Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
Die Echten Mehltaupilze sind eine Gruppe von wirtschaftlich bedeutenden pilzliche Pflanzenpathogene. Relativ wenig ist von gut entwickelten genetischen und genomischen Ressourcen auf einen Mangel auf Grund über die Molekularbiologie und Genetik dieser Erreger, teilweise bekannt. Diese Organismen haben große, sich wiederholende Genome, die gemacht haben Genom-Sequenzierung und Montage prohibitiv schwierig. Hier beschreiben wir Methoden zur Erfassung, Extraktion, Reinigung und Bewertung der Qualitätskontrolle von hochmolekularem genomischer DNA aus einem echten Mehltau – Arten, Golovinomyces cichoracearum. Das beschriebene Protokoll umfasst mechanische Störung durch eine optimierte Phenol / Chloroform-Extraktion genomische DNA gefolgt Sporen. Eine typische Ausbeute betrug 7 & mgr; g DNA pro 150 mg Konidien. Die genomische DNA , die dieses Verfahren isoliert wird , verwendet , ist geeignet für die Lang lesen Sequenzierung (dh> 48,5 kbp). Maßnahmen zur Qualitätskontrolle, die Größe, die Ausbeute und Reinheit der genomischen DNA, um sicherzustellen, sind auchin diesem Verfahren beschrieben. Die Sequenzierung der genomischen DNA der hier beschriebenen Qualität wird für die Montage und den Vergleich von mehreren Mehltau Genome, die wiederum erlauben zu einem besseren Verständnis führen wird und eine verbesserte Steuerung dieser landwirtschaftlichen Erreger.
Introduction
Echte Mehltaupilze sind eine Gruppe von obligater biotrophen pilzliche Pflanzenpathogene , dass, wenn sie zusammengenommen, ist die größte Ursache für Pflanzenkrankheiten weltweit 1. Es gibt über 900 beschriebene Arten von Mehltau, der taxonomisch in fünf Stämme innerhalb der Familie Erisyphaceae 2 zusammengefasst wurde. Sowohl auf ihre wirtschaftlichen Bedeutung und die intimen Beziehung, die sie mit ihren Wirten zu entwickeln haben, Mehltau Krankheiten für> 100 Jahre sind der Gegenstand der Forschung. Bei Infektion, entlocken Echte Mehltau drastische Veränderungen in der Zellstruktur, den Stoffwechsel und Molekularbiologie ihrer Wirte, diese Erreger zu profitieren. Das Studium der Echten Mehltau ist jedoch besonders schwierig aufgrund ihres obligater Lebensstil, und das Wachstum des Pilzes in Reinkultur ist noch nicht 3 beschrieben wurde, 4, 5,"Xref"> 6, 7, 8. Zuverlässige, stabile genetische Transformation von Echten Mehltau hat auch noch nicht erreicht worden, obwohl transiente Transformation 9 bei einigen Arten berichtet, 10.
Die Sequenzierung und Montage von Echtem Mehltau Genome hat sich als schwierig erwiesen, aufgrund einer Reihe von Merkmalen des Genoms selbst. Mehltaus Genomen sind groß (120-180 MBP) relativ zu anderen Pilz-Genomen, und bestehen aus 60 bis 90% gleichmäßig verteilt repetitiven Elementen 11. Diese Elemente sind nicht-long terminal repeats, sowie uncategorized repetitive Elemente. Zwei formae speciales einer einzigen echten Mehltau – Arten, Blumeria graminis f. sp. hordei und f. sp. tritici (Bgh und Bgt, respectively) sowie die Traubenmehltau Erysiphe necator, haben Bienenn sequenziert und Entwurf Genomen für mehr andere wurde 12 abgeschlossen, 13, 14. Die sich wiederholenden Natur der Genome hat Montage erschwert und das fertige Bgh – Genom wurde in 6.989 supercontigs mit L50 von 2 Mb 12 montiert.
Trotz des großen Genoms scheint der Echte Mehltau eine kleine Anzahl von Protein – kodierenden Genen zu haben, mit 5.845 und 6.540 Genen vorhergesagt in Bgh und Bgt ist. Die sequenzierten echte Mehltaue scheinen auch mindestens 99 Kern Gene zu fehlen , die in anderen Pilzen wesentlich sind, die mit der Abhängigkeit der Pilze auf ihrer Wirtspflanze für das Überleben 11, 12, 13, 14 im Einklang steht.
Repetitive Sequenzen nahe Telomere, Centromere, ribosomale RNEin Gen – Arrays und Regionen in transponierbaren Elementen angereichert sind schlecht aus Kurz gelesen Sequenzierungsstrategien zusammengesetzt und sind oft unterrepräsentiert in Genomanordnungen 15. Solche Bereiche für viele der Lücken verantwortlich sein wird angenommen , dass in Genomsequenzen auftreten, und dies gilt auch für die echte Mehltaue mit ihren umfangreichen Erweiterung von repetitiven Elementen 16. Highly Kunststoff Genomregionen oft in einem solchen repetitiven Regionen 3 gefunden. Sie dienen als Gebiet von Chromosomenumlagerungen und oft codieren Gene unter starkem Selektionsdruck, wie beispielsweise die Gene, die für Proteine Effektor und die Gene Enzyme des Sekundärstoffwechsels kodieren. Die Fortschritte in der Einzelmolekül – Lang lesen Sequenzierungstechnologien bieten eine mögliche Lösung für die Sequenzierung durch sich wiederholende Regionen von Genomen 15. Zum Beispiel Faino et al. (2015) fanden heraus, dass auch lange Sequenz gelesen Technologien und m optischenapping ließ sie für zwei Stämme der pilzliche Pflanzenpathogen Verticillium Dahlia eine lückenlose Genomsequenz erzeugen, den Anteil der sich wiederholenden DNA – Sequenzen in das Genom zu verdreifachen, die Anzahl der Gen Annotationen erhöht (und die Verringerung der Anzahl von Teil oder fehlende Gen Annotationen ) und aufschlussreich Genom – Rearrangements 17.
Um diese langfris las Sequenzierungstechnologien, hohe Konzentrationen von hohen Qualität genomischer DNA, mit minimalen Größen> 20 kbp zu verwenden, benötigt. Hier beschreiben wir unsere Methoden zur konidiale Sammlung, Reinigung von hochmolekularer DNA von Konidien und unsere Qualitätskontrolle Einschätzungen Mehltauart Golovinomyces cichoracearum auf Gurken angebaut mit 18. Dieses Protokoll basiert auf einem Protokoll im Labor Gruppe B. Keller entwickelt (Universität Zürich, Zürich Schweiz) 13, 19und umfasst mehrere Modifikationen, die zu einem erhöhten DNA-Ausbeuten und einen höheren Anteil an DNA> 48,5 kbp in Größe geführt. Das Protokoll enthält auch die Qualitätskontrolle Schritte basieren auf den Empfehlungen aus den Vereinigten Staaten Department of Energy Joint Genome Institute 20, 21, 22.
Die Funktion jedes Reagenz in dem Lysepuffer enthalten ist , und die Gründe für jeden Reinigungsschritt werden , wie in Henry (2008) 23 beschrieben. Verfügbare veröffentlichte Protokolle zur Isolierung von hochmolekulare genomische DNA aus pflanzlichen und mikrobiellen Geweben wurden auch bei der Gestaltung dieses Protokolls 24, 25, 26 angehört, 27, 28.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um rein, hochmolekulare genomische DNA aus den obligaten biotrophe echten Mehltaupilzen zu erhalten, eine modifizierte Version des zuvor beschriebenen Verfahrens wurde 30 entwickelt. Die durchschnittliche Ausbeute dieses optimierten Protokoll 7 ug DNA pro 150 mg Konidien, eine Verdoppelung der Ausbeute bei einem früheren Protokoll erhalten. Auch erhöhte sich die durchschnittliche Größe von etwa 20 kbp auf über 48,5 kbp. Dieses Protokoll wurde in dem Gurken- G. cichoracearum System o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
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