Summary
Пометка внеклеточный домен мембранного белка с рН-чувствительного флуорофора, superecliptic pHluorin (SEP), позволяет внутриклеточной локализации, выражение, и незаконный оборот подлежит определению. Визуализации SEP-меченых белков с полным внутренним отражением флуоресцентной микроскопии (TIRFM) позволяет количественно оценить уровни белка в периферической ER и плазматической мембраны.
Abstract
Понимание мембраны незаконный оборот белков, сборка и выражение требует такого подхода, который проводит различие между теми, кто живет в внутриклеточных органелл и те, локализованные на плазматической мембране. Традиционные измерения флуоресценции на основе не имеют способность различать мембранных белков, проживающих в разных органеллах. Режущий край методологии выходят за рамки традиционных методов путем сочетания рН-чувствительных флуорофоров с общей микроскопии внутреннее отражение флуоресценции (TIRFM). TIRF освещение возбуждает образец до примерно 150 нм от поверхности раздела стекла и образца, что приводит к снижению фона, увеличивая отношение сигнала к шуму, и повышение разрешения. Объем возбуждения в TIRFM включает плазматическую мембрану и близлежащие органеллы, такие как периферийное ER. Superecliptic pHluorin (SEP) является рН чувствительной версия GFP. Генетически кодирующий SEP в внеклеточный домен мембранного белка, представляющего интерес позиционирует флуорофор наполостную сторона ER и во внеклеточной области клетки. СВП флуоресцентный при рН больше 6, но остается в выключенном состоянии при более низких значениях рН. Таким образом, рецепторы с тэгом SEP флуоресцировать, когда они проживали в эндоплазматический ретикулум (ER) или при введении в плазматической мембране (ПМ), но не тогда, когда ограничивается везикулы людьми или других органеллах, таких как Гольджи. Внеклеточный рН можно регулировать, чтобы диктовать флуоресценцию рецепторов на плазматической мембране. Различие в флуоресценции между TIRF изображений в нейтральной и кислой внеклеточный рН в той же самой клетке соответствует относительному числу рецепторов на плазматической мембране. Это позволяет одновременное измерение внутриклеточной и плазменных мембранных рецепторов резидентов. Одно вставки пузырек события также могут быть измерены, когда внеклеточный рН нейтральна, что соответствует низким везикулы оборота рН сплавленных с плазматической мембраной и перехода в флуоресцентное состояние. Это Versatilе метод может быть использован для изучения локализации, экспрессии и торговлей мембранных белков.
Introduction
Изменения в экспрессии рецепторов, распределения и сборки были связаны с широким спектром заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, кистозного фиброза и наркомании 1, 2, 3, 4, 5. Например, никотин и другие никотиновые лиганды влияют на торговлю никотиновых рецепторов ацетилхолина (nAChRs) , что приводит к изменениям в области незаконного оборота, выражения и повышающей регуляцией 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Никотин увеличивает общее количество собранных nAChRs внутри клетки, повышает оборотом к плазматической мембране, А.Н.d изменяет сборку субъединиц в пользу высокой чувствительности версии некоторых подтипов. Решение различных изменений в области незаконного оборота, собраний и экспрессии рецепторов в модели болезни обеспечивает важные механистические детали, которые необходимы для определения целевых наркотиков. Идеальный подход позволил бы быстро проводить различие между внутриклеточными рецепторами и те, локализованный на плазматической мембране. Это особенно сложно в тех случаях, когда большинство конкретного белка проживает внутриклеточно, например, с помощью nAChRs. Поскольку большинство nAChRs локализованы в эндоплазматической сети, традиционные измерения не имеют пространственно-временное разрешение, необходимое для локализации точно определить и незаконного оборота изменений вдоль секреторного пути. Исследования торговли людьми Рецептор и экспрессия nAChRs были в первую очередь были проведены с использованием связывания радиолиганда 11, биотинилирования анализы 12, Вестерн - блоттинга 13 или иммунопреципитация Techniq 12 жает. Это зависит от специфичности связывания с молекулой-репортером или фиксации клеток и не имеют возможности одновременно различать между жителем плазматической мембраны и внутриклеточных рецепторов. Таким образом, исследования сборки ионных каналов и везикул динамика во многом полагались на низкой пропускной способности электрофизиологических методов 14.
Улучшенный пространственное и временное разрешение можно с прогрессом в области флуоресцентной микроскопии. Генетически кодируемые репортерные молекулы, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его вариантов, устранить неспецифическое связывание проблем и повышения чувствительности 15. РН - чувствительного вариант GFP, известный как superecliptic pHluorin (SEP), могут быть использованы , чтобы использовать врожденные различия рН между отсеками внутри ячейки , чтобы определить локализацию 5, 7, 8,Ссылка "> 9, 16, 17, 18. сентября флуоресцирует при рН выше 6, но остается в выключенном состоянии при более низком рН. Таким образом, рецепторы с тэгом SEP на их полостной стороне обнаруживаются , когда присутствует в эндоплазматический ретикулум ( ER), или при введении в плазматической мембране (ПМ), но не тогда, когда прикован к пузырьку оборота. манипуляции с внеклеточным рН в контакте с рецепторами на плазматической мембране, следовательно, приводит к изменению флуоресценции и, следовательно, обнаружение этих рецепторов. Если в той же клетке последовательно изображается как при нейтральном внеклеточного рН , а затем рН ниже 6, разница между изображениями приписывается рецепторы , расположенные на плазматической мембране. Это позволяет одновременное измерение внутриклеточной (периферический ER) и рецепторов мембранного резидентные плазмы 5, 7, 8 р>, 9. Single вставки пузырек события также могут быть разрешены, когда внеклеточный рН является нейтральным. После того, как низкий везикул оборот рН сливается с плазматической мембраной, полостную часть везикулы подвергается нейтральной внеклеточный раствор, вызывая переход детектируется как взрыв флуоресценции 7, 18, 19, 20. Сентябрем позволяет измерять рецепторами , локализованными на плазменной мембране и периферической эндоплазматической сети, а также предоставляет средства для измерения оборота рецепторов между этими субклеточных областей 5, 7, 18.
Для достижения более высокого разрешения на мембране, рецептор с SEP генетически закодированы визуализируется с помощью полного внутреннего отражения микроскопии (цветения TIRFM). Этот метод особеннополезно, если большинство рецепторов локализованы в внутриклеточных областей, так как TIRFM увеличивает видимость плазматической мембраны. TIRFM также позволяет разрешение динамики незаконного оборота одиночных везикул, несущих SEP-меченых рецепторов при введении в ПМ. Полное внутреннее отражение происходит на границе раздела материалов с различными показателями преломления, например, между клеткой и стеклянной крышкой скольжения 21, 22. Сентября флуоресцирует при облучении 488 нм возбуждение, которое ориентировано на достижение полного внутреннего отражения на границе раздела стекла и клеточного раствора. Это производит мимолетную волну, которая проникает примерно 150 нм в образце, только возбуждающих флуорофоров в пределах этого объема. Только Сентябрю рецепторов, содержащих в нейтральной среде рН в указанном диапазоне возбуждения обнаружены, соответствующие тем, которые постоянно находящиеся на плазматической мембране или периферической эндоплазматический ретикулум. Поскольку обнаружение ограничено то возбуждении затухающих волн, фоновой флуоресценции из внутриклеточного области уменьшается , а соотношение сигнал - шум увеличивается 21, 22. Кроме того, поскольку излучение не проникает большую часть клетки, фотоповреждение сведено к минимуму, что позволяет получение изображений живых клеток по сравнению с течением времени. В результате, TIRFM в сочетании с генетически кодируемых Сентябрю обеспечивает высокое разрешение и чувствительность, необходимую для измерения внутриклеточную локализацию и торговлей динамики мембранных рецепторов вдоль секреторного пути.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток и трансфекция
- Поддержание мыши нейробластомы 2a (n2a) клеток в среде для роста.
- Сделать 500 мл n2a питательной среды от 200 мл среды Дульбекко Eagle (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, 250 мл сыворотки снижается носитель, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), и 5 мл пенициллина / стрептомицина (100х).
- Поддержание клеток в Т75 колбы при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе.
- Разделенные клетки 1:15, когда это необходимо, или примерно 80-90% сплошности. Это, как правило, 2-3 раза в неделю.
- Пальто 35 мм со стеклянным дном блюдо с поли-D-лизина.
- В кабинете биологической безопасности ламинарного потока, добавляют 200 мкл 0,1 мкг / мл поли-D-лизина на стеклянным дном области стерильного 35 мм блюдо.
- Поместите блюдо в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
- Тщательно ополосните блюдо с DDH 2 O 3-4 раза.
- Разрешить блюда полностью высохнуть в течение более 1 ч.
- SterilИзе блюда с использованием УФ-света в кабинете биологической безопасности в случае необходимости.
- Пластина клеток n2a для визуализации TIRFM.
- Удалить питательной среды из прикрепленных клеток.
- Отделить клеток из колбы путем инкубирования с 1 мл 1х трипсина (+ ЭДТА) в течение 5 мин при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе.
- Деактивировать трипсина путем добавления 9 мл среды роста. Смешайте СМИ, трипсин и обособленные клетки с помощью пипетки.
- Визуально подсчет клеток с использованием гемоцитометра и вычислить правильный том, чтобы добавить 90000 клеток в каждую поли-D-лизин стекла с покрытием нижней тарелки. Эта плотность необходима для эффективной трансфекции и одной ячейки TIRF визуализации.
- Добавляют 2 мл среды роста для каждого стеклянным дном блюдо с 90000 клеток.
- Инкубируйте блюдо при температуре 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе в течение 16-24 часов.
- n2a трансфекция
- Получают плазмиду, содержащую конструкцию флуорофор SEP включеныво внеклеточную область белка, представляющего интерес. Стандартные методы клонирования , такие как ПЦР - амплификации 5 может быть использован для создания конструкции.
Примечание: Сентябрем должны быть включены во внеклеточную область белка мембраны таким образом, что он находится в просвете эндоплазматического ретикулума или торговли везикул и подвергается воздействию внеклеточного раствора, когда на плазматической мембране. СВП аналогичные по размеру и GFP-подобные стратегии клонирования могут быть использованы. - Заменить культуральную среду на посеянных клеток с 1,5 мл сыворотки пониженным носителей (например, OPTI-MEM), примерно 30 мин перед добавлением реагента для трансфекции.
Примечание: Для изучения наркотиков индуцированных изменений в рецепторах, в соответствующей концентрации лекарственного средства могут быть добавлены во время трансфекции. - Добавить 500 нг каждой целевой плазмиды построить к 250 мкл восстановленного сыворотки носителя (трубка 1).
- Добавляют 2 мкл реагента для трансфекции в отдельную пробирку Containing 250 мкл восстановленного сыворотки сред. Выдержите трубки 2 при комнатной температуре в течение 5 мин. Отношение реагента к трансфекции плазмидной ДНК, должны быть оптимизированы, чтобы выразить каждый белок, представляющий интерес.
- Комбинат труб 1 и 2, чтобы сделать раствор, содержащий 500 мкл трансфекции реагента и плазмиды смеси. Инкубируют при комнатной температуре в течение 25 мин.
- Добавляют 500 мкл трансфекция строительные смеси предварительно высевания клеток общим объемом 2 мл на чашку.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе в течение 24 часов.
- Через 24 часа снимите смесь для трансфекции и промойте клетки с питательной среды, а затем добавляют 2 мл питательной среды в каждую чашку.
Примечание: Если препарат был добавлен в момент трансфекции, он может быть пополнен снова на этом шаге. - Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе в течение 24 часов.
- Клетки Image 48 ч после трансфекции.
- Получают плазмиду, содержащую конструкцию флуорофор SEP включеныво внеклеточную область белка, представляющего интерес. Стандартные методы клонирования , такие как ПЦР - амплификации 5 может быть использован для создания конструкции.
2. Живая съемка Cell на Всего ввнутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM)
- Обработки изображений создана
- Выполните визуализацию с перевернутой флуоресцентного микроскопа настройка с помощью стадии сканирования , как показано на рисунке 1. Для этого требуется выравнивание DPSS лазерного источника 488 нм, шаговым двигателем для регулировки положения луча 488 нм и высокой числовой апертуры (1,49 NA) 60X или 100X масло погружения объективное.
- Пропускают лазерный луч через соответствующий фильтр возбуждения (полосовой 488/10 нм). Выравнивание поляризованный лазерный луч через одномодового волокна, соединенного с пусковой установки, установленной на шаговый двигатель. В режиме эпифлуоресцентной, луч возбуждения центрирована в середине задней отверстия объектива.
- Для достижения TIRF, использовать шаговый двигатель, чтобы перевести сфокусированного лазерного луча через заднюю апертуру объектива, пока критический угол не будет достигнут, и луч больше не передается через образец и вместо того, чтобы полностью отражается от стекла-Целл интерфейс.
- Захват изображения с помощью EMCCD (512 х 512 пикселей) , управляемый с программным обеспечением визуализации (например , Metamorph) с соответствующим фильтром выбросов , установленный в пути эмиссии (525/50 нм).
- Приготовьте раствор изображения
- Приготовьте 200 мл раствора внеклеточный (ECS) путем смешивания 150 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES и 10 мМ глюкозы в DDH 2 O. растворы запаса NaCl, KCl, MgCl 2, и CaCl 2 , могут быть подготовлены заранее , и в сочетании со свежими HEPES и глюкозу в день визуализации.
- Доводят рН раствора, содержащего 100 мл ECS до рН 7,4. Отрегулировать оставшиеся 100 мл ECS до рН 5,4. Промыть трансфектированных клеток с помощью 2 мл ECS (рН 7,4).
- Добавляют 2 мл ECS (рН 7,4) до трансфицированных клеток перед тем визуализации.
- Живая клетка изображений в TIRF
- Включите всю систему, includinг 488 нм лазер, камера, этап перевода, и программа формирования изображения. Фокус эпифлуоресцентной луч и регулировать мощность около 1 мВт на цели 60X.
- Добавьте масло к цели и поместить блюдо из трансфицированных клеток на стадии перевода. Закрепите антенну на месте с помощью крепления, чтобы убедиться в его не перемещается по отношению к сцене, так что клетки могут быть отображены несколько раз.
- В режиме эпифлуоресцентной, фокус микроскопа и найти флуоресцентные, трансфицированные клетки. Клетки будут оставаться сосредоточенными на нескольких фокальных плоскостях. Найдите одиночные, изолированные клетки продолжиться с TIRF.
- В программе обработки изображений, установить время экспозиции до 200 мс и оптимизировать интенсивность флуоресценции, установив коэффициент усиления EM.
- Переход лазерный луч в TIRF, переводя луч через цели ступенчато с помощью шагового двигателя. Поскольку критический угол подходов, луч будет заметно переводить через край тарелки, пока не сходится в гое точка полного внутреннего отражения на плоскости образца.
- Убедитесь в том, что клетки находятся в режиме TIRF, регулируя ручку фокусировки. В TIRF, только одна плоскость клеток может быть сфокусирован (т.е. примерно 150 нм из стекла интерфейса), создавая очень определенное изображение с высоким разрешением плазменной мембраны.
- Визуализации сентября , чтобы определить внутриклеточную локализацию
- Найдите здоровые, трансфицированные, единичные клетки в плоскости изображения.
- Приобретают сфокусированное изображение ячейки при рН 7,4. Сентябре меченый рецепторов на плазматической мембране и эндоплазматической сети должны быть видны.
- Быстро блокирует лазерный луч от достижения образца, чтобы предотвратить фотообесцвечивания.
- Запоминание позиции стадии, соответствующие каждой ячейке с помощью программного обеспечения визуализации микроскопа, способного записывать несколько местоположений ху.
- Повторите шаги 2.4.1-2.4.4 для 20-30 клеток на чашку при использовании программного обеспечения для записи положение каждой ячейки.
- Мтер все изображения клеток при рН 7,4 собирают вручную удалить раствор рН 7,4 ECS с помощью пипетки. Не прикасайтесь к блюдо, так как это может привести к смещению запоминаемые позиции стадии.
- Осторожно добавьте 2 мл рН 5,4 ECS на блюдо и подождать 10 минут. В течение этого времени, за исключением ранее полученных изображений.
- В соответствии с идентичным набором условий, используемых для сбора изображений при рН 7,4, переместить стадию в каждой сохраненной позиции и получить изображение той же самой клетке при рН 5,4. Клетки должны выглядеть менее четкими, поскольку все обнаруженные флуоресценции, происходящих из эндоплазматической сети ограниченного Сентябре меченый рецепторов. Сохранение изображений клеток рН 5,4.
- Визуализации одиночные вставки пузырек события в живых клетках
- Заменить роста средств массовой трансфекции клеток с 2 мл рН 7,4 ECS или с L-15 средств массовой информации Лейбовиц. Значение рН Лейбовиц L-15 средств массовой информации представляет собой СО 2 независимыми, что позволяет визуализации иметь место в течение длительного периода времени , если это необходимо.
- Placе блюдо трансфицированных клеток на стадии микроскопа. Безопасный и фокус одну ячейку в TIRF следующем шаге 2.3 выше.
- Если есть, установите автофокус поэтому фокус не дрейфовать в течение периода визуализации.
- Запись серии 1000 кадров, непрерывно захвата изображений с частотой кадров 200 мс. Всплески флуоресценции будет виден в течение этого времени, что соответствует низким везикул оборотом рН сплавленных с плазматической мембраной, подвергая SEP с внеклеточной рН 7,4.
- Найдите другую одну ячейку и повторите описанные выше действия. При необходимости сброса автофокусировку.
3. Анализ изображений и обработка данных
- Анализ SEP флуоресценции для определения внутриклеточную локализацию
- Открыть изображения клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображений, таких как Metamorph или ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj). Вычтите фон от обоих рН 5,4 и рН 7,4 с помощью изображений подвижного настройки шара.
- Использовать порог на основании интенсивности для количественного определения флуоресценции из одной клетки. Вручную выбрать интересующую область вокруг ячейки в рН 7,4 изображения.
- Измерьте площадь ячейки, средняя интенсивность, и интегральная плотность, используя плагин в ImageJ или с помощью встроенной функции "Измерение" на вкладке Analyze.
- Повторите шаги 3.1.1-3.1.3 для той же самой клетке при рН 5,4, тщательно регулируя порог на основании интенсивности и области, представляющей интерес таким же образом.
- После того, как интегральная плотность достигается для изображений клеток в обоих рН 7,4 и 5,4, вычислить плазматическую мембрану интегральной плотности путем вычитания значения рН 5,4 с 7,4 значения рН. Различие соответствует относительному числу рецепторов на плазматической мембране в области TIRF возбуждения.
- В качестве меры торговли, рассчитать относительный процент SEP меченый рецепторов, расположенных на мембране плазмы по сравнению с остальными рецепторами видимых в TIRF excitatiпо объему путем деления плазматическую мембрану интегральной плотности от общей интегральной плотности при рН 7,4, умноженное на 100.
- Анализ одного везикул вставки события
- Открыть серию 1000 TIFF изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Вычтите фон от всех кадров с использованием подвижного установки шара.
- Отрегулируйте цветовой баланс записи максимально интенсивные области, соответствующие везикулы вставки события. Вручную рассчитывать всплески флуоресценции длительностью более 3 кадра (> 600 мс).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сентябре включение в рецептор обеспечивает прямое обнаружение этого рецептора в живой клетке. В сочетании с TIRFM, это позволяет оценить относительные уровни экспрессии на плазматической мембране и распределение рецепторов в субклеточных местах в области TIRF возбуждения. Одиночные события с торговлей людьми пузырек также могут быть решены.
Относительном выражении уровни SEP-меченых рецепторам плазматической мембраны
Сентябрем флуоресценции при возбуждении продиктована рН окружающего раствора. Когда СВП слит с рецепторами плазматической мембраны резидентных, внеклеточный рН можно манипулировать , чтобы превратить эту флуоресценцию или выключение 5, 7, 8, 9, 17. Когдае рН внеклеточный раствор представляет собой физиологический 7,4, рецепторы как из плазматической мембраны и эндоплазматического ретикулума в пределах области TIRF флуоресцируют возбуждения. Внеклеточный раствор затем может быть обменена с другого идентичного раствора рН 5,4. Это приводит к тому, мембранный резидентно в плазме сентября для перехода в выключенное состояние, то есть все наблюдаемые флуоресценция теперь из эндоплазматического ретикулума. На рисунке 2 показан пример клеток изображаемых на обоих рН 7,4 (А) и рН 5,4 (В). Относительное число рецепторов на плазматической мембране по сравнению с периферической эндоплазматической сети в пределах области TIRF возбуждения затем вычисляется математически путем вычитания интегральной плотности флуоресценции при рН 5,4 с , что при рН 7,4, представленной на фиг.2С. Эта расчетная плазмалеммы интегральная плотность соответствует относительному числу SEP-меченых рецепторов, расположенных на плазматической мембране и в пределах TIRF возбужденияобъем. Поскольку плазма мембраны и рядом периферических эндоплазматической сети в настоящее время возбуждал преимущественно с TIRF, это субклеточная сравнение распределения между рецепторами, локализованными в этих регионах, а не весь внутриклеточная область клетки.
Субклеточная Распределение SEP-меченых Рецепторы
Оборот рецепторов может быть измерена путем сравнения отношения между рецепторами, расположенными на плазматической мембране по сравнению с эндоплазматического ретикулума. Разделив плазматическую мембрану интегральной плотности по общей интегральной плотности при рН 7,4, умноженное на 100, дает относительный процент SEP-меченых рецепторов , расположенных на плазматической мембране 5, 7. В качестве контроля, брефелдин А может быть добавлено к клеткам, чтобы нарушить внутриклеточные перемещения белков. Когда брефелдин А присутствует практически все обнаруженного Receptors в пределах области TIRF возбуждения будет приурочено к эндоплазматической сети, что приводит к снижению% ПМ. Кроме того, мутированный (Δ508-I539T) муковисцидоза трансмембранного регулятора (Δ508-I539T-CFTR) может быть использован в качестве положительного контроля. В присутствии коммерчески доступного VX-809, Δ508-I539T-CFTR экспрессии на клеточной поверхности увеличивается от 2 до 3 раз.
Одиночные события везикул вставки
Сентября не флуоресцирует или photobleach в низком рН транспортной везикулы, но вновь обретает флуоресценции при воздействии внеклеточного рН 7,4 при плазматической мембране 7, 16, 18. события вставки визуализируются как взрыв флуоресценции в плазматической мембране длительностью не менее 3 кадров (600 мс), что соответствует полному слиянию транспортного пузырьком в плазматической мембране, как показано на рисунке 3. Перед вставкой (рис 3B), не различимы взрыв не присутствует. Увеличение интенсивности флуоресценции рассматривается как транспортный пузырек не поступает (3С), диффундирующих через мембрану (рис 3D - 3G), до включения в суммарную флуоресценцию клетки (рис 3H - 3I).
Рисунок 1: Схема TIRF микроскоп. Эта установка использует TIRF DPSS лазер 488 нм для возбуждения SEP, волокна, соединенного с шаговым двигателем для регулировки критического угла пучка возбуждения, переводя луч через заднюю часть отверстия объектива. Клетки визуализируют с помощью NA цели масла погружения в 60X, 1,49. Излучение детектируется с помощью электронного умножения с зарядовой связью.Файлы / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Экспрессия и Торговля на плазматической мембраны. Ячейка n2a экспрессирующих α3-SEP / β4-вес nAChRs при рН 7,4 (А) показывает , рецепторы , расположенные на плазматической мембране и эндоплазматический ретикулум. При рН 5,4 (В), рецепторы на плазматической мембране не флуоресцируют, так что только эндоплазматический ретикулум рецепторы резидентные видны. Разница между интегральной плотности при рН 7,4 и рН 5,4 (C) соответствует рецепторами , локализованными на плазменной мембране. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Single везикул Вставка события. Ячейка n2a экспрессирующих α3-Сентябре / beta ; 4-вес nAChRs с внеклеточной рН 7,4 показано на виде (А). Непосредственно перед вставку (B), без разрыва флуоресценции не видно. Незаконному обороту везикул проведение SEP прибывает (С), и SEP-меченые рецепторы не диффундировать через плазматическую мембрану (D - G), до тех пор , неотличимы от ранее вставленных рецепторов (H - I). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чувствительность рН SEP позволяет рецепторы , находящиеся на плазматической мембране , следует отличать от внутриклеточных рецепторов в эндоплазматической сети, и он может быть использован для разрешения вставки событий Рецептор несущих везикулы 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 , Несколько методов, включая поверхности биотинилирования и связывание лиганда широко используются для измерения уровней поверхностного белка. В некоторых случаях, Вестерн-блоттинг также могут использоваться для различения между ER и белком резидентной PM. Это сентябре методика на основе дополняет традиционные измерения, обеспечивая быстрое считывание поверхностной экспрессии и способность количественно оценить сдвиги в белку, локализуется на РЭ в ПМ. Так как ПСР генетически закодированы в белка, представляющего интерес, проблемы с nonspeспецифичны связывание устраняются и чувствительность повышается. Сентября проходит 488 нм возбуждение при нейтральном значении рН, но не возбужден в кислых условиях рН <6. Когда внеклеточный рН 7,4, измеряют флуоресценцию для nAChRs проживающих в эндоплазматической сети и на плазматической мембране, но не для тех , кто в более низких рН везикул секреторных или Гольджи (рН <6) 23. Во время обработки изображений, исполкомов рН 7,4 обменивается на другой идентичной растворе при рН 5,4. Различие между интегральной плотности в этих изображениях является плазматическая мембрана интегральной плотности клетки. Разделив это число на общее интегральной плотности в пределах области TIRF возбуждения, при рН 7,4, умноженное на 100, дает процент на плазматической мембране 5, 7, 8, 9. В то время как эти исследования использовали TIRFM, подобные анализы могут быть выполнены с использованием эпи-флуоресценцию.Для мембранных рецепторов, таких как нАХР, где большинство рецепторов проживают в ER, TIRM является идеальным, поскольку узкий объем возбуждения увеличивает долю видимых рецепторов резидентов РМ по сравнению с внутриклеточными рецепторами. Это увеличивает чувствительность анализа на сдвиг в распределении рецепторов между органелл. Для белков с более высоким уровнем экспрессии на ПМ, исследования SEP на основе эпи-флуоресцентный достаточны для измерения изменений в экспрессии рецепторов. Тем не менее, одиночные вставки пузырек события, которые также измеряются при рН 7,4 требуется TIRFM. Всплеск флуоресценции, соответствующей низкой везикулы торговли рН сплавленных с более высоким рН плазмы мембраны в то время как легко видеть в TIRFM, как правило, не различимые в эпи-флюоресценции.
Включение SEP с TIRF визуализации Условия
Сентября могут быть генетически включены в внеклеточный домен мембранного белка. Из-за размера и расположения SEP, это имеет решающее значение для VERIF у, что модифицированный белок не существенно отличаются по торговле людьми или функции от белка дикого типа. Анализы должны быть выполнены с использованием ПСР меченого белка, чтобы проверить, что включение метки не нарушают активности. Для ионных каналов, электрофизиологические и ионная проницаемость измерения являются идеальными, в то время как для других рецепторов флуоресцентный связывание лиганда и Вестерн-блоттинга может быть использован для проверки незаконного оборота. Прикрепленные клетки идеально подходят для трансфекции с использованием коммерческих реагентов трансфекции и визуализации с TIRFM, потому что они придают непосредственно к стеклянным дном блюдо. Это приспособление необходимо обеспечить TIRF возбуждение эванесцентной волны в пределах 150 нм от поверхности раздела стекла образца. Для достижения высоких TIRF разрешение изображений, образец должен оставаться плоским во время съемки 21. Поли-D-лизин покрытие является полезным при визуализации клеток n2a, так как он обеспечивает матрицу крепления, что сводит к минимуму движения клеток, чтобы поддерживать плоскую поверхностьдеваха = "Xref"> 7. Плотность покрытия ячейки должна быть оптимизирована для обеспечения клетки выделяют на стеклянную посуду для достижения TIRF. Cell кластеризация препятствует полному внутреннему отражению путем предотвращения плоского присоединения клеток в одной оптической плоскости. Поскольку только одна плоскость ориентирована в TIRF, поддержание надлежащего морфологии клеток имеет решающее значение для работы с изображениями. Это особенно важно, когда происходит обмен решения в исследованиях SEP. Чтобы свести к минимуму морфологические изменения, изображения при рН 7,4 и рН 5,4, необходимо собирать быстро. Кроме того, ECS (рН 5,4), в конечном счете пронизывают внутриклеточных мембран, изменяя структуру органелл и флуоресценции внутренних SEP-меченых рецепторов. Этого легко избежать путем сбора изображений при каждом условии рН в течение нескольких минут. Данные из нескольких блюд в том же сеансе визуализации могут быть объединены, чтобы увеличить количество клеток, проанализированных. При изменении решения, осторожно удалите раствор рН 7,4 ECS с пипеткой и добавить рН 5,4 ECS по каплям в тон блюдо. Удаление или добавление раствора слишком быстро может подчеркнуть клетки или переместить антенну относительно сохраненных позиций этапа. Система перфузионного для обмена растворов также могут быть использованы, при условии, что обмен решение является полным и происходит быстро. Точные концентрации соли в каждом растворе необходимо минимизировать клеточные искажения. Ступень верхний инкубатор может быть введен, чтобы уменьшить колебания температуры во время визуализации.
TIRF изображений
TIRF изображений уменьшает фоновой флуоресценции, сосредоточившись на одной оптической плоскости. Это увеличивает отношение сигнал-шум резонансно возбуждать флуорофоры в пределах примерно 150 нм от поверхности раздела стекла и образца 21, 22. В пределах этой области, разрешение значительно возрастает, в частности, на плазматической мембране. Это необходимо, если большинство рецепторов расположены внутриклеточно. Если высокая доля мембранных рецептороврасположенный на плазматической мембране, этот подход на основе Сентябрем может быть использован для определения внутриклеточную локализацию в эпифлуоресцентной. Тем не менее, если небольшой процент от общего количества рецепторов, продают в плазматической мембране, а с nAChRs, TIRFM необходимо для количественного определения рН зависимые изменения флуоресценции в плазматической мембране. Кроме того, TIRFM позволяет разрешение единичных событий и распределения рецепторов в секреторный путь незаконного оборота пузырек. Базовая настройка TIRF использует DPSS лазер 488 нм для возбуждения SEP, волокна, соединенного с шаговым двигателем для регулировки критического угла пучка возбуждения. Для достижения TIR, луч переводится в боковом направлении через заднюю апертуру объектива, пока критический угол не будет достигнут. Клетки визуализируют с помощью 60x или 100x, 1,49 NA цели масла погружения. Числовую апертуру выше, чем показатель преломления образца (> 1,38 для клеток) требуется для достижения критического угла, необходимого для TIRF. 1,45 цель NA хватило бы, но 1,49NA является более практичным при обработке угла возбуждения. Излучение обнаруживается с помощью устройства, соединенный электронным умножением заряда (EMCCD) с 8 мм массив 512 х 512 пикселей. С использованием объектива 60X, множественные изолированные клетки могут быть захвачены в пределах одного поля зрения.
Одним из основных недостатков для изучения флуоресценции на основе экспрессии белка фотообесцвечиванию 15. Это возбуждение индуцированное разложение результатов флуорофором к необратимому снижению интенсивности флуоресценции с течением времени. По этой причине, успешное отображение опирается на хрупкое равновесие между интенсивностью пучка усиления возбуждения и чипа, используемого в EMCCD. Интенсивность возбуждения должна быть достаточно, чтобы возбудить флуорофор для обнаружения высокой, но не настолько высокой, чтобы photobleach молекулу быстро. усиление камеры может быть использован для умножения сигнала для обнаружения, в отличие от увеличения интенсивности возбуждения, но это также увеличивает фон всивности. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность при выборе параметров усиления EM, чтобы избежать насыщения изображений. В промежутках между измерениями, блокируя луч возбуждения, прежде чем он достигнет образца минимизирует фотообесцвечивание. Это необходимо при сборе клеток изображений при ECS рН 7,4 для сравнения с рН 5,4. Фотообесцвечивания происходит между двумя изображениями, неотличима от отсутствия флуоресценции из-за изменения рН, так что этот эффект должен быть сведен к минимуму. Следует проявлять осторожность, чтобы использовать низкую мощность лазера и выставить клетку только на время, необходимое для захвата требуемых изображений. Для каждого эксперимента, набор клеток может быть измерена при рН 7 при одинаковых условиях формирования изображения в качестве контроля. используя не интервал и подвергая в течение времени, соответствующего времени экспозиции, необходимое для проведения анализа обеспечивает контроль, чтобы определить степень фотообесцвечивания. Если фотообесцвечивание больше, чем 10% от первоначальной интенсивности, кривая коррекции может быть использована из наблюдаемого фотообесцвечиванию крысе путем сбора временной след интенсивности флуоресценции. Для одиночных везикул вставки событий, SEP-меченый рецепторов в торговлю везикулы не возбуждаются до слияния с плазматической мембраной, либо потому, что рН диктует выключенном состоянии или они находятся за пределами TIRF области возбуждения. Таким образом, SEP помечено рецепторы не будут photobleach до введения, что позволяет более высокой мощности возбуждения, которые будут использоваться для обнаружения одиночных молекул SEP.
В заключение, этот метод может быть использован с различными присоединенными типов клеток. Сентября могут быть включены в фактически любой мембранного белка, до тех пор, как функции белка и незаконного оборота свойства сохраняются. TIRF повышает разрешение на плазматической мембране. Сентябрю позволяет дифференцировать меченных белков, расположенных на плазматической мембране из тех, в периферической эндоплазматический ретикулум.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
