La purification de l'ADN de haut poids moléculaire Génomique de oïdium pour le séquençage de longue Lire
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
Les champignons oïdium sont un groupe d'agents pathogènes des plantes fongiques économiquement importantes. On sait peu de choses sur la biologie moléculaire et de la génétique de ces agents pathogènes, en partie en raison d'un manque de ressources génétiques et génomiques bien développées. Ces organismes ont de grands génomes répétitifs, qui ont fait le séquençage du génome et de l'assemblage prohibitive difficile. Nous décrivons ici les méthodes de collecte, de l' extraction, la purification et l' évaluation du contrôle de la qualité de l' ADN génomique de haut poids moléculaire d'une espèce de oïdium, Golovinomyces cichoracearum. Le protocole décrit comprend une rupture mécanique de spores suivi d'un phénol optimisé / chloroforme extraction de l'ADN génomique. Un rendement typique était de 7 pg d'ADN par 150 mg de conidies. L'ADN génomique est isolé en utilisant cette procédure est appropriée pour le séquençage de longue lecture ( par exemple,> 48,5 kpb). mesures de contrôle de la qualité pour assurer la taille, le rendement et la pureté de l'ADN génomique sont égalementdécrit dans le présent procédé. Le séquençage de l'ADN génomique de la qualité décrite ici permettra l'assemblage et la comparaison des génomes multiples de l'oïdium, qui à son tour conduire à une meilleure compréhension et un meilleur contrôle de ce pathogène agricole.
Introduction
Oïdium sont un groupe de plantes fongique biotrophe obligatoire des agents pathogènes qui, lorsqu'ils sont pris ensemble, sont la principale cause de maladies des plantes dans le monde entier 1. Il y a plus de 900 espèces décrites de l' oïdium, qui ont été regroupées en cinq taxonomiquement tribus au sein de la famille Erisyphaceae 2. En raison de leur importance à la fois économique et la relation intime qu'ils développent avec leurs hôtes, les maladies oïdium ont fait l'objet de la recherche pour> 100 ans. Lors de l'infection, l'oïdium provoquent des changements radicaux dans la structure cellulaire, le métabolisme et la biologie moléculaire de leurs hôtes, de bénéficier de ce pathogène. Cependant, l'étude de l' oïdium est particulièrement difficile en raison de leur mode de vie obligatoire, et la croissance du champignon en culture pure n'a pas encore été décrit 3, 4, 5,"xref"> 6, 7, 8. Fiable, la transformation génétique stable de l' oïdium a pas encore été accompli, bien que la transformation transitoire a été rapportée chez certaines espèces 9, 10.
Le séquençage et l'assemblage des génomes oïdium est avéré difficile en raison d'un certain nombre de caractéristiques du génome lui-même. Génomes de l' oïdium sont grandes (120-180 Mbp) par rapport à d' autres génomes fongiques, et se composent de 60 – 90% des éléments répétitifs répartis uniformément 11. Ces éléments comprennent des répétitions terminales non-longues, ainsi que des éléments répétitifs non catégorisés. Deux formae d'une Speciales seule espèce oïdium, Blumeria graminis f. sp. hordei et f. sp. tritici (BGH et Bgt, respectivement), ainsi que l'oïdium de la vigne Erysiphe necator, ont abeillen séquencés, et les projets de génomes pour plusieurs autres ont été réalisées 12, 13, 14. Le caractère répétitif des génomes a fait l' assemblage difficile, et le génome Bgh complété a été assemblé en 6,989 supercontigs avec un L50 de 2 Mb 12.
Malgré le grand génome, les oïdium semblent avoir un petit nombre de gènes codant pour des protéines, avec 5,845 et 6.540 gènes prédits dans Bgh et Bgt, respectivement. Les oïdium séquencés semblent également manquer au moins 99 gènes essentiels qui sont essentiels dans d' autres champignons, ce qui est cohérent avec la dépendance des champignons sur leur plante hôte pour la survie 11, 12, 13, 14.
séquences répétitives proches de télomères, centromères, ribosomal RNA matrices de gènes et des régions enrichies en éléments transposables sont mal assemblés à partir de stratégies de séquençage courte lecture et sont souvent sous-représentés dans les assemblages de génome 15. Ces régions sont considérées comme responsables de bon nombre des lacunes qui se produisent dans des séquences du génome, et cela vaut pour les oïdium avec leur vaste expansion des éléments répétitifs 16. Très régions du génome plastique sont souvent trouvés dans ces régions répétitives 3. Ils servent un site de réarrangements chromosomiques et encodent souvent des gènes sous forte pression sélective, tels que les gènes codant pour des protéines effectrices et les gènes codant pour des enzymes du métabolisme secondaire. Les progrès des technologies de séquençage à long lecture seule molécule offrent une solution potentielle pour le séquençage à travers les régions répétitives des génomes 15. Par exemple, Faino et al. (2015) ont trouvé que l'inclusion de longue séquence de lecture optique et des technologies mapping leur a permis de produire une séquence du génome de fente inférieure à deux souches de l'agent pathogène des plantes fongique dahlia Verticillium, triplant la proportion de séquences d'ADN répétitives dans le génome, ce qui augmente le nombre d'annotations de gènes (et réduire le nombre d'annotations de gènes partielles ou manquantes ) et le génome révélateur réarrangements 17.
Pour utiliser ces technologies de séquençage de longue lecture, de fortes concentrations d'ADN génomique de haute qualité, avec des tailles minimum> 20 kbp, sont nécessaires. Nous décrivons ici nos méthodes de collecte conidies, la purification de l' ADN à haut poids moléculaire de conidies et nos évaluations de contrôle de la qualité en utilisant la cichoracearum de l'espèce de oïdium Cultivé sur le concombre 18. Ce protocole est basé sur un protocole développé dans le groupe B. laboratoire Keller (Université de Zürich, Zürich Suisse) 13, 19et comprend plusieurs modifications qui ont conduit à des rendements accrus d'ADN et une proportion plus élevée d'ADN> 48,5 kpb de taille. Le protocole comprend également des mesures de contrôle de la qualité en fonction des recommandations du ministère américain de l' énergie Joint Genome Institute 20, 21, 22.
La fonction de chaque réactif inclus dans le tampon de lyse, et la justification de chaque étape de purification, sont tels que décrits dans Henry (2008) 23. Protocoles publiés disponibles pour l' isolement de l' ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de tissus végétaux et microbiens ont également été consultés lors de la conception de ce protocole 24, 25, 26, 27, 28.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin d'obtenir de l' ADN pur, génomique de haut poids moléculaire de la obligatoire champignons de l' oïdium biotrophe, une version modifiée de procédés décrits précédemment a été développé 30. Le rendement moyen en utilisant ce protocole optimisé est de 7 pg d'ADN par 150 mg de conidies, un doublement du rendement obtenu avec un protocole antérieur. En outre, la taille moyenne est passée d'environ 20 kbp à plus de 48,5 kbp. Ce protocole a été optimisé dans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
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