تنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من البياض الدقيقي لونغ-مقروءة التسلسل
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
الفطريات البياض الدقيقي هي مجموعة من مسببات الأمراض الهامة اقتصاديا النبات الفطرية. لا يعرف إلا القليل نسبيا عن علم الأحياء وعلم الوراثة من هذه الجراثيم الجزيئي، ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص الموارد الوراثية والجينوم متطورة. هذه الكائنات الحية لديها كبيرة، الجينوم المتكررة، التي جعلت تسلسل الجينوم والتجمع الصعب باهظة. هنا، نحن تصف أساليب لجمع واستخراج وتنقية ومراقبة الجودة تقييم عالية الوزن الجزيئي الجيني DNA من أنواع البياض الدقيقي واحد، Golovinomyces cichoracearum. ويتضمن بروتوكول صفها اضطراب الميكانيكي للجراثيم تليها الأمثل الفينول / الكلوروفورم استخراج الحمض النووي الجيني. وكان العائد نموذجي 7 DNA ميكروغرام لكل 150 غبيرات ملغ. الحمض النووي الجيني أن يتم عزل باستخدام هذا الإجراء هو مناسبة لتسلسل قراءة طويلة (أي> 48.5 KBP). تدابير مراقبة الجودة لضمان حجم، والغلة، ونقاء من الحمض النووي الجيني أيضاووصف في هذا الأسلوب. وتسلسل الحمض النووي الجيني نوعية الموصوفة هنا تسمح لتجميع ومقارنة الجينوم متعددة البياض الدقيقي، والتي بدورها سوف تؤدي إلى فهم أفضل وتحسين السيطرة على هذا الممرض الزراعي.
Introduction
بياض دقيقي هي مجموعة من إلزام مصنع الفطرية biotrophic مسببات الأمراض التي، عندما تؤخذ معا، هي أكبر سبب للأمراض النبات في جميع أنحاء العالم 1. وهناك أكثر من 900 نوع وصفها البياض الدقيقي، والتي تم تجميعها تصنيفيا إلى خمس قبائل داخل الأسرة Erisyphaceae 2. بسبب على حد سواء لأهميتها الاقتصادية والعلاقة الحميمة أن تتطور مع مضيفيهم، كانت أمراض البياض الدقيقي موضوع البحث ل> 100 سنة. على العدوى، بياض دقيقي تثير تغييرات جذرية في بنية الخلية، والتمثيل الغذائي والبيولوجيا الجزيئية من مضيفيهم، للاستفادة هذا الممرض. ومع ذلك، فإن دراسة بياض دقيقي هي تحديا من نوع خاص أسلوب حياتهم تلزم، ولم يتم بعد وصف نمو الفطريات في ثقافة نقية 3 و 4 و 5 نظرا ل،"XREF"> 6 و 7 و 8. كما لم يتم حتى الآن إنجاز موثوق بها، التحول الجيني مستقر للبياض دقيقي، على الرغم من التحول عابرة وقد ورد في بعض الأنواع 9 و 10.
وقد ثبت أن تسلسل الجينوم وتجميع البياض الدقيقي الصعب يرجع ذلك إلى عدد من الميزات الموجودة في الجينوم نفسه. الجينوم البياض الدقيقي كبيرة (120-180 م ب ب) بالنسبة إلى العوامل الوراثية الفطرية الأخرى، وتتكون من 60-90٪ موزعة بالتساوي العناصر المتكررة 11. وتشمل هذه العناصر يكرر الطرفية غير طويلة، فضلا عن العناصر المتكررة غير مصنف. اثنين speciales formae من نوع البياض الدقيقي واحدة، Blumeria graminis و. س. hordei وو. س. الحنطة (محكمة العدل الاتحادية وبغت، على التوالي)، وكذلك العنب البياض الدقيقي الفقاقة الفتاكة، يكون النحلالتسلسل ن، وقد تم الانتهاء من مشروع الجينوم للعديد من الآخرين 12 و 13 و 14. وقد جعلت الطبيعة التكرارية للجينومات الصعب التجمع، وتجميعها في محكمة العدل الاتحادية الجينوم الانتهاء في 6989 supercontigs مع L50 من 2 ميجا بايت 12.
وعلى الرغم من الجينوم كبير، تظهر بياض دقيقي لديها عدد قليل من البروتين الجينات الترميز، مع 5845 و6540 الجينات وتوقع في محكمة العدل الاتحادية وبغت، على التوالي. يظهر بياض دقيقي متسلسلة أيضا تفتقر إلى لا يقل عن 99 الجينات الأساسية التي لا غنى عنها في الفطريات الأخرى، وهو ما يتسق مع الاعتماد على الفطريات على النبات المضيف من أجل البقاء على قيد الحياة 11، 12، 13، 14.
تسلسل المتكررة قرب تيلومرات، القسيم، RN الريباسيوالمصفوفات والمناطق المخصب في جين قافز الجين يتم تجميعها بشكل سيئ من استراتيجيات التسلسل قراءة قصيرة وغالبا ما تكون ممثلة تمثيلا ناقصا في المجالس الجينوم 15. ويعتقد أن هذه المناطق لتكون مسؤولة عن العديد من الثغرات التي تحدث في تسلسل الجينوم، وهذا ينطبق على بياض دقيقي مع التوسع واسعة من العناصر المتكررة 16. غاية غالبا ما توجد مناطق الجينوم البلاستيكية في تلك المناطق المتكررة 3. وهي بمثابة موقع لإعادة ترتيب الكروموسومات، وغالبا ما ترميز الجينات تحت ضغط انتقائي قوي، مثل الجينات ترميز البروتينات المستجيب والجينات التي تكود إنزيمات الأيض الثانوية. التقدم في جزيء واحد تقنيات التسلسل قراءة طويلة توفر حلا ممكنا لتسلسل عبر المناطق المتكررة من الجينوم 15. على سبيل المثال، Faino وآخرون. (2015) وجدت أن بما في ذلك سلسلة طويلة قراءة التقنيات وم البصريةيسمح apping لهم لإنتاج تسلسل الجينوم الفجوة أقل للسلالتين من نبات فطري الممرض الداليا الكبكوبية، ثلاثة أضعاف نسبة تسلسل الحمض النووي المتكررة في الجينوم، وزيادة عدد من الشروح الجين (وخفض عدد جزئية أو مفقودة شروح الجين ) والجينوم يكشف إعادة ترتيب 17.
لاستخدام هذه التقنيات التسلسل قراءة طويلة، على تركيزات عالية من جودة عالية الحمض النووي الجيني، مع أحجام الحد الأدنى> 20 KBP، وهناك حاجة. نحن هنا وصف الأساليب لدينا لجمع بوغي، وتنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي من غبيرات وتقييمنا لمراقبة الجودة باستخدام cichoracearum الأنواع البياض الدقيقي Golovinomyces نمت على الخيار 18. ويستند هذا البروتوكول على بروتوكول المتقدمة في المجموعة مختبر B. كيلر (جامعة زيورخ، سويسرا) 13، 19ويشمل العديد من التعديلات التي أدت إلى زيادة الغلة DNA ونسبة أعلى من DNA> 48.5 KBP في الحجم. ويتضمن البروتوكول أيضا خطوات لمراقبة الجودة بناء على توصيات من وزارة الطاقة الأمريكية المشتركة الجينوم معهد 20 و 21 و 22.
وظيفة كل كاشف المدرجة في تحلل العازلة، والأساس المنطقي لكل خطوة التنقية، وكما هو موضح في هنري (2008) 23. تم التشاور البروتوكولات المنشورة المتاحة لعزل عالية الوزن الجزيئي الجيني DNA من الأنسجة النباتية والجراثيم أيضا خلال تصميم هذا البروتوكول 24، 25، 26، 27، 28.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل الحصول على النقي، وارتفاع الوزن الجزيئي الجيني DNA من تلزم biotrophic فطريات البياض الدقيقي، وقد تم تطوير نسخة معدلة من الأساليب المذكورة سابقا 30. ومتوسط العائد باستخدام هذا البروتوكول الأمثل هو 7 DNA ميكروغرام لكل 150 ملغ غبيرات، مضاعفة الغلة التي تم ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1969).
- Braun, U., Cook, R. T. . Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , (2012).
- Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
- Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world’s most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
- Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
- Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
- Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O’Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
- Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
- Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
- Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
- Hacquard, S., Francis, M. M. . Advances in Botanical Research. 70, 109-142 (2014).
- Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
- Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092 (2013).
- Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081 (2014).
- Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
- Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
- Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
- Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
- Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
- Henry, R. J. . Plant genotyping II: SNP technology. , (2008).
- Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
- Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
- Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105 (2015).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
- Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470 (2014).
- Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).
