollagenase Typ II (Abbildung 1). EHTs wurden mit 1,0 × 10 6 Zellen aus frisch isolierten Kardiomyocyten hergestellt pro 100 & mgr; l Gewebe sofort nach dem EB - Dissoziation (Abbildung 2). Für die Herstellung von gefrorenen Zellen (zB kommerzielle Anbieter) wurden die Zellen durch tropfenweise Resuspension in Medium aufgetaut und in ECM nach der Zentrifugation suspendiert. Innerhalb von 48 Stunden wurden die spontanen Schlagen von einzelnen Zellen mikroskopisch beobachtet in den EHT. Über die nächsten Tage verteilt Kardiomyozyten aus in Längsrichtung entlang der Kraftlinien des Gewebes gekoppelt ist und ausgebildet, um eine kohärent schlag EHT. Die makroskopisch sichtbaren Auslenkungen der PDMS Stellen wurden mit dem EHT Analysegerät gemessen.
Kontraktions Analyse
Analyse der EHT Kontraktilität wurde basierend auf Video-optischen Aufzeichnungs (Abbildung 3). Innerhalb des Systems wurde die Platte mit 24 Vertiefungen mit EHTs positioniert in der Gas- und temperaturgesteuerten Inkubatorkammer mit einem Glasdach. Eine Kamera mit einer motorisierten XYZ-Achsen verbunden wurde über dieser Einheit positioniert ist, und XYZ-Koordinaten wurden für jede EHT mit einem Softwareprogramm definiert ist. Analyse jeden EHT wurde an den oberen und unteren Enden des Gewebes auf Figur Erkenntnis zugrunde. Ein automatisierter Softwarealgorithmus die gefilmten EHT Kontraktionen und berechnete Kraftentwicklung basierend auf Postbiegung prüften elasticity / Geometrie der PDMS - Beiträge (Supplementary Abbildung 1) 11. Nach der Bestimmung von Spitzen vordefinierten Kriterien gemäß zusammengefasst ein PDF - Bericht Parameter der Kontraktilität für alle EHTs (Supplementary Abbildung 2).
Stabilität in Langzeitmessung
Langzeitmessung von EHTs wurde im kontinuierlichen Modus mit automatisierten wiederholte Messung alle 20 Minuten durchgeführt. Kontraktions Analyse zeigte keine zeitabhängigen Veränderungen (Post - Test für linearen Trend war nicht signifikant) in Kontraktionskraft, Schlagfrequenz, Kontraktionszeit T1 oder T2 - Relaxationszeit für bis zu 20 h, einem hohen Stabilität anzeigt (Abbildung 4). obwohl Wie bei jeder biologischen Probe zeigen die EHTs ein gewisses Maß an Variabilität, wie für die biologische Replikate erwartet. Die Variationskoeffizienten am Anfang und Ende des langfristigen measurement war 7/13% für die Kraft, 12/6% für Frequenz, 4/3% für die Kontraktionszeit und 4/3% für Relaxationszeit, bzw. (n = 4). Diese Variabilität zwischen biologischen Replikaten ist kein Artefakt von Figur Erkennung oder Analyse als die Ergebnisse für jeden einzelnen EHT reproduzierbar sind und eine geringe Variabilität (Supplementary Abbildung 2).
Drogentest
Wirkstoff-Screening wurde in Serum-freien Tyrode-Lösung durchgeführt. Kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurve wurde mit einer maximalen Fahrzeug DMSO Konzentration von 0,1% erzeugt. Baseline Kontraktion Analyse zeigte sehr wenig Unregelmäßigkeit im Muster zu schlagen und eine sehr geringe Variabilität zwischen den Replikaten. Die Exposition gegenüber der E4031 hERG Kanalblocker führte zu einer signifikanten Verlängerung der Relaxationszeit (T2) bei 10 nM und irregulären Schlagmustern bei höheren Konzentrationen (Abbildung 5). für frequency gesteuerte Kontraktion Analyse wurden Messungen wahlweise mit elektrischer Stimulation unter Verwendung von Kohlenstoffelektroden durchgeführt.
Abbildung 1: Cardiac Differenzierung. (A) humanen pluripotenten Stammzellen induziert. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (B) Embryoide Körper zu Beginn der mesodermalen Differenzierung. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (C) Vertrag Embryoidkörpern am Ende der Herzdifferenzierung. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (D) Menschliches engineered Herzgewebe. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Erzeugung von Engineered Herzgewebe (EHT). (A) PTFE - Abstandshalter. (B) PDMS - Rack. A, (B) , Maßstabsbalken = 1 cm (C) Draufsicht auf eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Schimmel in Agarose nach dem Entfernen der Abstandshalter PTFE Gießen. (D) Paar Pfosten von dem PDMS - Rack in der Gießform positioniert. (E) Die Rekonstitution Mischung in die Gießform pipettiert und um die PDMS Beiträge. (F) Frisch erzeugte EHT am Tag 0, in einen neuen Kulturschale mit Medium. (G) Umgestaltet EHT in Medium am Tag 15. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Kontraktions Analyse von Engineered Herzgewebe (EHT). (A) EHTAnalysegerät mit computergesteuerten Kamera über dem Gas- und temperaturgesteuerte Inkubationskammer mit EHTs in 24-Napf-Kulturschale auf einem LED-Panel. (B) Live - Ansicht eines EHT während der Analyse mit der automatisierten Kontraktions Auswertesoftware. (C) Beispielhafte Kontraktionsmuster Kontraktionskraft im Laufe der Zeit mit 100 Bildern pro Sekunde und vergrößerte schematische Kontraktions peak, die Anzeige der Analyseparameterkraft, Kontraktionszeit (T1), Relaxationszeit (T2), Kontraktionsgeschwindigkeit (CV), Entspannungsgeschwindigkeit gemessen Anzeige ( RV; diese Zahl wurde von 7 nachgedruckt und 27). DH: Parameter für die Kontraktion Analyse. (D) Beispiele für verschiedene Filterstufen (blau gefiltertes Linie) die Gestalt Erkennung beeinflussen. Links: Filterstufe = 0. Man beachte, dass keine blau gefilterte Zeile sichtbar ist, sondern nur die rote ursprüngliche Spur. Mitte: Filterstufe = 3, was darauf hindeutet ideale Erkennung / Analyse von the Kontraktionsspitzen. Rechts: Filterstufe = 20 Beachten Sie, dass die blauen gefiltert Linien sind viel kleiner als die ursprünglichen Spuren schlechte Kontraktion Peakanalyse angibt. (E) Beispiel arrhythmischer EHT Kontraktionen analysierten mit einer zu hohen Kraftschwelle (links) und die unteren Kraftschwelle (rechts) mit allen erkannten Spitzen. (F) Beispiele Spuren von EHTs an die Natriumkanal - Agonisten ATX-II ausgesetzt , was zu einer längeren Relaxationszeit mit früh nach den Kontraktionen. Beachten Sie, dass die vierte Kontraktion Spitze auf der linken Seite wird nicht erkannt (kein grünes Quadrat) aufgrund eines zu geringen Mindestfaktors. (G) Beispiele für Kontraktionsspitzen mit (rechte Platte) und ohne (rechts) rosa Kurve (erste Ableitung der Kontraktionskurve, Kontraktion und Relaxation Geschwindigkeit). (H) Zusammenfassung der Parameter - Empfehlungen für die murinen und humanen EHTs. Beachten Sie, dass diese Parameter Einstellung benötigen könnten als Kontraktionsmuster Veränderungen während der Arzneimittelexposition (siehe E,F). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Zeitsteuerung während einer Langzeitmessung Spontan Beating Menschen Engineered Herzgewebe (EHT). Zeitsteuerung während einer Langzeitmessung des menschlichen engineered Herzgewebe spontan zu schlagen (EHT). EHTs wurden in dem EHT Analyseinstrument positioniert und für die Dauer von 20 h inkubiert. Automatisierte Kontraktions Analysen wurden alle 20 min mit nicht signifikant nach dem Test für linearen Trend durchgeführt (n = 4; Daten stellen den Mittelwert + Standardabweichung). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
t = "5" src = "/ files / ftp_upload / 55461 / 55461fig5.jpg" />
Abbildung 5: Wirkung von hERG - Kanal - Blocker E4031 Menschen Engineered Herzgewebe (EHT).
(A) Exemplarische Kontraktionsmuster an der Basislinie. (B) Exemplarische Kontraktionsmuster nach der Inkubation in 300 nM E4031. (C) Mittlere Kontraktions peak (n = 4) von elektrisch stimulierten EHTs an der Basislinie (schwarz) und nach 30 min Inkubation in 100 nM E4031 (rot). Die Analyse mit 100 Bildern pro Sekunde. (D) Konzentrations - Wirkungskurven für E4031 auf spontan menschliche EHTs zu schlagen. Man beachte die geringeren Effekt Größe in T2-Verlängerung in den elektrisch stimulierten EHTs (C) gegen die spontan schlag EHTs (D). Einweg-ANOVA, wiederholte Messungen mit Dunnetts Post-Test vs. Baseline; * P <0,05; n = 4. Z‘Faktor 25 für T2 Verlängerung bei 300 nM E4031 ist 0,75.pg“target =‚_ blank‘> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Mensch | Ratte | Maus | |
| Zellen | 26.4x10 6 | 10.8x10 6 | 18.0x10 6 |
| 2xDMEM [ul] | 147 | 147 | 147 |
| Basalmembran-Matrix [& mgr; L] | 264 | - | 264 |
| Y-27632 [& mgr; L] | 2.6 | - | - |
| Fibrinogen [ul] | 66,8 | 66,8 | 66,8 |
| ECM [ul] | ad 2640 | ad 2640 | ad 2640 |
Tabelle 1: Pipettierschema für PReparatur von Rekonstitution Mix für 24 Mensch, Ratte und Maus EHTs. Fibrinogenkonzentration ist 5 mg / ml für alle EHTs. Beachten Sie, dass die Zellkonzentration für jede Spezies unterscheidet. Für menschliche EHTs, Basalmembran - Matrix (zB Matrigel, siehe Materialien Table) und Rho-Kinase - Inhibitor Y-27632 zur Mischung hinzu. Für Maus EHTs, fügen Basalmembranmatrix. In Abhängigkeit von der anfänglichen Konzentration der Zellsuspension, fügen Sie zusätzliche ECM mit einem Gesamtvolumen von 2.640 & mgr; l Rekonstitution Mischung zu erreichen.
Ergänzende Abbildung 1: Berechnungsformel für Kontraktionskraft basierend auf Post Biegung 26. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzende Abbildung 2: Beispielhafte Daten Auszug aus dem Kontraktions Analysis Report der Software.
Top: Kontraktionsspitzen über 20 s die Zeit aufgezeichnet mit 100 Bildern / s (rot: Kontraktionskraft, pink: Kontraktionsgeschwindigkeit). Unten: Analysierte Kontraktionsparameter zeigen , Minimum, Mittelwert, Maximalwert und die Standardabweichung der 18 analysierten Kontraktionsspitzen markiert mit einem grünen Quadrat (oben). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Ausgeführt Herzgewebe bieten eine wertvolle Option für den Werkzeugkasten der kardiovaskulären Forschung. EHTs in dem 24-Well - Format haben für Krankheit Modellierung 8, 14, Arzneimittelsicherheit Screening 7, 8, 10, 11, 15, oder basisches Cardiovascular Research 16, 17 bewährt.
Potentielle Modifikationen der grundlegenden EHT Protokolle umfassen Studien über zelluläre Wechselwirkung mit definierten Mischungen von Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten 18 und Nachlast Verstärkung 14. Wichtige Aspekte für die Fehlerbehebung sind die Qualität der Eingangszellpopulation und die Qualität von Fibrinogen. Wenn die anfängliche Gelbildung unregelmäßig ist oder nicht kompakt genug, um t-Sticko PDMS Beiträge, oder, wenn das Gel schnell innerhalb weniger Tage degeneriert ist nach aufgrund der geringen Konzentration von Aprotinin Gießen wird EHTs Generation nicht erfolgreich sein.
Folgende Einschränkungen müssen berücksichtigt werden. (I) Der Durchsatz in 24-Well-Format wird für einen primären Screeningaufbau nicht gut geeignet, aber ist ausreichend, um für einen sekundären Bestätigungsbildschirm. (Ii) Die integrierte Anzeige von Kraft, Kontraktion Kinetik und Rhythmus haben niedrige Spezifität, was es schwierig zu verknüpfen Änderungen in Kraft zu spezifischen molekularen Mechanismen macht. (Iii) Während das 3D-Kultur-Format und die durch gebogene PDMS Beiträge auferlegte Dehnung verbessern morphologische und funktionelle Aspekte der Reifung, das Fehlen von echten Glanzstreife, spontan schlagenden und niedriger als normal adrenergen Reaktionen zeigen, dass die volle Herz Reifung ist noch nicht erreicht, mit dieses Protokoll. (iv) PDMS wurden verschiedene Medikamente auf verschiedene verlängern 19 und dem tatsächlichen effektiven Konzentrat absorbieren gezeigtenion auf den EHTs können variieren. Diese Einseitigkeit könnte noch ausgeprägter in der chronischen Toxizität sein , Studien 15 als die Untersuchung akuter Arzneimittelwirkungen 7, 8 und eindeutig auf das Medikament zur Hand abhängt. Als Konsequenz soll nach Gebrauch und die potentielle Absorption verschiedenen Medikamente muß in Betracht gezogen wird ergriffen werden, die PDMS-Rack Drogen ausgesetzt verworfen, wenn die Daten zu analysieren. (v) In Anbetracht der Tatsache , dass 1x10 6 hiPSCs pro EHT erforderlich sind , sind die Kosten pro Datenpunkt hoch.
Die Bedeutung dieses Protokolls im Vergleich zu Ex - vivo - Analyse Herzkontraktionsfähigkeit ist das Potenzial in einem menschlichen System zu arbeiten, das Fehlen von Versuchslauf nach unten, und die standardisierten Produktion von EHTs , die auf spezifische genetischen Hintergründen (zB Krankheit Modellierung der Einrichtung große Studien erlaubt ). Im Vergleich zu anderen hiPSC Prüfsystemen (Multielektrodenarray, Impedanz), dieses System analysierens Kontraktionskraft als die wichtigsten physiologischen Parameter von Kardiomyozyten in einer dreidimensionalen Struktur und ermöglicht den Anbau unter definierten Last. EHTs Vertrag regelmäßig und bei stabiler Kraft, Frequenz und Rhythmus über viele Stunden und Wochen, so dass Langzeitmessungen und Beurteilung der chronischen Toxizität. EHT-Analyse kann unter elektrischer Stimulation durchgeführt werden, die in Bezug auf die Kraft-Frequenz-Beziehung der Muskelkontraktion und ihren möglichen Einflusses auf den Arzneimittelwirkungen von Bedeutung ist. Im Hinblick auf den unreifen Status des hiPSC-CM, hat eine elektrische Stimulation das Potenzial , um die Zellen zu einem reiferen Phänotyp schieben 20, 21 und könnte in EHT Wartung einbezogen werden. Darüber hinaus stellt die EHT Prüfsystems hohen Gehalt Auslese einschließlich aller histologischen Standardparameter sowie der Biochemie (RNA, DNA, Protein - Trennung) 11. Mögliche zukünftige Anwendungen umfassen Aspekte die Arzneimittelentwicklung (Zielvalidierung, Sicherheits Pharmakologie) und Krankheitsmodelle, insbesondere in Kombination mit CRISPR / Cas9 vermittelte Erzeugung von isogenen Kontrollen.
Bei der Wartung von EHTs und Leistung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve ist es wichtig, Anweisungen für sterile Zellkulturverfahren sorgfältig zu folgen, um Pilzkontaminationen während der Übertragung von PDMS-Racks zwischen 24-Well-Platten zu vermeiden. Der wichtigste Schritt mit EHT aber ist die Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll. Für die EHTs zu kohärent schlagMuskelStreifen zu bilden, hat die Eingangs Population von mindestens 60% Kardiomyozyten bestehen. Glücklicherweise wurden die Differenzierungsprotokoll robuste und effizienter im Laufe der Jahre und Kardiomyozyten sind im Handel leicht von jetzt verfügbar. Die Rolle der Nicht-Myozyten in der Entwicklung von hiPSC abgeleiteten engineered Herzgewebe nicht vollständig verstanden wird, noch nicht. Experimente mit hiPSC-CM von hoher Reinheit führte überraschend gut EHT zuass = „Xref“> 7, aber Integration von anderen Zelltypen in das Gewebe wurde 22, 23, 24 , um den Phänotyp zu einer reifen Physiologie gezeigt Gewebefunktion zu verbessern und könnte drücken. Da die Gewebe in ein 24-Well-Format mit einer Million Zellen pro Gewebe erzeugt werden, ist diese Plattform noch ziemlich teuer. Skalierung bis zu einem 96-Well-Format angestrebt, aber bisher Robustheit wiegt dieses Manko. Das Protokoll in diesem Manuskript präsentiert ist technisch sehr robust mit wenig Variabilität zwischen den Replikaten. Die intra-Batch Variabilität für die Kinetik (mittleres Variationskoeffizient = 5%) sehr niedrig und etwas groß für die spontane Schlagfrequenz (mittleren Variationskoeffizient 10%) und Kontraktionskraft (Variationskoeffizient 17% bedeutet). Die Technik ist sehr robust. Quer durch verschiedene Experimentatoren ist die Effizienz zu schlagen EHTs erzeugen> 90% der abgegebenen Hydrogelen.
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Disclosures
IM, TE und AH sind Mitbegründer der EHT Technologies GmbH, Deutschland.
Acknowledgments
Die Autoren danken Alessandra Moretti und Dennis Schade für ihre Art Beitrag des Materials. Wir erkennen die große Unterstützung der iPS und EHT-Arbeitsgruppe am Institut für Experimentelle Pharmakologie und Toxikologie des UKE. Die Arbeit der Autoren wird durch Zuschüsse aus dem DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislaufforschung) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 unterstützt / 5-1 ), British National Center für das Ersatz-Refinement & Reduktion von Tieren in der Forschung (NC3Rs CRACK-IT 35.911-259.146 gewähren), die British Heart Foundation RM / 13/30157, der Europäischen Forschungsrat (Advanced Grant IndivuHeart), die deutsche Herzstiftung und die Freie und Hansestadt Hamburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 mL falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
References
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