लंबे समय से पढ़ें अनुक्रमण के लिए ख़स्ता फफूंदी से उच्च आण्विक वजन जीनोमिक डीएनए की शुद्धि
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
पाउडर फफूंदी कवक आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कवक संयंत्र रोगजनकों के एक समूह है। अपेक्षाकृत कम अच्छी तरह से विकसित आनुवंशिक और जीनोमिक संसाधनों की कमी के कारण आण्विक जीव विज्ञान और इन रोगाणुओं की आनुवंशिकी, भाग में के बारे में जाना जाता है। ये जीव बड़े, दोहराए जीनोम, जो जीनोम अनुक्रमण और विधानसभा निषेधात्मक मुश्किल बना दिया है। यहाँ, हम संग्रह, निकासी, शुद्धि और गुणवत्ता नियंत्रण एक पाउडर फफूंदी प्रजातियों, Golovinomyces cichoracearum से उच्च आणविक भार जीनोमिक डीएनए के आकलन के लिए तरीकों की व्याख्या। प्रोटोकॉल में वर्णित एक अनुकूलित फिनोल / क्लोरोफॉर्म जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के बाद बीजाणुओं के यांत्रिक विघटन भी शामिल है। एक ठेठ उपज प्रति 150 मिलीग्राम conidia 7 माइक्रोग्राम डीएनए था। जीनोमिक डीएनए है कि इस प्रक्रिया का उपयोग कर अलग लंबे समय से पढ़ अनुक्रमण (यानी,> 48.5 KBP) के लिए उपयुक्त है। गुणवत्ता नियंत्रण के उपायों आकार, उपज, और जीनोमिक डीएनए की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए भी कर रहे हैंइस विधि में वर्णित है। गुणवत्ता यहाँ वर्णित के जीनोमिक डीएनए के अनुक्रमण विधानसभा और कई पाउडर फफूंदी जीनोम, जो बारी में एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व करेंगे की तुलना के लिए अनुमति देते हैं और इस कृषि रोगज़नक़ के नियंत्रण में सुधार होगा।
Introduction
चुरमुरा mildews लाचार biotrophic कवक संयंत्र के एक समूह रोगज़नक़ों कि, जब एक साथ लिया, संयंत्र रोग दुनिया भर में 1 के सबसे बड़े कारण हैं। वहाँ पाउडर फफूंदी के 900 से अधिक वर्णित प्रजातियों, जो taxonomically परिवार Erisyphaceae 2 के भीतर पांच जनजातियों के रूप में वर्गीकृत किया गया है। उनकी आर्थिक महत्व और अंतरंग संबंध वे उनके मेजबानों के साथ विकसित करने के लिए दोनों कारण, पाउडर फफूंदी रोगों> 100 साल के लिए शोध का विषय रहा है। संक्रमण होने पर, चुरमुरा mildews कोशिकीय संरचना, चयापचय और उनके भोजनदायी की आणविक जीव विज्ञान में भारी बदलाव को प्रकाश में लाना, यह रोगजनक लाभ के लिए। हालांकि, चुरमुरा mildews के अध्ययन के कारण लाचार जीवन शैली, और शुद्ध संस्कृति में कवक के विकास अभी तक नहीं 3 वर्णित किया गया है, 4, 5 विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है,"xref"> 6, 7, 8। विश्वसनीय, चुरमुरा mildews के स्थिर आनुवंशिक परिवर्तन भी अभी तक नहीं पूरा किया गया है, हालांकि क्षणिक परिवर्तन कुछ प्रजातियों 9, 10 में सूचित किया गया।
अनुक्रमण और पाउडर फफूंदी जीनोम की विधानसभा जीनोम ही की सुविधाओं की एक संख्या की वजह से कठिन साबित हुआ है। (- 180 MBP 120) अन्य कवक जीनोम के सापेक्ष, और 60 से मिलकर बनता है – पाउडर फफूंदी जीनोम बड़े हैं 90% समान रूप से वितरित दोहराए तत्वों 11। इन तत्वों को गैर लंबे टर्मिनल दोहराता है, साथ ही अवर्गीकृत दोहराव तत्व शामिल हैं। एक भी पाउडर फफूंदी प्रजातियों, Blumeria graminis च के दो formae speciales। सपा। hordei और च। सपा। tritici (BGH और BGT, क्रमशः) के साथ-साथ अंगूर पाउडर फफूंदी Erysiphe necator, मधुमक्खी हैn अनुक्रम, और कई अन्य के लिए मसौदा जीनोम 12, 13, 14 पूरी हो चुकी हैं। जीनोम का दोहराव प्रकृति विधानसभा मुश्किल बना दिया है, और पूरा BGH जीनोम 2 के L50 Mb 12 के साथ 6989 supercontigs में एकत्रित हो गया था।
बड़े जीनोम के बावजूद, चुरमुरा mildews 5845 और 6540 जीन क्रमश: BGH और BGT में भविष्यवाणी के साथ, प्रोटीन कोडिंग जीन की एक छोटी संख्या दिखाई देते हैं। अनुक्रम चुरमुरा mildews भी कम से कम 99 कोर जीन है कि अन्य कवक, जो अस्तित्व 11, 12, 13, 14 के लिए अपने मेजबान संयंत्र पर कवक की निर्भरता के साथ संगत है में आवश्यक हैं की कमी दिखाई देते हैं।
telomers, सेंट्रोमीयरों, राइबोसोमल आर.एन. पास दोहराव दृश्योंएक जीन सरणियों और transposable तत्वों में समृद्ध क्षेत्रों खराब कम पढ़ा अनुक्रमण रणनीतियों से इकट्ठा किया और कम प्रतिनिधित्व जीनोम विधानसभाओं 15 में अक्सर होते हैं। इस तरह के क्षेत्रों अंतराल कि जीनोम अनुक्रम में होते हैं के कई के लिए जिम्मेदार माना जाता है, और इस दोहराव तत्वों 16 के अपने विस्तृत विस्तार के साथ पाउडर mildews पर लागू होता है। अत्यधिक प्लास्टिक जीनोम क्षेत्रों अक्सर इस तरह के दोहराव क्षेत्रों 3 में पाए जाते हैं। वे गुणसूत्र rearrangements की एक साइट के रूप में सेवा और अक्सर इस तरह के जीन प्रेरक प्रोटीन एन्कोडिंग और जीन माध्यमिक चयापचय के एंजाइम एन्कोडिंग के रूप में मजबूत चयनात्मक दबाव में जीन, सांकेतिक शब्दों में बदलना। एकल अणु लंबे समय से पढ़ अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के क्षेत्र में अग्रिम जीनोम 15 का दोहराव क्षेत्रों में अनुक्रमण के लिए एक संभावित समाधान प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, Faino एट अल। (2015) में पाया गया कि सहित लंबी अनुक्रम प्रौद्योगिकियों और ऑप्टिकल मीटर पढ़ाapping उन्हें कवक संयंत्र रोगज़नक़ Verticillium डाहलिया के दो उपभेदों के लिए एक अंतर-कम जीनोम अनुक्रम का उत्पादन करने की अनुमति दी, जीनोम में दोहराव डीएनए अनुक्रम का अनुपात तीन गुना, जीन एनोटेशन की संख्या में वृद्धि (और आंशिक की संख्या कम करने या जीन एनोटेशन लापता ) और खुलासा जीनोम 17 rearrangements।
कम से कम आकार> 20 KBP के साथ इन लंबे समय से पढ़ अनुक्रमण प्रौद्योगिकी, उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए के उच्च सांद्रता, रोजगार के लिए, की जरूरत है। यहाँ हम conidia से conidial संग्रह, उच्च आणविक भार डीएनए की शुद्धि के लिए हमारे तरीकों की व्याख्या और हमारे गुणवत्ता नियंत्रण पाउडर फफूंदी प्रजातियों Golovinomyces cichoracearum का उपयोग कर आकलन ककड़ी 18 पर उगाया जाता है। यह प्रोटोकॉल B केलर प्रयोगशाला समूह (ज़्यूरिख़ विश्वविद्यालय, ज़्यूरिख़ स्विट्जरलैंड) 13, 19 में विकसित एक प्रोटोकॉल पर आधारित हैऔर कई संशोधनों है कि वृद्धि की डीएनए पैदावार के लिए नेतृत्व किया है और आकार में डीएनए> 48.5 KBP के एक उच्च अनुपात भी शामिल है। प्रोटोकॉल भी गुणवत्ता नियंत्रण ऊर्जा संयुक्त जीनोम संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग संस्थान 20, 21, 22 से सिफारिशों के आधार पर चरण शामिल हैं।
प्रत्येक अभिकर्मक lysis बफर में शामिल हैं, और प्रत्येक शुद्धि कदम के लिए तर्क के समारोह, के रूप में हेनरी (2008) 23 में वर्णित हैं। संयंत्र और माइक्रोबियल ऊतकों से उच्च आणविक भार जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए उपलब्ध प्रकाशित प्रोटोकॉल को भी इस प्रोटोकॉल 24, 25, 26, 27, 28 के डिजाइन दौरान परामर्श किया गया।
Protocol
Representative Results
Discussion
आदेश लाचार biotrophic पाउडर फफूंदी कवक से शुद्ध, उच्च आणविक भार जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए, पहले से वर्णित विधियों का एक संशोधित संस्करण 30 विकसित किया गया था। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग औ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
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