Summary
Här visar vi generering av human engineered hjärtvävnad från inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) -härledda kardiomyocyter. Vi presenterar en metod för att analysera kontraktionskraften och exemplarisk förändring av kontraktion mönster av hERG-kanal-inhibitorn E-4031. Denna metod visar hög nivå av robusthet och lämplighet för hjärtläkemedelsscreening.
Abstract
Hjärtvävnadsteknik beskriver tekniker för att utgöra tredimensionella kraftalstrande manipulerade vävnader. För genomförandet av dessa förfaranden i grundforskning och preklinisk läkemedelsutveckling, är det viktigt att utveckla protokoll för automatiserad produktion och analys under standardiserade förhållanden. Här presenterar vi en teknik för att generera Engineered hjärtvävnad (EHT) från kardiomyocyter av olika arter (råtta, mus, människa). Tekniken förlitar sig på monteringen av en fibrin-gel innehållande dissocierade kardiomyocyter mellan elastiska polydimetylsiloxan (PDMS) inlägg i en 24-brunnsformat. Tredimensionella, kraftalstrande EHTs utgör inom två veckor efter gjutning. Denna procedur möjliggör för generering av flera hundra EHTs per vecka och är tekniskt begränsad endast av tillgängligheten av kardiomyocyter (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Utvärdering av auxotonic muskelsammandragningar utförs i en modifierad inkubation kammare med en mechanical interlock för 24-brunnsplattor och en kamera placerad på toppen av denna kammare. En programvara styr en kamera flyttas på ett XYZ axelsystem till varje EHT. EHT kontraktioner detekteras av en automatiserad figur igenkänningsalgoritm, och kraft är beräknad baserat på förkortning av EHT och det elastiska benägenhet och geometrin hos PDMS inlägg. Denna procedur gör det möjligt för automatisk analys av ett stort antal EHT under standardiserade och sterila förhållanden. Den tillförlitlig detektering av läkemedelseffekter på cardiomyocyte kontraktion är avgörande för hjärt läkemedelsutveckling och säkerhetsfarmakologi. Vi visar, med exempel på den hERG-kanalen inhibitorn E-4031, att det mänskliga EHT systemet replikerar läkemedelssvar på sammandragnings kinetiken för det mänskliga hjärtat, vilket indikerar att det är ett lovande verktyg för hjärtläkemedelssäkerhet screening.
Introduction
Hjärt biverkningar såsom läkemedelsinducerad långt QT-syndrom har lett till återtag från marknaden under de senaste åren. Statistik visar att cirka 45% av alla uttag beror på oönskade effekter på det kardiovaskulära systemet 1. Detta läkemedel misslyckande efter den dyra utvecklingsprocess och godkännande är det värsta scenariot för läkemedelsföretag. Forsknings- och utvecklingsavdelningarna fokusera därför upptäckt av sådana oönskade kardiovaskulära effekter tidigt. Av ekonomiska och etiska frågor, insatser för att minska djurförsök och ersätta dem med nya in vitro-screeningsanalyser pågår.
En uppsättning av etablerade analyser ingår i den amerikanska myndigheten Food and Drug Administration (FDA) och den europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA) riktlinjer för preklinisk utvärdering av proarytmiska läkemedelseffekter 2. Tekniken för omprogrammering somatiska celler följt av differentiering avmänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) boost detta forskningsområde 3. Det erbjuder nu möjligheten att screena nya läkemedelskandidater för mänskliga hjärtmuskelceller in vitro och undviker problem med skillnader mellan arter. Nya hjärt differentiering protokoll 4, 5 ger obegränsat utbud av kardiomyocyter utan etiska problem. Men mätningen av sammandragande kraft, den viktigaste och mest känne in vivo parameter kardiomyocyter är inte väl etablerad. Detta är relaterat till den relativa omognad 6 av humana inducerade pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter (hiPSC-CM) jämfört med den vuxna cardiomyocyte. En möjlig avancemang är att konstruera 3-dimensionell hjärtvävnad från enskilda celler 7 (engineered hjärtvävnads, EHT). EHT Protokollet är baserat på inbäddning enda murina eller humana kardiomyocyter 8 sup>, 9, 10 i fibrin hydrogel mellan två flexibla polydimetylsiloxan (PDMS) inlägg 11 i 24-brunnsformat. Inom några dagar cardiomyocytes börja dra ihop sig spontant som enskilda celler och börja bilda mobilnät. Efter 7-10 dagar, makroskopiska sammandragningar i hela vävnaden är synliga. Under denna process den extracellulära matrisen är ombyggda, vilket leder till en minskning av diameter och längd. Förkortningen av EHT resulterar i böjning av PDMS lägga även under vila, utsätta cardiomyocytes i utvecklings EHT kontinuerlig belastning. EHTs fortsätta att utföra auxotonic muskelsammandragningar under flera veckor. Human EHTs visa svar på fysiologiska och farmakologiska stimulering indikerar deras lämplighet för drogscreening och sjukdom modellering 7.
I detta manuskript presenterar vi en robust och lätt protokoll för generatipå av humant EHT, och den automatiserade kontraktilitet analys av koncentrationsberoende förändringar av kontraktionen mönstret i närvaro av hERG flödeshämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS! Följande steg beskriver en cellodlingsprotokoll. Utför under sterila förhållanden och använda förvärmda media.
1. Cardiac Differentiering av hiPSC
- Odla hiPSC
- Coat 6-brunnsplattor (1 ml / brunn) eller T75-kolvar (7 ml / kolv) med nedsatt tillväxtfaktor basalmembranmatris (t.ex. geltrex, 1: 200, se tabell av material) utspädd i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) för 30 min vid 37 ° C. Förbereda FTDA mediet 12 genom blandning av grund DMEM / F-12-medium med 2 mM L-glutamin, 0,5% penicillin / streptomycin, 5 mg / L transferrin, 5 | ig / l selen, 0,1% humant serumalbumin, 1x lipid-blandning, 5 mg / L insulin, 50 nM dorsomorphin, 2,5 ng / ml aktivin A, 0,5 ng / ml humant TGFß1 och 30 ng / ml FGF2.
- Utsäde hiPSC (~ 3 x 10 5/10 cm ^) i FTDA medium och kulturen vid 37 ° C, 5% CO2, 21% O2 med daglig mediumbyte (Figur 1A). Vid 80% konfluens, passage (1: 2-1: 6) med etylendiamintetraättiksyra (EDTA; 0,5 mM; inkubationstid ~ 4 min).
- Bildning av embryoidkroppar (EB)
- Odla hiPSC i T75-kolvar till hög densitet.
- Tvätta flaskor med konfluenta cellerna två gånger med fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium (PBS) och inkubera i 0,5 mM EDTA under ~ 10 min. Se till att cellerna inte lossna från botten av kolven.
- Avlägsna EDTA med glaspipett, spola bort cellerna med 10 ml PBS, tap kolvar vid bänken för att lösgöra cellerna.
OBS: Använd cellskrapa vid behov. - Samla upp celler i 50 ml koniska rör, tillsätt en fjärdedel av volymen (t.ex. 10 ml RMPI till 40 ml cellsuspension) RPMI 1640-medium (eller någon annan standardmedium innehållande 1,8 mM kalcium) och centrifugera vid 250 xg under 5 min.
- Resuspendera cellpelleten i FTDA medium kompletterat med 4 mg / ml polyvinylalkohol (PVA) och10 pM Y27632 och räkna cellerna i en Neubauer kammaren.
- Fylla spinnkolv med cellsuspensionen (30 x 10 6 celler / 100 ml FTDA medium kompletterat med PVA och Y-27632; se steg 1.2.2) och initiera EB bildning i spinnerflaskor (justera rotorhastighet av magnetomrörare till 40 varv per minut ) i cellodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O 2) över natten.
- Odla hiPSC i T75-kolvar till hög densitet.
- mesodermal differentiering
- Under EB formation, kolvar coat cellkultur lämplig för suspensionsodling med icke-joniskt ytaktivt medel (14 ml / T175) över natten vid 37 ° C.
- Nästa morgon, tvätta ytaktiva belagda kolvar två gånger med PBS (30 ml / T175). Lägg till PBS igen och hålla i inkubatorn tills det behövs.
- Ta spinnerkolven från inkubatorn.
OBS: Cellsuspension bör vara tydlig med små makroskopiskt synliga EBs (Figur 1B). - Överföra 50 ml suspensionen till en 50 ml konisk tube och låt EB nöja 5-20 min.
- Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 7 ml av RPMI 1640 kompletterat med 2% PVA och 10 uM Y-27.632. Överförings suspensionen till en graderad 15 ml koniska rör och uppskattning EB volym (~ 50-100 | il).
- Överföra innehållet i spinnerflaskor till obelagda T175-kolvar och lämna denna på V-formade rack för sedimentering i upp till 20 min. Avlägsna supernatanten och tvätta embryoidkroppar enligt ovan. Fyll inte T175 kolv med mer än 200 ml som sedimente skulle ta för lång tid. Om inledande spinnkolv volym är större än 200 ml, delbart EB suspensionen till flera T175-kolvar och kombinera EBs igen efter tvättning.
- Avlägsna tvättmedium och återsuspendera i medium för mesodermala differentiering, är att RPMI kompletterat med 4 mg / ml PVA, 0,5% penicillin / streptomycin, 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), 0,05% humant serum albumin, 5 | ig / ml transferrin, 5 ng / ml natriumselenit, 0,1% lipid blandning, 250 uM fosfo-askorbat, 10 uM Y-27632, 10 ng / ml benmorfogent protein-4 (BMP-4), och 3 ng / ml aktivin A, 5 ng / ml stabil FGF2.
- Ta bort PBS från ytaktiva belagda T175-kolvar och fyll med cellsuspension (200 | il EBs i 40 ml). Använda mindre flaskor för mindre EB volym.
- Odla EBs i suspension under tre dagar (37 ° C, 5% CO 2, 5% O 2). Utbyte 50% av mediet (samma sammansättning som i steg 1.3.7) varje dag (användning V-formad sedimente rack). Förbered medel färska varje dag före utfodring.
- hjärtdifferentiering
- Förbered nya ytaktiva belagda kärl dagen innan och hantera enligt ovan (1.3.2).
- Efter tre dagars mesodermala induktion, låt EBS nöja upp till 5 minuter på sedimentation rack. Avlägsna det mesta av mediet och tvätta med RPMI 1640 supplementerat med 0,5% penicillin / streptomycin och 10 mM HEPES.
- Överföring 10 ml EB suspensionen till graderad15 ml rör och uppskattning EB volym efter sedimentering.
- Resuspendera EBs noggrant i hjärtdifferentieringsmedium bestående av RPMI 1640 supplementerat med 0,5% penicillin / streptomycin, 10 mM HEPES, 0,05% humant serumalbumin, 5 | ig / ml transferrin, 5 ng / ml natriumselenit, 0,1% lipid blandning, 250 uM fosfo -ascorbate, 1 uM Y-27632, 100 nM Wnt-inhibitor DS-I-7 13.
- Överföra EBs till nya ytaktiva belagda cellodlingsflaskor (~ 200 mikroliter EBs i 46 ml / T175).
- Inkubera under tre dagar (37 ° C, 5% CO 2, 21% O 2) med 50% mediumbyte (mediumkomposition se steg 1.4.4) på den andra och tredje dagen. Ändra inte mediet inom de första 48 h.
- Inkubera i medium bestående av RPMI 1640 kompletterat med 500 ^ M 1-tioglycerol, 10 mM HEPES, 0,5% penicillin / streptomycin, 1 | iM Y-27632, 2% serumfritt neural cellodling tillskott (t.ex. B27) med insulin, 100 nM Wnt -hämmare DS-I-7 med daglig utbyte av 50% medium för de kommande fyra dagarna. EB ska börja slå i denna period.
- Efter en vecka av hjärtdifferentiering, växla till samma medium utan Wnt hämning och med serumfritt neural cellodling tillägg. Förändring 50% av mediet varje dag, med undantag för den första dagen.
- Dissociation av mänskliga hjärtmuskelceller
OBS: Efter två veckor av differentieringsprotokoll, bör EBs visa spontana kontraktioner (Figur 1C). Om så är fallet, börjar dissociation och förbereda kollagenas lösning.- Förbereda kollagenaslösning genom vägning och lösa 200 U / ml i kalciumfri Hanks balanserade saltlösning utan kalcium / magnesium (HBSS) och tillsätt 1 mM HEPES, 10 uM Y-27632, 30 ^ iM N-bensyl-p-toluensulfonamid ( BTS). Sterilisera genom filtrering (0,2-pm filter) och lagra alikvoter vid -20 ° C. Tina alikvoter vid 4 ° C över natten.
- Settle EBS på sedimentation rack,aspirera medium och ersätta med 20-25 ml förvärmd HBSS. Upprepa detta tvättsteg en gång.
- Aspirera HBSS och ersätt med förvärmd kollagenaslösning (15 ml / T175). Inkubera under 4 h i cellodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2, 21% O2).
- Förbereda blockerande buffert med DMEM kompletterat med 1% penicillin / streptomycin och DNas (12 | ig / ml).
- Peka på cellodlingsflaskor på bänken, dissocierade EB bör upplösas och falla sönder (om inte öka inkubationstiden). Försiktigt triturera cellsuspensionen och överföring till ett koniskt 50 ml-rör. Tvätta kolvar med blockeringsbuffert (15 ml / T175) och överför till röret.
- Centrifugera i 10 min vid 100 x g. Resuspendera cellerna i varm DMEM, finfördela och räkna celler.
2. Generering av Engineered hjärtvävnad (EHT)
- Autoklav kommersiellt tillgängliga PDMS rack och polytetrafluoretylen (PTFE) distanser (se Material ochUtrustning kalkylblad; Figur 2) och förbereda följande lösningar under sterila betingelser, en dag före EHT generation.
- Förbereda 2% agaros genom vägning och upplösning i lämplig volym av PBS, autoklav, omedelbart lagra åtmin 60 ° C.
- Framställa aprotinin (33 mg / ml) genom att väga och upplösning i lämplig volym av aqua ad iniectabilia, filtrera sterilt (0,22-pm filter), alikvot och förvara vid -20 ° C.
- Framställa fibrinogen (200 mg / ml) genom att lösa steril fibrinogen i lämplig volym av steril 0,9% NaCl (ljummet), alikvot och förvara vid -20 ° C.
- Förbereda trombin (100 U / ml) genom att lösa steril trombin i tre delar steril PBS och 2 delar aqua ad iniectabilia, alikvoter av 3 mikroliter i små rör och förvara vid -20 ° C.
- Förbereda 10x DMEM genom att lösa 670 mg 10x DMEM pulver i 5 ml aqua ad iniectabilia, filtrera sterilt och förvara vid 4 ° C.
- Förbereda 2x DMEMgenom blandning av 2 ml 10x DMEM med 2 ml värmeinaktiverat hästserum, 0,2 ml penicillin / streptomycin och 5,8 ml aqua ad iniectabilia, filtrera sterilt och förvara vid 4 ° C.
- Förbereda EHT-gjutning medium (ECM) genom blandning av DMEM med 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum, 1% penicillin / streptomycin och 1% L-glutamin (200 mM), förvara vid 4 ° C.
- Förbereda gjutformar i 24-brunnars plattor genom att pipettera 1,6 ml varm agaros (2%, PBS) och placering av PTFE-distansorganet (figur 2A) i brunnarna.
OBS: Placera distans omedelbart efter pipettering i högst 8 brunnar - agaros stelnar mycket snabbt. Lämna inte agarosen vid rumstemperatur under längre tid än fem minuter. - Efter agaros stel (~ 10 min, agaros blir ogenomskinlig), ta bort PTFE distansorgan (figur 2C) och placera PDMS rack (Figur 2B) i gjutformarna, så att par av PDMS inlägg når in i varje form (figur 2D).
- Förbereda 110% av den beräknade volymen av rekonstitution blandning i en rundbottnad 15-ml rör på ice.For 24 EHTs, pipettera rekonstitution mixen listade i tabell 1 för mänskliga, rått- eller mus-kardiomyocyter, respektive (10% extra är inkluderad).
OBS: Cell koncentrationen av rekonstitution mix är olika för humant (10 x 10 6 celler / ml), råtta (4,1 x 10 6 celler / ml) och mus (6.8 x 10 6 celler / ml) EHTs. Beroende på koncentrationen av cellsuspensionen, lägga till ytterligare ECM till en slutlig volym av 2,640 mikroliter. Fibrinogen måste vara ljummet för pipettering. Sakta fylla spetsen på pipett och inte röra vid ytan av det kalla beredning mix med fibrinogen som innehåller pipett när du lägger fibrinogen till beredning mix - viskositet fibrinogen i pipettspetsen skulle öka omedelbart. - Mal sönder beredning mix 10 - 15 gånger med en serologisk pipett tills fibrinogen koagel är upplöst. Kontrollera beredning mixen i pipetten för homogenitet.
- För varje EHT, pipett 100 pl beredning blandning i en trombin alikvot (3 pl i 200 pl rör), blanda och pipettera blandningen i agarosen-spår så snabbt som möjligt (Figur 2E). Använd en ny filterspets för varje EHT. Resuspendera beredning mix (rivning med serologisk pipett 5-10 gånger) efter var 8 EHTs.
- När alla slitsar är fyllda med rekonstitution mix, stäng locket av cellodlingsskål och inkubera vid 37 ° C, 7% CO2 under 2 h.
- Avlägsna plattan från inkubatorn och placerades under en steril huva. Täcka varje brunn med en liten mängd medium (t.ex. DMEM, cirka 200 - 500 mikroliter), skaka försiktigt plattan och inkubera igen vid 37 ° C under minst 10 min. Tillsats av DMEM kommer att underlätta avlägsnande från fibringeler från agaros gjutformar.
- Försiktigt bort PDMS rack från agarosen gjutformar och överföra dem till mediet fyllda 24-brunnar (Figur 2F). Placera skålen tillbaka i inkubatorn (37 ° C, 7% CO2, 40% O 2 för människa och råtta EHTs, 21% O 2 för mus EHTs) och foder måndagar, onsdagar och fredagar med nyberedd EHT-medium. EHTs bör visa spontana kontraktioner avböjande tjänsterna som PDMS kuggstängerna 7-10 dagar efter gjutning (figur 1D, 2G).
- För mus EHTs lägga 25 mikrogram / ml av 5-cytosin βDarabinofuranoside till odlingsmedium för 48 h för att begränsa fibroblastproliferation.
3. Sammandragning Analys
OBS! Kontraktion Analysen bygger påvideo-optisk registrering i en kommersiellt tillgänglig EHT analysinstrument (se tabell av material). Den centrala enheten i detta instrument är en inkubation kammare (figur 3A). Den programvara som levereras med instrumentet beräknar kontraktionskraften baserat på avböjning av PDMS inlägg med känd elasticitetsmodul och geometri 11 (Kompletterande Figur 1).
- Slå på värmeanordningen hos maskinen 2 timmar före mätningen. Slå på gastillförseln och elektroniska tillförseln av axelsystemet omedelbart före kontraktion analys.
- För baslinje inspelning (referenspunkt i analysen), placera 24-brunn-platta med EHTs i EHT-medium in i EHT analysinstrumentet och starta kontraktion analysprogram enligt leverantör manual.
- Klicka på "protokollet" fliken på den högra panelen och ange relevant information om studie namn, användare, arter, cell typ, ålder, inspelningslängd och ytterligare kommentarer.
- Klicka på fliken "Camera view" på den vänstra panelen och börja kamera liveläget med automatiskt läge siffra upptäckt. Klicka på "Setup" fliken på den högra panelen andadjust kamerans position med xyz-koordinater för varje brunn i 24-väl maträtt. Se till att EHT ligger i mitten av fönstret och i fokus för kameran.
- Se till att locket på cellodlingsskål är inte dimmigt eftersom detta kommer att försämra siffra erkännande och kontraktion analys.
OBS: Siffran igenkänningsalgoritm bygger på att upptäcka hög kontrast områden och övervaka deras förändring i position. I programmet dessa områden i figur erkännande kommer att markeras med en blå kors som rör sig med sammandragningar i EHT. - Se till att positionerna för de blå kors är vid båda de övre och undre ändarna av EHTs och endast rör sig vertikalt matcha sammandragningar av EHTs (fig 3B). Save inställnings positionerna för varje brunn genom att trycka på knappen "läge ok".
- Se till att locket på cellodlingsskål är inte dimmigt eftersom detta kommer att försämra siffra erkännande och kontraktion analys.
- Klicka sedan på fliken "Parametrar" på den vänstra panelen. Parametrarna som visas här definierar kriterier som programvaran identifierar en sammandragning topp och markerar den med en grön fyrkant. Dessa värden är mycket viktiga för korrekt identifiering av sammandragningstoppar (figur 3C) och inga falska datapunkter (Figur 3E-F).
OBS: En lista över arter beroende parametrar och exempel visas i figur 3H. För ytterligare information, kontakta programvaru manual. - Klicka på "Automatic" fliken på den högra panelen och initiera analysen genom att aktivera "Start" -knappen. Programvaran kommer att växla från en brunn till nästa, spela EHT sammandragningar och beräkna kraft under inspelning (visas i "realtid" fliken på den vänstra panelen). Vid slutet av analysen en PDF-rapport summarizing resultaten kommer att genereras automatiskt.
- Spara och analysera pdf rapportera systemgenererat att sammanfatta resultaten.
- Övervaka kontraktila parametrar genom upprepade mätningar under flera dagar. EHT kommer att öka i kontraktion kraft förrän den har nått en platå (vanligtvis runt dag 15 av kultur).
- Drug screening
- Förbereda proteinfritt Tyrode-lösning en dag före mätning och jämvikt i 24-brunnars plattor (2 ml / brunn) i cellodlingsinkubator (37 ° C, 7% CO2, 40% O 2) över natt: 120 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,1-5 mM CaCl2, 0,4 mM NaH 2 PO 4, 22,6 mM NaHCOs 3, 5 mM glukos, 0,05 mM Na2EDTA, 25 mM HEPES. Lägga kalcium upp till 1,8 mM eller den tidigare bestämda [EC 50] för att undersöka positiva inotropa effekter.
- Väg och lös läkemedlet i DMSO och filtrera sterilt, om det behövs.Förbereda 6 olika 1000x-sub-stamlösningar (i DMSO) av arbetskoncentrationen (t ex 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 pM för respektive nanomolära området).
- Späd den respektive lagret i Tyrode plattorna (2 | il i varje 2 ml brunn) och blanda väl. Placera plattorna tillbaka i inkubatorn tills det behövs.
- Starta mätningen baslinjen genom att ta den första Tyrode-fyllda 24-brunn-platta under sterila huva och positionen kolelektroder i brunnarna. Överföra PDMS rack med de EHTs placerade ovanpå kolelektroder, stäng locket, placera plattan tillbaka i inkubatorn och vänta på en jämviktningsperiod av ~ 30 min.
- Överför EHTs från inkubatorn till låsningen i EHT analysinstrumentet. Stänga instrumentet och spela in spontan baslinje kontraktilitet (20 s / EHT).
- Ansluta kolelektroderna till stimuleringskabeln och börja elektrisk stimulering av de EHTs (2,5 V, 4 ms impuls varaktighet, människa: ~ 1 Hz, råtta: ~ 2Hz, mus: ~ 4 Hz). Spela in "paced" baslinje (10 s / EHT). Se till att alla EHTs är ordentligt tempo. Stimuleringsfrekvensen och spänningen kan variera från cellinje till cellinje.
- Efter baslinjen inspelning, ta bort EHTs från instrumentet och överföra elektrod med PDMS kuggstänger på toppen, till 24-brunn-platta med den första läkemedelskoncentration. Överföra EHTs tillbaka på låsningen av EHT analysinstrumentet omedelbart och inkubera det (standardläkemedel inkubationstid t ex 20 min).
- Anslut stimuleringskablar justera siffran erkännande och spela EHT sammandragningar som svarar på den första läkemedelskoncentrationen.
- För följande läkemedelskoncentrationer, upprepa steg 3.5.7 och 3.5.8 med de 24-brunnars-plattor innehållande högre läkemedelskoncentrationer.
- Spara alla pdf inspelningar. Kontrollera varje inspelning för figur igenkänning, korrekt placering av gröna kvadrater identifiera sammandragningstoppar och artefakter (se 3.2.1 och figur 3
- Utföra ytterligare offline analys om det behövs.
- Välj respektive springa från "kör" databas på den vänstra panelen genom att klicka på "Välj run". I "Parameter" -fliken till vänster, ändra parameter för kontraktion analys. Välj nu "offline analys" i "Offline" fliken på den högra panelen till ny analys videor.
- För att justera siffran erkännande och därför spela in en ny videofil, välj "Sample omdöme" efter justering siffran erkännande i "realtid" -fliken. OBS: Prov översyn kan bara ny analys en brunn i taget, medan offline analys kan tillämpa ny parameter för alla brunnar genom att klicka på knappen "Använd parameter på alla brunnar" i "Parameter" panelen till vänster. Båda typerna av offline analyser skapar automatiskt nya datafiler och pdf visar resultaten.
- Analysera experimentet genom att kombinera resultaten av biological replikerar och sammanfattar informationen i koncentrations-responskurvor för frekvens, kontraktionskraften, kontraktion tid och relaxationstiden (figur 5D) och / eller grafisk visning av genomsnittssammandragningstoppar (figur 5C).
OBS: PDMS rack och PTFE spacer kan användas upprepade gånger (PDMS racks max 5 gånger, och PTFE spacer oändlighet.). Efter användning, rengör dem manuellt med vatten, koka två gånger i avjoniserat vatten och autoklav. Var uppmärksam på eventuella carry-over effekter, när återanvända ställningar, som läkemedel kan absorberas av PDMS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hjärt Differentiering och Framställning av EHT
HiPSC expanderades på reducerad tillväxtfaktor basalmembranmatris, dissocierades med EDTA och embryoidkroppar (EBS) som är utformade i spinnerflaskor över natten. Efter mesodermal induktion under tre dagar, hjärt differentiering inletts med Wnt-hämmare. Efter ~ 17 dagar av differentiering protokollet fick slå EBs dissocieras till enstaka celler med kollagenas typ II (Figur 1). EHTs bereddes från nyisolerade kardiomyocyter med 1,0 x 10 6 celler per 100 | il vävnad omedelbart efter EB dissociation (Figur 2). För beredning från frusna celler (t.ex. kommersiella leverantörer), tinades cellerna genom droppvis återsuspension i medium och återsuspenderades i ECM efter centrifugering. Inom 48 h, spontana slag av enskilda celler observeras mikroskopiskt i EHT. Under de kommande dagarna, kardiomyocyter utspridda i längdled längs kraftlinjerna i vävnaden, kopplade och bildade en konsekvent slå EHT. De makroskopiskt synliga böjningar av PDMS inlägg mättes med EHT analysinstrumentet.
kontraktion Analys
Analys av EHT kontraktilitet baserades på video-optisk registrering (Figur 3). Inom systemet, var den 24-brunnar med EHTs placerad i gas- och temperaturkontrollerad inkubator kammare med ett glastak. En kamera som är ansluten till en motordriven XYZ-axel var placerad ovanför denna enhet, och XYZ-koordinaterna definierades för varje EHT med ett mjukvaruprogram. Analys av varje EHT var baserad på figur erkännande vid de övre och nedre ändarna av vävnaden. En automatiserad mjukvara algoritm analyserade filmade EHT sammandragningar och beräknad kraft baserad på inlägget böjning och elasticity / geometri PDMS inlägg (Kompletterande Figur 1) 11. Efter bestämning av toppar enligt fördefinierade kriterier, en pdf rapport sammanfattas parametrar för kontraktilitet för alla EHTs (Kompletterande Fig 2).
Stabilitet i Long Term Mätning
Långvarig mätning av EHTs utfördes i kontinuerligt läge med automatiserad upprepade mätningar varje 20 min. Kontraktion analys visade inga tidsberoende förändringar (Post-test för linjär trend var inte signifikant) i kontraktionskraften, beating frekvens, kontraktion tid T1 eller relaxationstid T2 i upp till 20 h, vilket indikerar en hög nivå av stabilitet (figur 4). Som med alla biologiska prov om de EHTs visar en viss nivå av variabilitet som förväntat för biologiska replikat. Variationskoefficienterna i början och slutet av långtids measurement var 7/13% för kraft, 12/6% för frekvens, 4/3% för kontraktion tid och 4/3% för relaxationstiden, respektive (n = 4). Denna variation mellan biologiska replikat inte är en artefakt av figur igenkänning eller analys som resultaten för varje enskild EHT är reproducerbara och har låg variabilitet (Kompletterande Fig 2).
Drug Screening
Drug screening utfördes i serumfritt Tyrodes lösning. Kumulativa koncentrationssvarskurvor genererades med en maximal DMSO-vehikel-koncentration av 0,1%. Baslinje kontraktion analys visade mycket liten oregelbundenhet i att slå mönster och mycket låg variabilitet mellan replikat. Exponering för den hERG kanalblockerare E4031 resulterade i en signifikant förlängning av relaxationstiden (T2) vid 10 nM och oregelbunden stryk mönster vid högre koncentrationer (Figur 5). för frequency kontrollerad kontraktion analys, mätningar gjordes eventuellt utföras med elektrisk stimulering med användning av kolelektroder.
Figur 1: Hjärt differentiering. (A) Human inducerade pluripotenta stamceller. Scale bar = 100 | im. (B) embryoidkroppar i början av mesodermal differentiering. Scale bar = 100 | im. (C) konventions embryoidkroppar i slutet av hjärtdifferentiering. Scale bar = 100 | im. (D) Human engineered hjärtvävnad. Scale bar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Generering av Engineered hjärtvävnad (EHT). (A) PTFE-spacer. (B) PDMS rack. A, (B) Scale bar = 1 cm (C) Vy på en brunn i en 24-brunns-platta med gjutformen i agaros efter avlägsnande av PTFE-distansorganet. (D) Par av inläggen från PDMS särskilt galler i gjutformen. (E) Reconstitution blandning pipetterades in i gjutformen och runt PDMS inlägg. (F) Färskt genereras EHT vid dag 0, överfördes till en ny odlingsskål med medium. (G) Ombyggda EHT i medium på dag 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Sammandragning Analys av Engineered hjärtvävnad (EHT). (A) EHTanalysinstrument med datorstyrd kameran ovanför gas- och temperaturstyrd inkubering kammare med EHTs i 24-brunns-odlingsskål ovanpå en LED-panel. (B) Live vy av en EHT under analys med det automatiserade kontraktion analysprogram. (C) Exempel på kontraktion mönster visning kontraktionskraften över tiden mäts med 100 bilder per sekund och förstorad schematisk kontraktion topp och visar analysparametern kraft, sammandragning tiden (T1), relaxationstiden (T2), kontraktion hastigheten (CV), avkoppling hastigheten ( RV; denna siffra har omtryckt från 7 och 27). DH: Parametrar för kontraktion analys. (D) Exempel på olika filternivåer (blå filtrerades linje) som påverkar figuren erkännande. Vänster: Filter nivå = 0. Observera att ingen blå filtreras linje är synlig, men endast den röda ursprungliga spår. USA: Filternivå = 3, vilket indikerar perfekt erkännande / analys av the sammandragningstoppar. Höger: Filternivå = 20. Observera att de blå filtrerade linjerna är mycket mindre än de ursprungliga spåren indikerar dålig kontraktion toppanalys. (E) Exempel på arytmiska EHT kontraktioner analyserade med en för hög krafttröskel (till vänster) och nedre krafttröskel (till höger) med alla toppar erkända. (F) Exempel spår av EHTs exponerade till natriumkanalagonist ATX-II resulterande i en förlängd relaxationstid med tidigt efter sammandragningar. Observera att den fjärde kontraktion toppen på den vänstra panelen inte känns igen (ingen grön fyrkant) på grund av en alltför låg lägsta faktor. (G) Exempel på sammandragnings toppar med (höger fält) och utan (höger panel) rosa kurvan (första derivatan av kontraktion kurva, sammandragning och avslappning hastighet). (H) Sammanfattning av parameter rekommendationer för murina och humana EHTs. Observera att dessa parametrar kan behöva justeras som kontraktion mönster förändras under läkemedelsexponering (se E,F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Time Control vid långtids Mätning av spontant slående Human Engineered hjärtvävnad (EHT). Tidsstyrning under långtidsmätning av spontant slående human konstruerad hjärtvävnad (EHT). EHTs placerades i EHT analysinstrumentet och inkuberas under en period av 20 h. Automatiserade kontraktion analyser utfördes varje 20 min med ej signifikant post-test för linjär trend (n = 4; data representerar medelvärde + standardavvikelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
t = "Figur 5" src = "/ filer / ftp_upload / 55.461 / 55461fig5.jpg" />
Figur 5: Effekt av hERG Channel Blocker E4031 på Mänsklig Engineered hjärtvävnad (EHT).
(A) Exempel kontraktion mönster vid baslinjen. (B) Exempel på kontraktion mönstret efter inkubation i 300 nM E4031. (C) Genomsnittlig kontraktion topp (n = 4) av elektriskt stimulerade EHTs vid baslinjen (svart) och efter 30 min inkubation i 100 nM E4031 (röd). Analys med 100 bilder per sekund. (D) Koncentration-responskurvor för E4031 på spontant slående mänskliga EHTs. Notera den mindre effektstorleken i T2-förlängning i de elektriskt stimulerade EHTs (C) vs. det spontant slående EHTs (D). Envägs ANOVA, upprepade mätningar med Dunnetts post-testet vs. baslinjen; * P <0,05; n = 4. Z' faktor 25 för T2-förlängning vid 300 nM E4031 är 0,75.pg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mänsklig | Råtta | Mus | |
| Celler | 26.4x10 6 | 10.8x10 6 | 18.0x10 6 |
| 2xDMEM [il] | 147 | 147 | 147 |
| Basalmembranmatrisen [il] | 264 | - | 264 |
| Y-27632 [il] | 2,6 | - | - |
| Fibrinogen [il] | 66,8 | 66,8 | 66,8 |
| ECM [il] | ad 2640 | ad 2640 | ad 2640 |
Tabell 1: pipettering System för Preparation av Beredning Mix för 24 Människa, råtta och mus EHTs. Fibrinogen-koncentrationen är 5 mg / ml för alla EHTs. Observera att cellkoncentrationen är olika för varje art. För humana EHTs, lägga basalmembranmatris (t.ex. matrigel, se Material tabell) och Rho-kinashämmare Y-27.632 till blandningen. För mus EHTs, lägga basalmembranmatrisen. Beroende på den initiala koncentrationen av cellsuspensionen, lägga till ytterligare ECM för att nå en total volym av 2640 pl rekonstitution mix.
Kompletterande Figur 1: Beräkningsformel för kontraktionskraften Baserat på Post Deflection 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur 2: Exempel på Data Utdrag ur Sammandragning analys Rapport av programvaran.
Top: Sammandragning toppar över 20 s av tid registrerades med 100 bilder / s (röd: kontraktionskraften; rosa: kontraktion hastighet). Botten: Analyserad kontraktion parameter som visar minimum, medelvärdet, maximivärdet och standardavvikelsen för de 18 analyserade sammandragningstoppar markerade med en grön fyrkant (överst). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Engineered hjärtvävnad ger ett värdefullt alternativ till verktygslåda av kardiovaskulär forskning. EHTs i 24-brunnsformatet har visat sig värdefulla för sjukdom modellering 8, 14, läkemedelssäkerhet screening 7, 8, 10, 11, 15, eller basisk kardiovaskulär forskning 16, 17.
Potentiella modifieringar av de grundläggande EHT protokoll innefattar studier av cellulär interaktion med definierade blandningar av kardiomyocyter och icke-kardiomyocyter 18 och afterload förbättring 14. Viktiga aspekter för felsökning inkluderar kvaliteten på ingångscellpopulationen och kvaliteten på fibrinogen. Om den initiala gelbildning är oregelbunden eller inte tillräckligt kompakt för att hålla to PDMS inlägg, eller om gelén snabbt urartade inom några dagar efter gjutning på grund av låg aprotinin koncentration, EHTs generation kommer inte att lyckas.
Följande begränsningar måste beaktas. (I) Genomströmningen i 24-brunnsformat inte är väl lämpad för en primär screening setup, men är tillräcklig för en sekundär bekräftelsefönster. (Ii) Den integrerade avläsning av kraft, sammandragnings kinetik och rytm har låg specificitet, vilket gör det svårt att koppla förändringar i kraft till specifika molekylära mekanismer. (Iii) Under det att 3D-kulturen format och sträckan som infördes genom böjda PDMS inlägg förbättrar morfologiska och funktionella aspekter av mognad, bristen på sanna inskjutna skivor, spontana slag, och lägre än normala adrenergiska responser tyder på att fullständig hjärt mognad ännu inte uppnås med detta protokoll. (iv) PDMS har visat sig absorbera olika läkemedel till olika sträcka 19 och den faktiska effektiva Koncentratjon på EHTs kan variera. Denna bias kan vara mer framträdande i kronisk toxicitetsstudier 15 än de undersöker akuta läkemedelseffekter 7, 8 och tydligt beror på drogen till hands. Som en följd av detta bör alla PDMS rack utsätts för läkemedel kasseras efter användning och den potentiella absorptionen av olika läkemedel måste beaktas när man analyserar data. (v) Med tanke på att 1x10 6 hiPSCs krävs per EHT kostnaderna per datapunkt är höga.
Betydelsen av detta protokoll i jämförelse med ex vivo hjärta kontraktilitet analys finns risk för att arbeta i ett mänskligt system avsaknaden av experimentella nedgångna och standardiserad produktion av EHTs som gör det möjligt att sätta upp stora studier om specifika genetiska bakgrunder (t.ex. sjukdom modellering ). I jämförelse med andra hiPSC testsystem (multielektrodgrupp, impedans), detta system analyserars sammandragande kraft som den viktigaste fysiologiska parametern av kardiomyocyter i en tredimensionell struktur och medger odling under definierad belastning. EHTs kontrakt regelbundet och vid stabil kraft, frekvens och rytm under många timmar och veckor, vilket möjliggör långtidsmätningar och utvärdering av kronisk toxicitet. EHT-analys kan utföras under elektrisk stimulering vilket är viktigt med avseende på den kraft-frekvensförhållande av muskelsammandragning och dess potentiella inverkan på läkemedelseffekter. Med avseende på det omogna status hiPSC-CM, har elektrisk stimulering potential att trycka cellerna mot en mer mogen fenotyp 20, 21 och skulle kunna ingå i EHT underhåll. Dessutom ger EHT testsystem hög halt avläsning inklusive alla standard histologiska parametrar samt biokemi (RNA, DNA, proteinisolering) 11. Potentiella framtida tillämpningar inkluderar aspekter av läkemedelsutveckling (målvalidering, säkerhetsfarmakologi) och sjukdom modellering i synnerhet i kombination med CRISPR / Cas9 förmedlad generering av isogena kontroller.
Vid underhåll av EHTs och prestanda koncentration-responskurvor, är det viktigt att noggrant följa instruktionerna för sterila cellodlings förfaranden för att undvika svampkontamineringar under överföring av PDMS rack mellan 24-brunnsplattor. Det mest kritiska steget med EHT är dock cardiomyocyte differentieringsprotokollet. För EHTs att bilda koherent slå muskelremsor, har ingångs befolkningen att bestå av minst 60% kardiomyocyter. Lyckligtvis differentieringsprotokoll blev mer robust och effektivt under åren och cardiomyocytes är lätt kommersiellt tillgängliga nu. Den roll som icke-myocyter i utvecklingen av hiPSC härrör konstruerad hjärtvävnad är inte helt klarlagda, ännu. Experiment med hiPSC-CM med hög renhet har lett till överraskande bra EHTass = "xref"> 7, men integrering av andra celltyper in i vävnaden har visat sig förbättra vävnadsfunktion och kan driva fenotypen mot en mogen fysiologi 22, 23, 24. Som vävnaderna alstras i en 24-brunns-format med en miljon celler per vävnad, är denna plattform fortfarande ganska dyra. Skalning ner till en 96-håls format strävat efter, men hittills robusthet outbalances denna brist. Protokollet presenteras i detta manuskript är tekniskt mycket robust med lite variation mellan replikat. Den intra-satsvariation är mycket låg för kinetiken (medelvariationskoefficient = 5%), och något stor för den spontana slag frekvensen (genomsnittlig variationskoefficient 10%) och kontraktionskraften (medelvariationskoefficient 17%). Tekniken är mycket robust. Över olika praktiker, är effektiviteten för att generera slå EHTs> 90% av gjutna hydrogeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IM, TE och AH är grundare av EHT Technologies GmbH, Tyskland.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för Alessandra Moretti och Dennis Schade för deras vänliga bidrag material. Vi erkänner stort stöd av IPS och EHT arbetsgrupp vid Institutionen för experimentell farmakologi och toxikologi i UKE. Arbetet av författarna stöds av bidrag från DZHK (German Center for Cardiovascular Research) och det tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF), den tyska Research Foundation (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), British National Center för att ersätta Förädling & Minskning av djur i forskning (NC3Rs SPRICKA-IT bevilja 35.911-259.146), den brittiska Heart Foundation RM / 13/30157, European Research Council (Advanced Grant IndivuHeart), den tyska Heart Foundation och Freie und Hansestadt Hamburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 mL falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
References
- Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
- Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
- Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).
- Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
- Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958 (2012).
- Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
- Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
- Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).
- Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
- Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).
- Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
- van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312 (2016).
- Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
- Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.
