Summary
Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.
Abstract
Verstehen Membranprotein Handel, Montage und Ausdruck erfordert einen Ansatz, der zwischen die Personen mit Wohnsitz in intrazellulären Organellen und die lokalisierte auf der Plasmamembran unterscheidet. Traditionelle fluoreszenzbasierte Messungen fehlt die Fähigkeit Membranproteinen zu unterscheiden in unterschiedlichen Organellen befinden. Modernste Methoden überwinden traditionellen Methoden durch pH-sensitive Fluorophore mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) Kopplung. TIRF Beleuchtungs regt die Probe bis zu etwa 150 nm von der Glasprobe Schnittstelle, wodurch Hintergrund abnimmt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen und zu verbessern Auflösung. Das Anregungsvolumen in TIRFM umfasst die Plasmamembran und in der Nähe Organellen wie die periphere ER. Superecliptic pHluorin (SEP) ist ein pH-empfindliche Version von GFP. Genetisch September kodiert, in die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins von Interesse positioniert das Fluorophor aufdie luminale Seite des ER und in der extrazellulären Region der Zelle. SEP fluoreszierend, wenn der pH-Wert größer als 6 ist, sondern bleibt in einem Aus-Zustand bei niedrigeren pH-Werten. Daher Rezeptoren SEP fluoreszieren markiert, wenn in dem endoplasmatischen Reticulum (ER) oder beim Einführen in die Plasmamembran (PM) aufhalten, jedoch nicht, wenn sie einer Handel Vesikel oder andere Organellen wie der Golgi beschränkt. Die extrazelluläre pH kann eingestellt werden, um die Fluoreszenz von Rezeptoren auf der Plasmamembran zu diktieren. Der Unterschied in der Fluoreszenz zwischen TIRF Bilder bei neutralen und sauren extrazellulären pH-Wert für die gleiche Zelle entspricht einer relativen Anzahl von Rezeptoren auf der Plasmamembran. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Messung von intrazellulären und Plasmamembran-Rezeptoren resident. Single Vesikel Insertionsereignisse kann auch gemessen werden, wenn der extrazelluläre pH neutral ist, entsprechend einem niedrigen pH Handel Vesikel mit der Plasmamembran verschmelzen und in einen fluoreszierenden Zustand übergeht. Diese versatilE-Technik kann die Lokalisierung, Ausdruck und Handel von Membranproteinen zu untersuchen ausgenutzt werden.
Introduction
Veränderungen der Rezeptor - Expression, Verteilung und Anordnung haben zu einer Vielzahl von Krankheiten verbunden ist, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, zystischer Fibrose und Drogenabhängigkeit 1, 2, 3, 4, 5. Zum Beispiel beeinflussen Nikotin und andere Nikotinliganden des Handels mit nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) , was zu Veränderungen in Handel, Ausdruck und upregulation 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nikotin erhöht sich die Gesamtzahl der zusammengesetzten nAChRs innerhalb einer Zelle erhöht Handel in Richtung der Plasmamembran, eind ändert die Montage von Untereinheiten eine hohe Empfindlichkeit Version einiger Subtypen zu begünstigen. Beheben von deutlichen Veränderungen in Handel, Montage und Expression von Rezeptoren in einem Krankheitsmodell liefert wichtige mechanistische Details, die Droge wesentlich sind Ziele zu definieren. Ein idealer Ansatz würde zwischen intrazelluläre Rezeptoren und diejenigen, lokalisiert auf der Plasmamembran schnell unterscheiden. Dies ist besonders anspruchsvoll in Fällen, in denen eine Mehrheit eines bestimmten Proteins intrazellulär befindet, wie mit nAChRs. Da die Mehrheit der nAChR zum endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind, fehlt traditionelle Messungen die räumlich-zeitliche Auflösung erforderlich Lokalisierung und -handel Veränderungen entlang des sekretorischen Weg zu lokalisieren. Receptor Handel und Expressionsstudien von nAChR wurden in erster Linie durchgeführt unter Verwendung von Radioligand 11 Bindung, Biotinylierung Assays 12, Western - Blot - 13 oder Immunpräzipitation techniq ues 12. Diese sind abhängig von der Bindungsspezifität eines Reportermoleküls oder Fixierung der Zellen und fehlt die Fähigkeit, gleichzeitig zwischen Plasmamembran resident und intrazelluläre Rezeptoren unterscheiden. Daher haben Studien an Ionenkanalanordnung und Vesikel Dynamik weitgehend stützte sich auf niedrigem Durchsatz elektro Techniken 14.
Superior räumliche und zeitliche Auflösung ist möglich, mit den Fortschritten in der Fluoreszenzmikroskopie. Genetisch kodierte Reportermoleküle, wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) und dessen Varianten, unspezifische Bindung Probleme beseitigen und 15 Empfindlichkeit erhöhen. Eine pH - empfindliche Variante von GFP, wie superecliptic pHluorin (SEP) bekannt ist , kann verwendet werden , um inhärente Unterschiede zwischen pH Kompartimenten innerhalb einer Zelle auszunutzen Lokalisierungs 5, 7, 8, um zu bestimmen ,ref "> 9, 16, 17, 18. fluoresziert September , wenn der pH - Wert höher als 6 ist, aber bei niedrigeren pH - Wert in einem Aus - Zustand bleibt. Daher SEP markierten Rezeptoren auf ihrer luminalen Seite , wenn sie in das endoplasmatische Retikulum detektiert werden ( ER) oder beim Einführen in die Plasmamembran (PM), aber nicht, wenn sie einer Handel Vesikel eingeschlossen. Manipulation der extrazellulären pH in Kontakt mit Rezeptoren auf der Plasmamembran ändert folglich die Fluoreszenz und damit Nachweis dieser Rezeptoren. Wenn die gleiche Zelle sequentiell sowohl bei einem neutralen extrazellulären pH abgebildet wird und dann einen pH - Wert niedriger als 6 ist , die Differenz zwischen den Bildern an Rezeptoren auf der Plasmamembran zurückgeführt wird. Dies ermöglicht eine gleichzeitige Messung von intrazellulärem (peripheral ER) und Plasmamembran resident Rezeptoren 5, 7, 8 p>, 9. Einzelne Vesikel Insertion Ereignisse können auch aufgelöst werden, wenn der extrazellulären pH neutral ist. Wenn ein niedriger pH Handel Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt, wird der luminalen Seite des Vesikels in die neutrale extrazellulären Lösung ausgesetzt wird , einen Übergang als Burst von Fluoreszenz nachgewiesen verursacht 7, 18, 19, 20. September ermöglicht die Messung von Rezeptoren auf der Plasmamembran und peripheren endoplasmatischen Retikulum lokalisiert und stellt ein Mittel Handel von Rezeptoren zwischen diesen subzelluläre Bereiche 5 zu messen, 7, 18.
Um eine höhere Auflösung in der Plasmamembran zu erreichen, ein Rezeptor SEP genetisch kodiert wird durch innere Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) abgebildet. Dieses Verfahren ist insbesonderenützlich, wenn die Mehrheit der Rezeptoren an intrazelluläre Regionen lokalisiert, da TIRFM erhöht die Sichtbarkeit der Plasmamembran. TIRFM ermöglicht auch die Auflösung des Menschenhandels Dynamik einzelner Vesikel September-markierten Rezeptoren beim Einsetzen in die PM trägt. Eine innere Totalreflexion tritt mit unterschiedlichen Brechungsindizes an der Grenzfläche von Materialien, wie beispielsweise zwischen einer Zelle und einem Glasdeckglas 21, 22. September fluoresziert, wenn es mit 488 nm Anregung bestrahlt, die ausgerichtet ist, eine innere Totalreflexion an der Grenzfläche des Glases und Zelllösung zu erreichen. Dadurch ergibt sich eine abklingende Welle, die etwa 150 nm in die Probe eindringt, nur spannende Fluorophore innerhalb dieses Volumens. Nur September Rezeptoren in einem neutralen pH-Umgebung innerhalb dieses Bereichs von Anregungs werden enthaltenden detektiert, die denen entsprechen, auf der Plasmamembran oder peripheren endoplasmatischen Retikulum befinden. Da Erkennung begrenzt to Anregung durch die abklingende Welle, die Hintergrundfluoreszenz von der intrazellulären Region verringert und das Signal - Rausch - Verhältnis 21 erhöht, 22. Darüber hinaus, da Strahlung nicht den Großteil der Zelle nicht durchdringen, wird Lichtschäden minimiert die Bildgebung im Laufe der Zeit lebenden Zellen erlaubt. Als Ergebnis gekoppelt TIRFM mit genetisch kodierten September bietet die hohe Auflösung und Empfindlichkeit erforderlich subzelluläre Lokalisation und -handel Dynamik von Membranrezeptoren entlang des sekretorischen Weg zu messen.
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Protocol
1. Zellkultur und Transfektion
- Pflegen Maus Neuroblastom 2a (N2a) Zellen in Wachstumsmedien.
- Make 500 ml N2a Wachstumsmedien von 200 ml Dulbecco-Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose, 250 ml Serummedien reduziert, 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin / Streptomycin (100x).
- Pflegen Zellen in einem T75 - Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator.
- Split Zellen 01.15 bei Bedarf oder bei etwa 80-90% Konfluenz. Dies ist typischerweise 2-3 mal pro Woche.
- Mantel 35 mm Glasbodenschale mit Poly-D-Lysin.
- In einem Biosicherheitsschrank laminare Strömung, 200 ul 0,1 ug / ml Poly-D-Lysin auf Glasbodenbereich von sterilen 35-mm-Schale.
- Platzieren dish in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde.
- Spülen Sie vorsichtig Schale mit ddH 2 O 3-4 mal.
- Lassen Sie Gerichte völlig trocken für mehr als 1 Stunde.
- Sterilize Gerichte mit UV-Licht in der biologischen Sicherheit Kabinett, falls erforderlich.
- Platte N2a Zellen für TIRFM Bildgebung.
- Entfernen Wachstumsmedien von anhaftenden Zellen.
- Abzulösen Zellen aus dem Kolben durch Inkubation mit 1 ml 1x Trypsin (+ EDTA) für 5 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator.
- Inactivate Trypsin durch Zugabe von 9 ml Wachstumsmedium. Medien-Mix, Trypsin und abgelösten Zellen mit einer Pipette.
- Optisch zählen Zellen einer Zählkammer und berechnen Sie die richtige Volumen 90.000 Zellen zu jeder Poly-D-Lysin beschichtete Glasbodenschale hinzufügen verwenden. Diese Dichte ist für eine effiziente Transfektion und einzelne Zelle TIRF-Bildgebung erforderlich.
- 2 ml Wachstumsmedium zu jedem Glasbodenschale mit 90.000 Zellen.
- Inkubieren Sie die Schale bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 16-24 Std.
- N2a Transfektion
- Besorgen Sie sich ein Plasmidkonstrukt, enthaltend ein Fluorophor September aufgenommenin die extrazelluläre Region des Proteins von Interesse. Standard - Klonierungstechniken wie PCR - Amplifikation 5 kann das Konstrukt zu erzeugen , verwendet werden.
HINWEIS SEP sollte in die extrazelluläre Region des Membranproteins eingebracht werden, so dass es innerhalb des Lumens des endoplasmatischen Retikulums oder Handels Vesikel befindet, und wird an extrazelluläre Lösung ausgesetzt, wenn sie auf der Plasmamembran. SEP in Größe ähnlich GFP und ähnliche Klonierungsstrategien verwendet werden können. - Ersetzen den Wachstumsmedien auf plattierten Zellen mit 1,5 ml reduzierte Serum - Medien (zB Opti-MEM), etwa 30 min vor der Zugabe des Transfektionsreagenz.
ANMERKUNG: Um Medikament induzierte Veränderungen in Rezeptoren, eine geeignete Konzentration des Wirkstoffs kann zum Zeitpunkt der Transfektion hinzugefügt werden studieren. - In 500 ng jedes gewünschte Plasmidkonstrukt zu 250 & mgr; l reduziert Serum-Medien (Rohr 1).
- Fügen Sie 2 ul des Transfektionsreagenz in ein separates Röhrchen containing 250 ul reduziert Serum-Medien. Inkubieren Rohr 2 bei Raumtemperatur für 5 min. Das Verhältnis von Transfektionsreagenz der Plasmid-DNA sollte jedes Protein von Interesse zu exprimieren optimiert werden.
- Kombinieren Rohre 1 und 2, um eine Lösung herzustellen, die 500 ul Transfektionsreagenz und Plasmid-Mix. für 25 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie die 500 ul Transfektionsgemisch vorab plattierten Zellen für ein Gesamtvolumen von 2 ml pro Schale.
- Inkubiere Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 24 Stunden.
- Nach 24 Stunden Das Transfektionsgemisch zu entfernen und die Zellen mit Wachstumsmedium gespült und dann wurden 2 ml Wachstumsmedium zu jeder Schale hinzu.
HINWEIS: Wenn ein Medikament zum Zeitpunkt der Transfektion hinzugefügt wurde, kann es in diesem Schritt aufgefüllt wieder. - Inkubiere Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 24 Stunden.
- Bild-Zellen 48 Stunden nach der Transfektion.
- Besorgen Sie sich ein Plasmidkonstrukt, enthaltend ein Fluorophor September aufgenommenin die extrazelluläre Region des Proteins von Interesse. Standard - Klonierungstechniken wie PCR - Amplifikation 5 kann das Konstrukt zu erzeugen , verwendet werden.
2. Live Cell Imaging von Total Ininterne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM)
- Imaging einrichten
- Führen Bildgebung mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop Set-up mit einem Scantisch wie in Abbildung 1 dargestellt. Dies erfordert eine Ausrichtung eines 488 nm DPSS-Laserquelle, einen Schrittmotor 488 nm Strahlposition und eine hohe numerische Apertur (1,49 NA) 60X oder 100X -Ölimmersionsobjektiv einzustellen.
- Führen Sie den Laserstrahl durch den geeigneten Anregungsfilter (Band 488/10 nm). Richten des polarisierten Laserstrahl durch eine Einzelmodenfaser mit einem Abschuß verbunden montiert mit einem Schrittmotor. In Epifluoreszenz-Modus wird der Anregungsstrahl in der Mitte der hinteren Öffnung des Objektivs zentriert.
- Zu TIRF erreichen, verwenden, um die Schrittmotor den fokussierten Laserstrahl über die hinteren Apertur der Objektivlinse zu übertragen, bis der kritische Winkel erreicht wird und Strahl wird nicht mehr durch die Probe übertragen und stattdessen vollständig die Glas cel wegreflektiertl-Schnittstelle.
- Aufnehmen von Bildern ein EMCCD (512 x 512 Pixel) gesteuert mit Imaging - Software (zB Metamorph) mit dem entsprechenden Emissionsfilter montiert im Emissions Weg mit (525/50 nm).
- Bereiten Sie die Imaging - Lösung
- Bereiten 200 ml extrazelluläre Lösung (ECS) durch Mischen von 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES und 10 mM Glucose in ddH 2 O. Stammlösungen von NaCl, KCl, MgCl 2, und CaCl 2 kann im Voraus und in Kombination mit frischem HEPES und Glucose am Tag der Abbildungs hergestellt werden.
- Der pH-Wert einer Lösung, die 100 ml ECS auf pH 7,4. Passen Sie die restlichen 100 ml ECS zu einem pH-Wert von 5,4. Spülen Sie die Zellen, die mit 2 ml ECS (pH 7,4).
- 2 ml ECS (pH 7,4) zu den transfizierten Zellen vor der Bildgebung.
- Live - Cell - Imaging in TIRF
- Schalten Sie das gesamte System, including 488 nm Laser, Kamera, Übersetzungsstufe und Bildbearbeitungsprogramm. Focus der Epifluoreszenz Strahl und stellen Sie die Leistung auf etwa 1 mW am 60X Ziel.
- In Öl auf das Ziel und legen Sie eine Schale von transfizierten Zellen auf der Translationsstufe. Befestigen Sie die Schale an Ort und Stelle montiert mit Bühne, damit es nicht in Bezug auf die Bühne bewegt, so dass die Zellen mehrfach abgebildet werden.
- In Epifluoreszenz-Modus fokussieren Sie das Mikroskop und die fluoreszierenden, transfizierten Zellen zu lokalisieren. Die Zellen bleiben über mehrere Fokusebenen fokussiert. Suchen Sie einzelne, isolierte Zellen mit TIRF, um fortzufahren.
- Im Imaging-Programm, stellen Sie die Belichtungszeit auf 200 ms und die Optimierung der Fluoreszenzintensität durch die EM-Verstärkungseinstellung.
- Übergang des Laserstrahls in TIRF durch den Strahl über das Ziel in einer schrittweisen Art Übersetzen des Schrittmotors verwendet wird. Da der kritische Winkel nähert, wird der Strahl sichtbar über den Rand der Schale zu übersetzen, bis sie an th konvergierte Punkt der totalen inneren Reflexion an der Probenebene.
- Stellen Sie sicher, dass die Zellen in TIRF-Modus sind durch den Fokusknopf einstellen. In TIRF kann nur eine Ebene von Zellen (dh etwa 150 nm aus Glas - Schnittstelle) fokussiert werden, ein sehr scharfes Bild mit hoher Auflösung von der Plasmamembran.
- Imaging September subzelluläre Lokalisierung zu bestimmen
- Lokalisieren gesund, transfiziert, einzelne Zellen in der Abbildungsebene.
- Erwerben Sie ein scharfes Bild der Zelle bei pH 7,4. September markierten Rezeptoren auf der Plasmamembran und endoplasmatisches Retikulum sollte sichtbar sein.
- Schnell den Laserstrahl blockieren die Probe erreicht Photobleaching zu verhindern.
- Prägen Sie sich die Tischpositionen zu jeder Zelle entsprechende mehrere xy Stellen mit Mikroskop-Imaging-Software in der Lage, die Aufnahme.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1-2.4.4 für 20-30 Zellen pro Schale, während die Software die Position der einzelnen Zelle zu erfassen.
- After alle Zellbilder bei pH 7,4 gesammelt werden, manuell mit einer Pipette pH 7,4 ECS-Lösung zu entfernen. Berühren Sie das Gericht nicht, da dies die gespeicherten Tischpositionen bewegen konnte.
- Vorsichtig 2 ml pH 5,4 ECS in die Schale und 10 Minuten warten. Während dieser Zeit sparen zuvor aufgenommenen Bilder.
- Unter dem gleichen Satz an Bedingungen verwendet, um Bilder bei pH 7,4 zu sammeln, um die Bühne zu jeder gespeicherten Position zu bewegen und ein Bild der gleichen Zelle bei pH 5,4 erhalten. Die Zellen sollten weniger aussehen definiert, da alle erfassten Fluoreszenz von endoplasmatischen Retikulum September beschränkt Ursprung markiert Rezeptoren. Speichern Sie die pH 5,4 Zellbildern.
- Imaging einzelne Vesikel Insertion Ereignisse in lebenden Zellen
- Ersetzen Wachstumsmedien von Zellen, die mit 2 ml pH-Wert 7,4 ECS oder mit Leibovitz L-15-Medien. Der pH - Wert von Leibovitz L-15 Medium ist CO 2 unabhängig, so dass Abbildungs über einen langen Zeitraum bei Bedarf zu übernehmen.
- Place die Schale transfizierter Zellen auf der Bühne des Mikroskops. folgenden Schritt 2.3 Sichern und eine einzelne Zelle in TIRF konzentrieren.
- Falls vorhanden, stellen Sie den Autofokus, so wird der Fokus nicht über den Zeitraum der Bildgebung driften.
- Aufzeichnen einer Serie von 1000 Rahmen, kontinuierlich Bilder mit einer Bildrate von 200 msec zu erfassen. Bursts der Fluoreszenz wird während dieser Zeit, entsprechend niedrigem pH Handel Vesikel Verschmelzen mit der Plasmamembran, Belichten der SEP an die extrazelluläre pH 7,4 sichtbar.
- Einen weiteren Einzelzelle und wiederholen Sie den Schritt. Autofokus zurückgesetzt, falls erforderlich.
3. Bildanalyse und Datenverarbeitung
- Analyse September Fluoreszenz zu bestimmen subzelluläre Lokalisierung
- Öffnen Sie die Zelle Bilder mit einer Bildanalysesoftware wie Metamorph oder ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Ziehen Sie den Hintergrund von sowohl pH 5,4 und pH 7,4 Bilder, um die Rollkugel-Einstellung.
- Verwenden Sie eine Intensität basierend Fluoreszenzschwellen aus einer einzigen Zelle zu quantifizieren. Wählen Sie manuell eine Region von Interesse rund um die Zelle in dem pH-Wert 7,4 Bild.
- Messen Sie den Zellbereich, mittlere Intensität und integrierte Dichte unter Verwendung eines Plug-in ImageJ oder mit der in Funktion "Messen" unter der Registerkarte Analysieren gebaut.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1-3.1.3 für die gleiche Zelle bei pH 5,4, sorgfältig die Intensität basierend Schwelle und der Region von Interesse in der gleichen Art und Weise anpassen.
- Nachdem die integrierte Dichte für die Zell Bilder sowohl bei pH 7,4 und 5,4 erhalten wird, berechnet die Plasmamembran integriert Dichte durch den pH-Wert 5,4 Wert aus dem pH-Wert 7,4 subtrahiert wird. Die Differenz entspricht der relativen Anzahl Rezeptoren auf der Plasmamembran innerhalb der TIRF Anregungsbereich.
- Als Maß für Handel, die Berechnung der relativen Prozentsatz SEP Rezeptoren markiert auf der Plasmamembran liegt im Vergleich zu den restlichen Rezeptoren sichtbar in den TIRF excitatiauf Volumen, das durch die Plasmamembran integriert Dichte durch die gesamte integrierte Dichte bei pH 7,4, multipliziert mit 100 geteilt wird.
- Analyse einzelne Vesikel Einführungsveranstaltungen
- Öffnen Sie die Serie von 1000 TIFF-Bilder mit einer Bildanalysesoftware. Ziehen Sie den Hintergrund aus allen Rahmen, die die Rollkugel-Einstellung.
- Passen Sie die Farbbalance der Aufnahme intensiver Regionen zu maximieren entsprechenden Einführungsveranstaltungen Vesikel. Zählen Sie manuell die Ausbrüche von Fluoreszenz einer Dauer von mehr als 3 Bilder (> 600 ms).
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Representative Results
September Einbau in einen Rezeptor erlaubt den direkten Nachweis des Rezeptors in einer lebenden Zelle. Gekoppelt mit TIRFM ermöglicht dies die Bewertung der relativen Expressionsniveaus auf der Plasmamembran und der Verteilung von Rezeptoren innerhalb der subzellulären Orten im Bereich der TIRF Erregung. Einzelne Vesikeltransport Ereignisse können auch gelöst werden.
Relative Expression von September-markierten Rezeptoren auf Plasmamembran
September Fluoreszenz bei Anregung durch den pH-Wert der umgebenden Lösung bestimmt. Wenn SEP Plasmamembran resident Rezeptoren fusioniert ist, kann der extrazellulären pH manipuliert werden , um diese Fluoreszenz ein- oder ausschalten 5, 7, 8, 9, 17. Wenn the pH der extrazellulären Lösung eine physiologische 7,4, Rezeptoren sowohl von der Plasmamembran und dem endoplasmatischen Retikulum innerhalb des Bereichs der TIRF Anregungs fluoreszieren. Die extrazelluläre Lösung kann dann mit einer ansonsten identischen Lösung von pH 5,4 ausgetauscht werden. Dies bewirkt, dass die Plasmamembran resident September in einen Aus-Zustand übergehen, alle beobachteten Fluoreszenz bedeutet nun aus dem endoplasmatischen Retikulum ist. Figur 2 zeigt ein Beispiel sowohl auf pH 7,4 abzubildenden Zellen (A) und pH 5,4 (B). Die relative Zahl der Rezeptoren auf der Plasmamembran gegenüber dem peripheren endoplasmatischen Retikulum innerhalb des Bereichs der TIRF Anregung wird dann durch Subtrahieren der integrierten Dichte der Fluoreszenz bei pH 5,4 von der bei pH 7,4, dargestellt in 2C mathematisch berechnet. Diese berechnete Plasmamembran integrierte Dichte entspricht der relativen Anzahl SEP markierten Rezeptoren auf der Plasmamembran und innerhalb der TIRF Anregungs befindetVolumen. Da die Plasmamembran und in der Nähe Retikulum peripheren endoplasmatischen bevorzugt angeregt mit TIRF werden, sind diese subzelluläre Verteilung Vergleich zwischen Rezeptoren zu diesen Regionen lokalisiert und nicht die gesamte intrazelluläre Region der Zelle.
Subzelluläre Verteilung von September-markierten Receptors
Handel von Rezeptoren können zum endoplasmatischen Retikulum Vergleich auf der Plasmamembran lokalisiert durch den Vergleich des Verhältnisses zwischen Rezeptoren gemessen werden. Dividieren der Plasmamembran durch die gesamte integrierte Dichte bei pH integrierten Dichte 7,4, multipliziert mit 100, gibt einen relativen Prozentsatz SEP-markierten Rezeptoren auf der Plasmamembran 5 angeordnet, 7. Als Kontrolle werden A kann BREFELDIN zu Zellen gegeben intrazellulären Proteintransport zu stören. Wenn Brefeldin A vorhanden ist, nahezu alle der erfaßten receptors innerhalb des Bereichs der TIRF Anregung wird an das endoplasmatische Retikulum beschränkt werden, in einem unteren% PM führt. Zusätzlich mutiert (Δ508-I539T) cystic fibrosis transmembrane Regler (Δ508-I539T-CFTR) als Positivkontrolle verwendet werden. In Gegenwart von handelsüblichen VX-809, Δ508-I539T-CFTR-Expression auf der Zelloberfläche erhöht sich 2 bis 3-fache.
Einzel Vesicle Insertion Events
September nicht fluoreszieren oder Photobleichmittel nicht in dem niedrigen pH - Wert einer Transport Vesikel, sondern gewinnt Fluoreszenz bei Bestrahlung mit einem extrazellulären pH - Wert von 7,4 an der Plasmamembran 7, 16, 18. Insertion Ereignisse werden als Burst der Fluoreszenz an der Plasmamembran Dauer von mindestens 3 Rahmen (600 msec), entsprechend vollen Fusion des Transport Vesikel in die Plasmamembran sichtbar gemacht, wie in Abbildung 3 dargestellt. Vor einer Insertion (3B), ist keine wahrnehmbare Burst vorhanden. Eine Zunahme in der Fluoreszenzintensität als Transport gesehen Vesikel (3C) ankommt, durch die Membran diffundierende (3D - 3G), bis zum Einbau in die bulk Fluoreszenz der Zelle (3H - 3I).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der TIRF - Mikroskop. Diese TIRF-Setup verwendet eine 488 nm DPSS-Laser SEP Anregung Faser gekoppelt an einen Schrittmotor durch die Übersetzung des Strahls über der Rückseite Apertur des Objektivs den kritischen Winkel des Anregungsstrahls einzustellen. Die Zellen werden mit abgebildet, um eine 60X, 1,49 NA -Ölimmersionsobjektiv. Die Emission wird unter Verwendung einer Elektronen aus Ladeeinrichtung gekoppelt erkannt.files / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Expression und den Handel an der Plasmamembran. Eine N2a Zelle α3-Sep / β4-wt nAChRs bei pH 7,4 (A) zeigt Rezeptoren auf der Plasmamembran und endoplasmatisches Retikulum ausdrückt. Bei pH 5,4 (B), Rezeptoren auf der Plasmamembran nicht fluoreszieren, so dass nur das endoplasmatische Retikulum resident Rezeptoren sichtbar sind. Die Differenz zwischen integrierten Dichte bei pH 7,4 und pH 5,4 (C) entspricht Rezeptoren an der Plasmamembran lokalisiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Einzel Vesicle Insertionsereignis. Α3-Sep / β4-wt nAChRs mit einem extrazellulären pH eine N2a exprimierenden Zelle 7,4 in (A) gezeigt ist . Unmittelbar eine Insertion (B) vor, ist kein Platzen der Fluoreszenz sichtbar. A Handel Vesikel Durchführung September eintrifft (C) und SEP markierten Rezeptoren diffundieren durch die Plasmamembran (D - G), bis zu unterscheiden von zuvor eingesetzten Rezeptoren (H - I). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die pH - Empfindlichkeit SEP ermöglicht Rezeptoren auf der Plasmamembran wohn aus intrazellulären Rezeptoren im endoplasmatischen Retikulum zu unterscheiden, und es kann verwendet werden , um Einfügungs Ereignisse von Rezeptor-tragenden Vesikeln 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 zu lösen . Verschiedene Techniken einschließlich Oberflächen Biotinylierung und Ligand weit Ebenen zu messen Proteinoberfläche sind die Bindung verwendet. In einigen Fällen kann auch Western-Blots zwischen ER und PM resident Protein zu unterscheiden verwendet werden. Diese SEP basierte Technik ist komplementär zu herkömmlichen Messungen, ein schnelles Auslesen der Oberflächenexpression und die Fähigkeit, die Bereitstellung Verschiebungen in Protein auf der ER an die PM lokalisiert zu quantifizieren. Seit September ist genetisch in dem Protein von Interesse codiert, Probleme mit nonspesche Bindung werden eliminiert und die Empfindlichkeit erhöht wird. September erfährt 488 nm Anregung bei neutralem pH-Wert, aber unter sauren Bedingungen von pH <6 nicht erregt. Wenn der extrazelluläre pH - Wert 7,4 ist, Fluoreszenz wird für nAChRs gemessen im endoplasmatischen Retikulum und auf der Plasmamembran aufhalten, jedoch nicht für die in den niedrigeren pH sekretorische Vesikel oder Golgi (pH <6) 23. Während der Bilderzeugung 7.4 der ECS von pH-Wert wird für eine ansonsten identische Lösung bei pH 5,4 ausgetauscht. Die Differenz zwischen der integrierten Dichte in diesen Bildern ist die Plasmamembran integriert Dichte einer Zelle. Dividieren dieser Zahl durch die gesamte integrierte Dichte innerhalb des Bereichs der TIRF - Anregung bei pH 7,4, multipliziert mit 100 ergibt den prozentualen Anteil an der Plasmamembran 5, 7, 8, 9. Während diese Studien TIRFM verwendet, können ähnliche Tests unter Verwendung von Auflicht-Fluoreszenz durchgeführt werden.Für Membranrezeptoren wie nAChR, wo eine Mehrheit der Rezeptoren in der ER befinden, ist TIRM ideal, weil der schmale Anregungsvolumen den Anteil des sichtbaren PM resident-Rezeptoren im Vergleich zu intrazelluläre Rezeptoren erhöht. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Assays zu Verschiebungen in der Rezeptorverteilung zwischen Organellen. Für Proteine mit einer höheren Expressionsniveaus auf dem PM, epi-Fluoreszenz basierten September Studien sind ausreichend Änderungen in Rezeptor-Expression zu messen. einzelne Vesikel Einführungsveranstaltungen, die außerdem bei pH-Wert gemessen werden 7,4 erfordern TIRFM. Das Platzen der Fluoreszenz auf den niedrigen pH Handel Vesikel entsprechend mit dem höheren pH Plasmamembran verschmelzen, während leicht in TIRFM gesehen wird typischerweise nicht in Auflicht-Fluoreszenz erkennbar.
Die Einbeziehung September mit TIRF Imaging Bedingungen
September können genetisch in die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins eingebracht werden. Aufgrund der Größe und Lage SEP ist es entscheidend, zu verif y, die das modifizierte Protein nicht wesentlich in Handel oder Funktion von einem Wildtyp-Protein unterscheidet. Assays sollten unter Verwendung durchgeführt werden, die SEP Protein markiert daß ein Einbau des Etiketts zu überprüfen, die Aktivität nicht stören. Für Ionenkanäle, Elektrophysiologie und Ionenpermeabilitätsmessungen sind ideal, während für andere Rezeptoren fluoreszierenden Ligandenbindung und Western-Blot verwendet werden Handel zu überprüfen. Adhärente Zellen eignen sich ideal für die Transfektion mit kommerziellen Transfektionsreagenzien und Bildgebung mit TIRFM geeignet, da sie direkt mit dem Glasbodenschale befestigen. Diese Befestigung ist notwendig, TIRF Anregung durch die abklingende Welle innerhalb von etwa 150 nm aus dem Glas-Probe-Schnittstelle zu gewährleisten. Um eine hohe Auflösung TIRF Bilder zu erreichen, muss die Probe während der Abbildung 21 flach zu bleiben. Poly-D-Lysin-Beschichtung ist von Vorteil, wenn N2a Zellen Bildgebung, weil es eine Anlage Matrix bereitstellt, die Zellbewegungen minimiert eine ebene Fläche zu erhaltenlass = "xref"> 7. Die Plattierung Zelldichte muss optimiert werden, um Zellen zu gewährleisten, sind auf der Glasschale isoliert TIRF zu erreichen. Zellklumpen behindert totale interne Reflexion durch flache Zellhaftung in einer einzigen optischen Ebene zu verhindern. Da nur eine Ebene in TIRF fokussiert ist, ist von entscheidender Bedeutung richtige Zellmorphologie Aufrechterhaltung für die Bildgebung. Dies ist besonders wichtig, wenn die Lösungen in der SEP Studien ausgetauscht werden. Zur Minimierung der morphologischen Veränderungen, Bilder bei pH 7,4 und pH 5,4 benötigen, um schnell gesammelt werden. Zusätzlich wird schließlich intrazellulären Membranen permeieren die ECS (pH 5,4), Organell Struktur und Fluoreszenz von internen SEP markierten Rezeptoren zu verändern. Dies wird leicht vermieden, indem Bilder unter jedem pH Zustand innerhalb weniger Minuten zu sammeln. Daten aus mehreren Speisen in der gleichen Bildgebungssitzung können kombiniert werden, um die Anzahl der analysierten Zellen zu erhöhen. Wenn Lösungen ändern, entfernen Sie vorsichtig den pH-Wert 7,4 ECS-Lösung mit einer Pipette und fügen pH 5,4 ECS tropfenweise in ter Gericht. Das Entfernen oder Hinzufügen Lösung zu schnell die Zellen strapazieren können oder die Schale in Bezug auf die gespeicherten Tischpositionen zu bewegen. Ein Perfusionssystem zum Austausch von Lösungen können auch solange die Lösungsaustausch abgeschlossen und tritt schnell genutzt werden. Genaue Salzkonzentrationen in jeder Lösung erforderlich Zelle Verzerrungen zu minimieren. Eine Bühne Top-Inkubator kann eingebaut werden, um Schwankungen in der Temperatur zu reduzieren, während die Abbildung.
TIRF Imaging
TIRF Bildgebung reduziert Hintergrundfluoreszenz durch auf einer einzigen optischen Ebene konzentriert. Dies erhöht das Signal - Rausch - Verhältnis durch selektives spannende Fluorophore innerhalb von etwa 150 nm von der Glasprobe Schnittstelle 21, 22. Innerhalb dieses Bereichs wird die Auflösung stark erhöht, insbesondere bei der Plasmamembran. Dies ist notwendig, wenn eine Mehrheit von Rezeptoren intrazellulär befinden. Wenn ein hoher Anteil an Membranrezeptoren istbefindet sich an der Plasmamembran dieser basierten Ansatz September können subzelluläre Lokalisierung in Epifluoreszenz zu bestimmen, verwendet werden. Wenn jedoch ein kleiner Prozentsatz der Gesamt Rezeptoren an der Plasmamembran gehandelt werden, wie bei nAChRs ist TIRFM erforderlichen pH abhängige Veränderungen in der Fluoreszenz an der Plasmamembran zu quantifizieren. Außerdem ermöglicht TIRFM die Auflösung einzelner Vesikeltransport Ereignisse und die Verteilung der Rezeptoren innerhalb des sekretorischen Weg. Eine grundlegende TIRF Einrichtung verwendet ein 488 nm DPSS-Laser SEP Anregung Faser gekoppelt an einen Schrittmotor den kritischen Winkel des Anregungsstrahls einzustellen. Zu erreichen TIR wird der Strahl seitlich über die hinteren Apertur des Objektivs setzten, bis eine kritische Winkel erreicht wird. Die Zellen werden unter Verwendung eines 60X oder 100X abgebildet, 1,49 NA -Ölimmersionsobjektiv. Eine numerische Apertur größer als der Brechungsindex der Probe (> 1,38 für Zellen) erforderlich, um den kritischen Winkel für TIRF erforderlich zu erreichen. Ein 1,45 NA Ziel würde genügen, aber 1,49NA ist praktischer, wenn der Winkel der Erregung zu manipulieren. Emission wird unter Verwendung eines Elektronen-Multiplikationsladungsgekoppelte Vorrichtung (EMCCD) mit einem 8 mm-Array von 512 x 512 Pixeln detektiert. Mit Hilfe eines 60X Ziel können mehrere isolierte Zellen innerhalb eines Sichtfeld erfasst werden.
Einer der Hauptnachteile basierte Studien der Proteinexpression zu Fluoreszenz Photobleaching 15. Diese Anregung Zersetzung des Fluorophors führt zu einer irreversiblen Abnahme der Fluoreszenzintensität über die Zeit induziert. Aus diesem Grund setzt erfolgreiche Bildgebung auf einem empfindlichen Gleichgewicht zwischen der Intensität des Strahls von Anregung und On-Chip-Verstärkung innerhalb des EMCCD verwendet. Die Anregungsintensität muss hoch genug sein, einen Fluorophor zur Detektion zu erregen, aber nicht so hoch, wie das Molekül schnell photobleach. Kameraverstärkung kann verwendet werden, um das Signal für die Erkennung zu multiplizieren, wie zur Erhöhung der Anregungsintensität entgegengesetzt, aber dies erhöht auch Hintergrund intensity. Außerdem muss darauf geachtet werden, wenn die EM-Gain-Einstellungen wählen, die Sättigung der Bilder zu vermeiden. In zwischen den Messungen, die Blockierung der Anregung mit einem Strahl, bevor er die Probe Photobleichens minimiert erreicht. Dies ist erforderlich, wenn bei einem ECS von pH 7,4 Zelle Sammeln von Bildern auf 5,4 pH zu vergleichen. die zwischen den beiden Bildern Photobleaching ist ununterscheidbar von einem Mangel an Fluoreszenz aufgrund von pH-Änderung, so muss dieser Effekt minimiert werden. Pflege sollte eine niedrige Laserleistung genommen werden zu verwenden und die Zelle nur für die Dauer aussetzen notwendig, um die gewünschten Bilder zu erfassen. Für jedes Experiment kann ein Satz von Zellen bei pH 7 unter identischen Abbildungsbedingungen als Kontrolle gemessen werden. kein Intervall verwenden und für eine Dauer ausgesetzt wird, die Belichtungszeit zur Durchführung des Assays benötigt Anpassungs liefert ein Steuer das Ausmaß der Photobleaching zu bestimmen. Wenn Photobleaching größer als 10% der ursprünglichen Intensität ist, kann eine Korrekturkurve aus der beobachteten Photobleaching Ratte verwendet werdene durch eine Zeitspur der Fluoreszenzintensität zu sammeln. Für einzelne Vesikel Insertionsereignisse SEP-markierten Rezeptoren in Vesikeln Handel sind, bis die Fusion mit der Plasmamembran nicht aufgeregt, weil entweder der pH-Wert einen Aus-Zustand diktiert oder sie sind außerhalb der TIRF Bereich der Anregung. Daher markiert September Rezeptoren nicht bis Insertion, so dass höhere Anregungsleistung um einzelne September Moleküle nachzuweisen verwendet werden photobleach wird.
Zusammenfassend kann diese Technik mit einer Vielzahl von adhärenten Zelltypen verwendet werden. September kann in praktisch jede Membranprotein eingearbeitet werden, solange die Proteinfunktion und Handel Eigenschaften beibehalten werden. TIRF verbessert die Auflösung an der Plasmamembran. September ermöglicht die Differenzierung von markierten Proteine auf der Plasmamembran von denjenigen im peripheren endoplasmatischen Retikulum entfernt.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
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