ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
うどんこ病菌は経済的に重要な真菌植物病原体のグループです。比較的少ないが原因よく発達し、遺伝とゲノムリソースの不足のため一部では、これらの病原体の分子生物学および遺伝学について知られています。これらの生物は、ゲノム配列決定およびアセンブリが極めて困難作った大規模な、反復ゲノムを、持っています。ここでは、1つのうどんこ病種、Golovinomyces cichoracearumから高分子量のゲノムDNAの採取、抽出、精製及び品質管理の評価のための方法について説明します。記載されたプロトコルは、最適化されたフェノール/クロロホルムゲノムDNAを抽出した胞子の機械的破壊を含みます。典型的な収量は、150mgの分生子あたり7μgのDNAをでした。この手順を用いて単離されたゲノムDNAは、長いリードシーケンシング（ すなわち 、> 48.5 kbpの）に適しています。品質管理対策は、ゲノムDNAの大きさ、収率、および純度を確保するためでもありますこの方法で説明します。ここで説明する品質のゲノムDNAの配列決定は、組み立てと今度はより良い理解につながる複数のうどんこ病のゲノムの比較を可能にし、この農業病原体の制御を改善します。
Introduction
うどんこ病は、絶対biotrophic真菌植物のグループが一緒になったときに、植物病害全世界1の最大の原因である、という病原体です。分類学的に家族Erisyphaceae 2内の5つの種族に分類されているうどん粉病の900以上述べた種が、あります。彼らの経済的重要性と、彼らは彼らのホストと発展親密な関係の両方により、うどんこ病は> 100年間の研究の対象とされてきました。感染すると、うどんこ病は、この病原体の利益のために、細胞構造、代謝およびそのホストの分子生物学の急激な変化を誘発します。 しかし 、うどんこ病の研究は、それらの偏ライフスタイルに特に困難である、と純粋培養中の真菌の成長はまだ3に記載されていない、4、5"外部参照"> 6、7、8。一過性の形質転換は、いくつかの種9、10で報告されているが、うどんこ病の信頼性の高い、安定した遺伝的形質転換はまた、まだ達成されていません。
うどんこ病のゲノムのシーケンシングおよびアセンブリが原因ゲノム自体の機能の数に困難であることが判明しました。ウドンコ病ゲノムは、大きい（120から180 MBP）他の真菌ゲノムに対して、及び60から構成- 90％の均一に分布反復エレメント11。これらの要素は、非長末端反復だけでなく、未分類の反復要素を含みます。単一うどんこ病種、 ブルメリア・グラミニス f の二formae speciales。 SP。 hordeiと、f。 SP。 トリチシ（BGHそれぞれBGT）ならびにブドウうどんこ病エリシフェの鉤虫、蜂を有しますN配列決定し、そしていくつかの他のもののためのドラフトゲノムは12、13、14を完了しました。ゲノムの反復性は、アセンブリ困難になっており、完成BGHゲノムは2メガビット12のL50と6989 supercontigsに組み立てました。
大規模なゲノムにもかかわらず、うどんこ病は、それぞれ、BGHとBGTで予測5845および6540の遺伝子と、タンパク質をコードする遺伝子の数が少ないように見えます。配列決定された粉末状のカビも生存11、12、13、14のためにそれらの宿主植物上の真菌の依存性と一致している他の真菌において必須である少なくとも99のコア遺伝子を欠いているように見えます。
テロマー、セントロメア、リボソームRN近く反復配列遺伝子配列および転移因子に富む領域が不十分ショートリード配列決定戦略から組み立てられ、アンダー表さゲノムアセンブリ15であることが多いされています。そのような領域は、ゲノム配列において生じるギャップの多くの原因であると考えられ、これは、反復エレメント16のそれらの広範な拡大にうどんこ病に適用されています。高可塑性ゲノム領域は、多くの場合、このような反復領域3に記載されています。これらは、染色体再配列の部位として機能し、しばしばそのようなエフェクタータンパク質をコードする遺伝子と二次代謝の酵素をコードする遺伝子のような強い選択圧の下で遺伝子をコードします。単一分子の長いリード配列決定技術の進歩は、ゲノム15の繰り返し領域の両端の配列決定のための潜在的な解決策を提供します。例えば、Faino ら。 （2015）を含む長い配列は技術や光Mを読み取ることがわかっappingは、遺伝子注釈の数を増加させる（及び部分的または欠落遺伝子注釈の数を減らす、ゲノム中の反復DNA配列の割合が3倍、それらは真菌植物病原体のVerticilliumのダリアの二つの株のためにギャップのないゲノム配列を生成することができ）と暴露のゲノム再編成17。
> 20 kbpの最小限のサイズでこれらの長い読みシーケンシング技術、高品質のゲノムDNAの高濃度を採用するために、必要とされています。ここでは、分生子から分生子コレクション、高分子量のDNAを精製するための私達の方法を説明し、うどんこ病種Golovinomyces cichoracearumを使用して、当社の品質管理評価はキュウリ18上に成長させました。このプロトコルはB.ケラー実験群（チューリッヒ大学、チューリッヒ、スイス）13、19に開発されたプロトコルに基づいていますそして、増加DNA収量につながったいくつかの修正およびサイズでDNA> 48.5 kbpのより高い割合を含みます。プロトコルはまた、エネルギー共同ゲノム研究所20、21、22の米国部門からの推薦に基づき、品質管理工程を含みます。
ヘンリー（2008）23に記載されるように溶解緩衝液に含まれる各試薬の機能、及び各精製工程のための理論的根拠は、です。植物および微生物組織から高分子量のゲノムDNAの単離のための利用可能な公開されたプロトコルは、このプロトコル24、25、26、27、28の設計時に相談しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
偏biotrophicウドンコ病菌類から純粋な、高分子量のゲノムDNAを得るために、以前に記載された方法の修正版30を開発しました。この最適化されたプロトコルを使用して平均収量は150mgの分生子あたり7μgのDNAを、従来のプロトコルを用いて得られた収量の倍増です。また、平均粒径は48.5 kbpの上に約20 kbpのから増加しました。このプロトコルはcucumber- G.のcichoracearumシステム</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1969).
- Braun, U., Cook, R. T. . Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , (2012).
- Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
- Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world’s most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
- Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
- Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
- Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O’Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
- Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
- Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
- Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
- Hacquard, S., Francis, M. M. . Advances in Botanical Research. 70, 109-142 (2014).
- Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
- Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092 (2013).
- Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081 (2014).
- Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
- Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
- Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
- Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
- Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
- Henry, R. J. . Plant genotyping II: SNP technology. , (2008).
- Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
- Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
- Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105 (2015).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
- Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470 (2014).
- Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).
