Summary
Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine nella membrana ER e nel plasma periferico.
Abstract
La comprensione traffico di membrana di proteine, il montaggio, e l'espressione richiede un approccio che distingue tra coloro che risiedono in organelli intracellulari e quelli localizzati sulla membrana plasmatica. misure tradizionali a base di fluorescenza non hanno la capacità di distinguere le proteine di membrana che risiedono in diversi organelli. Taglio metodologie all'avanguardia trascendono i metodi tradizionali di accoppiamento fluorofori pH-sensibile con microscopia a riflessione interna totale in fluorescenza (TIRFM). TIRF illuminazione eccita il campione fino a circa 150 nm dall'interfaccia di vetro-campione, riducendo così bassa, aumentando il rapporto segnale rumore e migliorando risoluzione. Il volume di eccitazione in TIRFM comprende la membrana plasmatica e organelli vicine, come il pronto soccorso periferico. Superecliptic pHluorin (SEP) è una versione sensibile pH di GFP. Geneticamente codifica settembre nel dominio extracellulare di una proteina di membrana di interesse posiziona il fluoroforo sulato luminale del ER e nella regione extracellulare della cella. SEP fluorescente quando il pH è superiore a 6, ma rimane in uno stato off a valori di pH inferiori. Pertanto, i recettori etichettati con settembre fluorescenza quando risiedono nel reticolo endoplasmatico (ER) o dopo l'inserimento nella membrana plasmatica (PM), ma non quando si trova ad una vescicola tratta o altri organelli, come il Golgi. Il pH extracellulare può essere regolata a dettare la fluorescenza dei recettori sulla membrana plasmatica. La differenza di fluorescenza tra le immagini TIRF a pH neutro e extracellulare acido per la stessa cella corrisponde a un numero relativo di recettori presenti sulla membrana plasmatica. Questo permette la misurazione simultanea di recettori intracellulari residenti e membrana plasmatica. eventi di inserimento vescicole singolo può anche essere misurato quando il pH extracellulare è neutro, corrispondente ad un basso vescicole traffico pH fusione con la membrana plasmatica e la transizione in uno stato fluorescente. Questo Versatile tecnica può essere sfruttata per studiare la localizzazione, espressione, e il traffico di proteine di membrana.
Introduction
Le variazioni di espressione dei recettori, la distribuzione, e l'assemblaggio sono stati collegati a una vasta gamma di malattie, tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la fibrosi cistica, e la tossicodipendenza 1, 2, 3, 4, 5. Ad esempio, la nicotina e altri ligandi nicotinici influenzano il traffico di recettori nicotinici (nAChR) che portano a cambiamenti di traffico, di espressione, e upregulation 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. La nicotina aumenta il numero totale di nAChR assemblate all'interno di una cella, aumenta il traffico verso la membrana plasmatica, und altera l'assemblaggio di subunità per favorire una versione ad alta sensibilità di alcuni sottotipi. Risolvere i cambiamenti distinti nel traffico, il montaggio, e l'espressione dei recettori in un modello di malattia fornisce dettagli cruciali meccanicistici che sono essenziali per definire bersagli farmacologici. Un approccio ideale sarebbe rapidamente distinguere tra recettori intracellulari e quelli localizzati sulla membrana plasmatica. Ciò è particolarmente impegnativo nei casi in cui una maggioranza di una particolare proteina intracellulare risiede, come ad esempio con nAChR. Dal momento che la maggior parte dei nAChR sono localizzate al reticolo endoplasmatico, le misure tradizionali non hanno la risoluzione spazio-temporale necessario per individuare la localizzazione e il traffico di modifiche lungo la via secretoria. Traffico di recettore e di espressione studi di nAChR sono stati principalmente condotti utilizzando radioligand vincolanti 11, saggi biotinylation 12, western blotting 13, o immunoprecipitazione techniq UES 12. Questi dipendono dalla specificità di legame di una molecola giornalista o fissazione di cellule e non hanno la capacità di distinguere tra simultaneamente residente membrana plasmatica e recettori intracellulari. Pertanto, gli studi di dinamica di montaggio canale ionico e vescicole hanno in gran parte affidamento su basso-throughput tecniche elettrofisiologiche 14.
risoluzione spaziale e temporale superiore è possibile con i progressi nella microscopia a fluorescenza. Molecole giornalista geneticamente codificate, come la proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti, eliminare i problemi di legame non specifico e aumentano la sensibilità 15. Una variante sensibile pH di GFP, noto come superecliptic pHluorin (SEP), può essere utilizzata per sfruttare differenze di pH intrinseche tra compartimenti all'interno di una cella per determinare la localizzazione 5, 7, 8,ref "> 9, 16, 17, 18. settembre fluorescente quando il pH è superiore a 6, ma rimane in uno stato off a pH inferiore. Pertanto, i recettori contrassegnate con SEP loro lato luminale vengono rilevati quando presente nel reticolo endoplasmatico ( ER) o dopo l'inserimento nella membrana plasmatica (PM), ma non quando confinato in una vescicola traffico. manipolazione del pH extracellulare in contatto con recettori sulla membrana plasmatica altera conseguentemente la fluorescenza e quindi il rilevamento di questi recettori. Se la stessa cella viene sequenzialmente ripreso sia a pH extracellulare neutro e poi un pH inferiore a 6, la differenza tra le immagini è attribuita a recettori situati sulla membrana plasmatica. Questo consente la misurazione simultanea di intracellulare (ER periferica) e recettori membrana plasmatica residenti 5, 7, 8 p>, 9. eventi di inserimento vescicole singolo possono essere risolti quando il pH extracellulare è neutrale. Una volta che un basso vescicole traffico pH fonde con la membrana plasmatica, lato luminale della vescicola è esposta alla soluzione extracellulare neutra, causando una transizione rilevata come una raffica di fluorescenza 7, 18, 19, 20. Settembre permette di misurare recettori localizzati alla membrana plasmatica e periferico reticolo endoplasmatico, e fornisce un mezzo per misurare il traffico di recettori tra queste regioni subcellulari 5, 7, 18.
Per ottenere una risoluzione più alta a livello della membrana plasmatica, un recettore con la SEP geneticamente codificato viene ripreso al microscopio a riflessione interna totale fioritura (TIRFM). Questo metodo è particolarmenteutile se la maggior parte dei recettori sono localizzati a regioni intracellulari, poiché TIRFM aumenta la visibilità della membrana plasmatica. TIRFM consente anche la risoluzione della dinamica di traffico dei singoli vescicole che trasportano i recettori SEP-etichettati su inserimento nel PM. Riflessione totale avviene all'interfaccia tra materiali con differenti indici di rifrazione, come tra una cella e un vetro di copertura antiscivolo 21, 22. Settembre fluorescente quando irradiato con 488 nm di eccitazione, che è orientata per ottenere la riflessione interna totale all'interfaccia della soluzione vetro e cellule. Questo produce un'onda evanescente che penetra circa 150 nm nel campione, solo fluorofori emozionanti all'interno di questo volume. Solo Settembre contenente recettori in un ambiente pH neutro in questo intervallo di eccitazione vengono rilevati, corrispondenti a quelli residenti sulla membrana plasmatica o periferica reticolo endoplasmatico. Dal momento che il rilevamento è limitata to di eccitazione dal onda evanescente, fluorescenza di fondo della regione intracellulare è ridotto e il rapporto segnale-rumore viene aumentato 21, 22. Inoltre, poiché la radiazione non penetra la massa della cella, photodamage è minimizzato che permette l'imaging cellulare dal vivo nel corso del tempo. Come risultato, TIRFM accoppiato con geneticamente codificato settembre fornisce l'alta risoluzione e la sensibilità richiesta per misurare subcellulari localizzazione e traffico dinamiche di recettori di membrana lungo la via secretoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Colture cellulari e trasfezione
- Mantenere il mouse neuroblastoma 2 bis (N2a), le cellule in terreni di coltura.
- Fare 500 ml N2a terreni di coltura da 200 ml di mezzo Aquila Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, 250 ml ridotti mezzi siero, 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml di penicillina / streptomicina (100x).
- Mantenere le cellule in un pallone T75 a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
- Dividi celle 1:15 quando necessario, o circa il 80-90% di confluenza. Questo è tipicamente 2-3 volte a settimana.
- Coat 35 millimetri di vetro piatto fondo con poli-D-lisina.
- In un armadio biosicurezza flusso laminare, aggiungere 200 ml di 0,1 mg / ml di poli-D-lisina su vetro regione inferiore sterile piastra da 35 mm.
- Mettere in un piatto di 37 ° C incubatore per 1 ora.
- Lavare accuratamente piatto con DDH 2 O 3-4 volte.
- Lasciare piatti a completamente a secco per più di 1 ora.
- Sterilize piatti che utilizzano la luce UV nell'armadio biosicurezza, se necessario.
- Piastra cellule N2a per l'imaging TIRFM.
- Rimuovere i supporti crescita da cellule aderenti.
- Staccare cellule dal matraccio incubando con 1 ml 1x tripsina (+ EDTA) per 5 min a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
- Inattivare tripsina con l'aggiunta di 9 ml di terreni di crescita. Media mix, tripsina, e le cellule distaccate con una pipetta.
- Visivamente contare cellule utilizzando un emocitometro e calcolare il volume corretto per aggiungere 90.000 cellule per ogni vetro rivestito piatto fondo poli-D-lisina. Questa densità è necessario per trasfezione efficiente e di imaging singola TIRF cellulare.
- Aggiungere 2 ml di terreni di crescita per ogni piatto fondo di vetro contenente 90.000 cellule.
- Incubare il piatto a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 16-24 ore.
- N2a trasfezione
- Ottenere un costrutto plasmide contenente un fluoroforo settembre incorporatonella regione extracellulare della proteina di interesse. Tecniche di clonazione standard come amplificazione PCR 5 possono essere usate per generare il costrutto.
NOTA: Sep dovrebbe essere incorporato nella regione extracellulare della proteina di membrana in modo che risiede all'interno del lume del reticolo endoplasmatico o traffico vescicole ed è esposto a soluzione extracellulare quando sulla membrana plasmatica. Settembre è simile per dimensioni a GFP e strategie di clonaggio simili possono essere utilizzati. - Sostituire i mezzi di crescita su cellule placcato con 1,5 ml ridotta supporti siero (es Opti-MEM), circa 30 minuti prima dell'aggiunta del reagente di trasfezione.
NOTA: al farmaco in studio indotto cambiamenti nella recettori, un'adeguata concentrazione di farmaco può essere aggiunto al momento della trasfezione. - Aggiungere 500 ng di ogni plasmide desiderato costruire a 250 microlitri ridotto supporto siero (tubo 1).
- Aggiungere 2 ml di reagente di trasfezione ad un tubo separato containing 250 ml di mezzi siero ridotto. Incubare tubo 2 a temperatura ambiente per 5 min. Il rapporto di reagente di trasfezione di DNA plasmidico deve essere ottimizzata per esprimere ciascuna proteina di interesse.
- Combinare provette 1 e 2 per ottenere una soluzione contenente 500 ml di trasfezione reagente e mix plasmide. Incubare a temperatura ambiente per 25 min.
- Aggiungere i 500 microlitri miscela trasfezione le cellule pre-plated per un volume totale di 2 ml per piatto.
- Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 24 ore.
- Dopo 24 ore, rimuovere il mix trasfezione e lavare le cellule con mezzi di crescita e quindi aggiungere 2 ml di terreni di crescita per ogni piatto.
NOTA: Se un farmaco è stato aggiunto al momento della transfezione, esso può essere riempito di nuovo in questa fase. - Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 24 ore.
- celle di immagine 48 ore dopo la trasfezione.
- Ottenere un costrutto plasmide contenente un fluoroforo settembre incorporatonella regione extracellulare della proteina di interesse. Tecniche di clonazione standard come amplificazione PCR 5 possono essere usate per generare il costrutto.
2. Imaging cellulare dal vivo da Total InTernal Riflessione microscopia a fluorescenza (TIRFM)
- Imaging istituito
- Eseguire l'imaging con un microscopio a fluorescenza set-up invertito con una fase di scansione, come mostrato in Figura 1. Ciò richiede l'allineamento di una sorgente laser DPSS 488 nm, un motore passo-passo per regolare 488 la posizione del fascio nm, e un'alta apertura numerica (NA 1.49) 60X o 100X obiettivo ad immersione.
- Far passare il raggio laser attraverso il filtro di eccitazione appropriata (banda passante 488/10 nm). Allineare il fascio laser polarizzato attraverso una singola fibra modalità collegata ad un lanciatore montato un motore passo-passo. In modalità epifluorescenza, il fascio di eccitazione è centrato nel mezzo dell'apertura posteriore dell'obiettivo.
- Per raggiungere TIRF, utilizzare il motore passo-passo per tradurre il fascio laser focalizzato attraverso l'apertura posteriore della lente obiettivo fino a raggiungere l'angolo critico e del fascio non viene trasmessa attraverso il campione e viene invece totalmente riflessa vetro-cell interfaccia.
- Catturare immagini utilizzando un EMCCD (512 x 512 pixel), controllata con software di imaging (ad es Metamorph) con il filtro di emissione appropriata montati nel percorso di emissione (525/50 nm).
- Preparare la soluzione di imaging
- Preparare 200 ml di soluzione extracellulare (ECS) mescolando 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES e 10 mM di glucosio in DDH 2 O. soluzioni fotografici di NaCl, KCl, MgCl 2, e CaCl 2 può essere preparato in anticipo e combinato con HEPES freschi e glucosio nel giorno di imaging.
- Regolare il pH di una soluzione contenente 100 ml ECS a pH 7,4. Regolare le restanti 100 ml di ECS ad un pH di 5,4. Lavare le cellule trasfettate con 2 ml di ECS (pH 7,4).
- Aggiungere 2 ml di ECS (pH 7.4) alle cellule trasfettate prima di imaging.
- L'imaging cellulare Live in TIRF
- Accendere l'intero sistema, sapg 488 nm laser, macchina fotografica, fase di traduzione, e il programma di imaging. Mettere a fuoco il fascio epifluorescenza e regolare la potenza di circa 1 MW presso l'obiettivo 60X.
- Aggiungere l'olio con l'obiettivo e mettere un piatto di cellule trasfettate sulla fase di traduzione. Fissare il piatto in posizione con supporti di scena per assicurarsi che non si muove rispetto alla fase in modo che le cellule possono essere ripreso più volte.
- In modalità epifluorescenza, mettere a fuoco il microscopio e individuare le fluorescenti, cellule transfettate. Le cellule rimangono concentrati in diversi piani di messa a fuoco. Individuare singole cellule isolate, per procedere con TIRF.
- Nel programma di imaging, impostare il tempo di esposizione a 200 msec e ottimizzare l'intensità di fluorescenza impostando il guadagno EM.
- Transizione il fascio laser in TIRF traducendo il fascio attraverso l'obiettivo in modo graduale utilizzando il motore passo-passo. All'avvicinarsi angolo critico, il fascio visibilmente tradurre attraverso il bordo del piatto fino converge a The punto di riflessione interna totale sul piano del campione.
- Verificare che le cellule sono in modalità TIRF regolando la manopola di messa a fuoco. In TIRF, solo piano di cellule può essere focalizzata (cioè circa 150 nm dall'interfaccia vetro), producendo un'immagine molto definita con alta risoluzione della membrana plasmatica.
- Imaging settembre per determinare la localizzazione subcellulare
- Individuare sani, trasfettate, singole cellule nel piano di imaging.
- Acquisire una immagine focalizzata di cella a pH 7,4. Settembre etichettato recettori sulla membrana plasmatica e reticolo endoplasmatico dovrebbe essere visibile.
- bloccare rapidamente il fascio laser di raggiungere il campione per evitare photobleaching.
- Memorizzare le posizioni di scena corrispondenti a ciascuna cella utilizzando software di imaging microscopio in grado di registrare più posizioni xy.
- Ripetere i passaggi 2.4.1-2.4.4 per 20-30 cellule per piatto, mentre utilizzando il software per registrare la posizione di ogni cella.
- After tutte le immagini delle cellule a pH 7.4 sono raccolti, rimuovere manualmente la soluzione a pH 7.4 ECS con una pipetta. Non toccare il piatto come questo potrebbe spostare le posizioni di scena memorizzati.
- Aggiungere con cautela 2 ml di pH 5.4 ECS al piatto e attendere 10 min. Durante questo tempo, salvo immagini precedentemente acquisite.
- Sotto la serie identiche di condizioni utilizzate per raccogliere immagini a pH 7.4, spostare il palco per ciascuna posizione salvata e acquisire un'immagine della stessa cella a pH 5.4. Le cellule dovrebbero guardare meno definiti dal momento che tutti fluorescenza rilevata è originario dal reticolo endoplasmatico confinato settembre etichettato recettori. Salvare le immagini delle cellule pH 5.4.
- Imaging singoli eventi di inserimento delle vescicole in cellule vive
- Sostituire mezzi di crescita delle cellule trasfettate con 2 ml pH 7,4 ECS, o con Leibovitz L-15 media. Il pH del Leibovitz L-15 media è CO 2 indipendenti, permettendo di imaging avvenire per un lungo periodo di tempo se necessario.
- Placvia e il piatto di cellule transfettate sul palco del microscopio. Fissare e mettere a fuoco una singola cella in TIRF seguente precedente punto 2.3.
- Se presente, impostare la messa a fuoco automatica in modo che la messa a fuoco non deriva durante il periodo di imaging.
- Registrare una serie di 1.000 fotogrammi, catturando continuamente le immagini ad un frame rate di 200 msec. Sequenze di fluorescenza saranno visibili in questo periodo, corrispondente a vescicole basso traffico pH fondersi con la membrana plasmatica, esponendo SEP al pH extracellulare 7.4.
- Individuare un'altra singola cellula e ripetere il passo precedente. Ripristinare autofocus, se necessario.
3. Immagine analisi ed elaborazione dei dati
- Analizzando settembre fluorescenza per determinare localizzazione subcellulare
- Aprire le immagini delle celle utilizzando un software di analisi delle immagini, come Metamorph o ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Sottrarre il fondo sia dal pH 5,4 e pH 7,4 immagini utilizzando l'impostazione rotolamento della sfera.
- Utilizzare una soglia basato intensità di quantificare la fluorescenza da una singola cellula. selezionare manualmente una regione di interesse attorno alla cella nell'immagine del pH 7,4.
- Misurare l'area delle cellule, intensità media, e la densità integrata utilizzando un plugin di ImageJ o utilizzando la funzione integrata "Misura" nella scheda Analizza.
- Ripetere passaggi 3.1.1-3.1.3 per la stessa cella a pH 5,4, adeguando la soglia basato intensità e regione di interesse nello stesso modo.
- Dopo la densità integrato è ottenuto per immagini cellulari sia a pH 7.4 e 5.4, calcolare la membrana plasmatica densità integrato sottraendo il valore pH 5.4 dal 7.4 pH. La differenza corrisponde ai recettori numero relativo sulla membrana plasmatica all'interno della regione TIRF eccitazione.
- Come misura di traffico, calcolare la percentuale relativa di settembre etichettato recettori situati sulla membrana plasmatica rispetto ai restanti recettori visibili nelle excitati TIRFsul volume dividendo la membrana plasmatica della densità integrata dalla densità totale integrato a pH 7.4, moltiplicato per 100.
- Analizzando gli eventi di inserimento singolo vescicole
- Aprire la serie di 1.000 immagini TIFF utilizzando il software di analisi delle immagini. Sottrarre il fondo da tutti i fotogrammi con l'impostazione rotolamento della sfera.
- Regolare il bilanciamento del colore della registrazione per massimizzare le regioni intensi corrispondenti alle vescicole eventi di inserimento. contare manualmente le raffiche di fluorescenza che durano più di 3 fotogrammi (> 600 msec).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Settembre incorporazione in un recettore consente la rilevazione diretta di tale recettore in una cellula vivo. Accoppiato con TIRFM, questo permette la valutazione dei livelli di espressione relativi sulla membrana plasmatica e la distribuzione dei recettori all'interno delle sedi subcellulari nella regione di TIRF eccitazione. singoli eventi di traffico delle vescicole possono essere risolti.
Livelli di espressione relativa dei recettori SEP-etichettati sulla membrana plasmatica
Settembre fluorescenza upon eccitazione è dettata dal pH della soluzione circostante. Quando SEP fuso con recettori della membrana plasmatica residenti, il pH extracellulare può essere manipolata per attivare questa fluorescenza o disattivare 5, 7, 8, 9, 17. Quando THe pH della soluzione extracellulare è un fisiologico 7.4, recettori sia dalla membrana plasmatica ed il reticolo endoplasmatico all'interno della regione di TIRF eccitazione di fluorescenza. La soluzione extracellulare può essere scambiata con una soluzione altrimenti identica a pH 5.4. Questo fa sì che il residente membrana plasmatica settembre la transizione in uno stato off, il che significa tutto fluorescenza osservato è ora dal reticolo endoplasmatico. La Figura 2 mostra un esempio di cellule imaged sia a pH 7.4 (A) e pH 5,4 (B). Il numero relativo di recettori presenti sulla membrana plasmatica rispetto al reticolo endoplasmatico periferico all'interno della regione di TIRF eccitazione viene poi calcolata matematicamente sottraendo la densità integrata della fluorescenza a pH 5,4 da quella a pH 7,4, rappresentata nella Figura 2C. Questa densità integrato membrana plasmatica calcolato corrisponde al numero relativo di recettori SEP-etichettati situati sulla membrana plasmatica ed entro l'eccitazione TIRFvolume. Poiché la membrana plasmatica e vicina reticolo endoplasmatico periferico stanno essendo preferenzialmente eccitato con TIRF, questo confronto distribuzione subcellulare è tra i recettori localizzati a queste regioni, e non l'intera regione intracellulare della cellula.
Distribuzione subcellulare dei recettori SEP-etichettati
Traffico di recettori può essere misurata confrontando il rapporto tra recettori situati sulla membrana plasmatica rispetto al reticolo endoplasmatico. Dividendo la membrana plasmatica della densità integrata dalla densità totale integrato a pH 7.4, moltiplicato per 100, dà una percentuale relativa di recettori SEP-etichettati situati sulla membrana plasmatica 5, 7. Come controllo, brefeldina a può essere aggiunto alle cellule per interrompere il traffico proteina intracellulare. Quando brefeldina a è presente, praticamente tutto il rece rilevatoptors all'interno della regione di TIRF eccitazione saranno limitati al reticolo endoplasmatico, con un conseguente% PM inferiore. Inoltre, mutato (Δ508-I539T) cistica regolatore transmembrana della fibrosi (Δ508-I539T-CFTR) può essere utilizzato come controllo positivo. In presenza di disponibile in commercio VX-809, l'espressione Δ508-I539T-CFTR sulla superficie cellulare aumenta da 2 a 3 volte.
Singole vescicole inserimento Eventi
Settembre non fluorescenza o photobleach in basso pH di una vescicola trasporto, ma riacquista fluorescenza in seguito ad esposizione a un pH di 7,4 extracellulare sulla membrana plasmatica 7, 16, 18. eventi inserimento sono visualizzati come una raffica di fluorescenza della membrana plasmatica della durata di almeno 3 fotogrammi (600 msec), corrispondente al fondo della fusione della vescicola trasporto nella membrana plasmatica, come mostrato in figura 3. Prima di un inserimento (figura 3B), non percepibile scoppio è presente. Un aumento dell'intensità della fluorescenza è visto come arriva vescicola trasporto (Figura 3C), diffusione attraverso la membrana (Figura 3D - 3G), fino incorporando la fluorescenza bulk della cella (Figura 3H - 3I).
Figura 1: Schema di TIRF microscopio. Questa configurazione TIRF utilizza un laser DPSS 488 nm per quest 'ultima eccitazione, fibra accoppiato ad un motore passo-passo per regolare l'angolo critico del fascio di eccitazione traslando il fascio attraverso l'apertura posteriore dell'obiettivo. Le cellule vengono esposte utilizzando un 60X, 1,49 NA obiettivo ad immersione. Emissione viene rilevato utilizzando un carica dell'elettrone-moltiplicando dispositivo ad accoppiamento.file / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Espressione e il traffico sulla membrana plasmatica. Una cella N2a esprimere α3-sep nAChR / β4-WT a pH 7.4 (A) mostra recettori situati sulla membrana plasmatica e reticolo endoplasmatico. A pH 5.4 (B), recettori sulla membrana plasmatica non fluorescenza, in modo che solo i recettori endoplasmatico residenti reticolo sono visibili. La differenza tra la densità integrato a pH 7,4 e pH 5,4 (C) corrisponde ai recettori localizzati alla membrana plasmatica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Singolo vescicole inserimento evento. Una cella N2a esprimere nAChR α3-Set / β4-WT con un pH extracellulare 7.4 è mostrata in (A). Immediatamente prima un inserimento (B), non scoppio di fluorescenza è visibile. Un vescicole traffico trasportano settembre arriva (C), e recettori SEP-etichettati diffondono attraverso la membrana plasmatica (D - G), fino indistinguibili dai recettori precedentemente inseriti (H - I). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La sensibilità pH SEP consente recettori residenti sulla membrana plasmatica di distinguerli dai recettori intracellulari nel reticolo endoplasmatico, e può essere utilizzato per risolvere gli eventi di inserimento del recettore porta-vescicole 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Diverse tecniche tra cui biotinilazione superficie e ligando sono ampiamente utilizzati per misurare i livelli di proteine di superficie. In alcuni casi, western blot possono anche essere utilizzati per distinguere tra ER e PM proteina residente. Questa tecnica SEP-based è complementare a misure tradizionali, fornendo una rapida lettura di espressione superficiale e la capacità di quantificare spostamenti proteine localizzate sulla ER al PM. Da set è geneticamente codificato nella proteina di interesse, problemi con nonspefica legame vengono eliminati e la sensibilità è aumentata. Settembre subisce 488 nm eccitazione a pH neutro, ma non è eccitato in condizioni acide di pH <6. Quando il pH extracellulare è 7.4, la fluorescenza viene misurata per nAChR residenti nel reticolo endoplasmatico e sulla membrana plasmatica, ma non per quelle nelle vescicole secretorie pH inferiori o Golgi (pH <6) 23. Durante l'imaging, l'ECS di pH 7,4 viene scambiata con una soluzione altrimenti identica a pH 5.4. La differenza tra la densità integrata in queste immagini è la membrana plasmatica di densità integrato di una cella. Dividendo questo numero per la densità totale integrato all'interno della regione di TIRF eccitazione, a pH 7.4, moltiplicato per 100, dà la percentuale sulla membrana plasmatica 5, 7, 8, 9. Mentre questi studi è stato utilizzato TIRFM, test simili possono essere eseguite utilizzando epi-fluorescenza.Per recettori di membrana, come nAChR in cui la maggioranza dei recettori risiedono in un pronto soccorso, TIRM è l'ideale in quanto il volume di eccitazione stretta aumenta la frazione di PM visibili recettori residenti contro recettori intracellulari. Questo aumenta la sensibilità del test di spostamenti nella distribuzione del recettore tra organelli. Per proteine con più alti livelli di espressione sul PM, studi SEP basati epi-fluorescenza sono sufficienti per misurare le variazioni di espressione dei recettori. Tuttavia, gli eventi di inserimento delle vescicole singoli che vengono anche valutati al pH 7,4 richiedono TIRFM. Lo scoppio della fluorescenza corrispondente al basso vescicole traffico pH fondersi con la membrana plasmatica pH superiore, mentre facilmente visto in TIRFM è in genere non percepibile in epi-fluorescenza.
Incorporando settembre con TIRF imaging Condizioni
SEP possa essere geneticamente incorporato nel dominio extracellulare di una proteina di membrana. A causa delle dimensioni e la posizione di settembre, è fondamentale per VERIF y che la proteina modificata non differisce in modo significativo nel traffico o una funzione da una proteina wild-type. I dosaggi devono essere effettuate utilizzando SEP etichettato proteina per verificare che l'incorporazione del marchio non interrompere l'attività. Per i canali ionici, le misure di elettrofisiologia e permeabilità ionica sono l'ideale, mentre per altri recettori legame ligando fluorescente e Western blotting può essere utilizzato per verificare il traffico. cellule aderenti sono ideali per trasfezione con i reagenti di trasfezione commerciali e di imaging con TIRFM perché essi attribuiscono direttamente al piatto fondo di vetro. Questo accessorio è necessario per garantire TIRF eccitazione dal onda evanescente in circa 150 nm dall'interfaccia di vetro-campione. Per ottenere immagini ad alta risoluzione TIRF, il campione deve rimanere piatta durante l'imaging 21. Rivestimento Poly-D-lisina è utile quando l'imaging cellule N2A perché fornisce una matrice allegato che minimizza i movimenti delle cellule per mantenere una superficie pianalass = "xref"> 7. La densità delle cellule di placcatura deve essere ottimizzato per garantire le cellule sono isolate sul piatto di vetro per raggiungere TIRF. Cellulare raggruppamento impedisce la riflessione interna totale impedendo piatta aderenza cellulare in un unico piano ottico. Dal momento che solo un piano è focalizzata in TIRF, mantenere una corretta morfologia delle cellule è cruciale per l'imaging. Ciò è particolarmente importante quando le soluzioni vengono scambiati in studi SEP. Per ridurre al minimo i cambiamenti morfologici, immagini a pH 7.4 e pH 5.4 devono essere raccolti in fretta. Inoltre, l'ECS (pH 5,4) alla fine permeare membrane intracellulari, alterando la struttura degli organelli e fluorescenza dei recettori SEP-etichettati interne. Questo è facilmente evitato raccogliendo immagini in ciascuna condizione di pH entro pochi minuti. I dati provenienti da più piatti nella stessa sessione di imaging possono essere combinati per aumentare il numero di cellule analizzate. Quando si cambia soluzioni, rimuovere con attenzione la soluzione a pH 7.4 ECS con una pipetta e aggiungere pH 5.4 ECS goccia a goccia in tlui piatto. La rimozione o l'aggiunta di una soluzione troppo in fretta può sottolineare le cellule o spostare il piatto rispetto alle posizioni di scena salvati. Un sistema di perfusione a soluzioni di cambio può anche essere utilizzato, purché lo scambio soluzione è completa e si verifica rapidamente. concentrazioni di sale esatte in ogni soluzione sono necessari per ridurre al minimo le distorsioni di cellule. Un incubatore fase superiore può essere incorporato per ridurre le fluttuazioni di temperatura durante l'imaging.
TIRF Imaging
immagini TIRF riduce fluorescenza di fondo, concentrandosi su un unico piano ottico. Questo aumenta il rapporto segnale-rumore fluorofori selettivamente eccitanti entro circa 150 nm dall'interfaccia vetro campione 21, 22. All'interno di questa regione, la risoluzione è notevolmente aumentato, soprattutto a livello della membrana plasmatica. Ciò è necessario se la maggioranza dei recettori sono situati intracellulare. Se un'elevata frazione di recettori di membrana èsituato sulla membrana plasmatica, questo approccio basato SEP possa essere utilizzato per determinare la localizzazione subcellulare in epifluorescenza. Tuttavia, se una piccola percentuale di recettori totale trasferiti a membrana plasmatica, come con nAChR, TIRFM è necessario quantificare pH variazioni dipendenti della fluorescenza a livello della membrana plasmatica. Inoltre, TIRFM permette la risoluzione degli eventi di traffico di vescicole singole e distribuzione dei recettori all'interno della via secretoria. Una configurazione base TIRF impiega un laser DPSS 488 nm per quest 'ultima eccitazione, fibra accoppiato ad un motore passo-passo per regolare l'angolo critico del fascio di eccitazione. Per raggiungere TIR, il fascio è tradotto lateralmente attraverso l'apertura posteriore dell'obiettivo fino a raggiungere un angolo critico. Le cellule vengono esposte con un 60X o 100X, 1.49 NA obiettivo ad immersione. Una apertura numerica superiore all'indice di rifrazione del campione (> 1.38 per le cellule) è necessario per raggiungere l'angolo critico richiesto per TIRF. Un obiettivo 1.45 NA sarebbe sufficiente, ma 1.49NA è più pratico quando manipolare l'angolo di eccitazione. Emissione viene rilevato mediante un dispositivo ad accoppiamento di carica dell'elettrone-moltiplicazione (EMCCD) con una serie di 8 mm 512 x 512 pixel. Utilizzando un obiettivo 60X, più cellule isolate possono essere catturati all'interno di un campo di vista.
Uno dei principali svantaggi di fluorescenza studi basati su espressione della proteina è photobleaching 15. Questa eccitazione indotta decomposizione dei risultati fluoroforo in una diminuzione irreversibile di intensità di fluorescenza nel tempo. Per questo motivo, l'imaging successo si basa su un delicato equilibrio tra l'intensità del fascio di eccitazione e di on-chip guadagno utilizzato all'interno EMCCD. L'intensità di eccitazione deve essere sufficiente per eccitare un fluoroforo per il rilevamento alto, ma non così alta da photobleach molecola rapidamente. guadagno della telecamera può essere utilizzata per moltiplicare il segnale di rilevazione, al contrario di intensità crescente eccitazione, ma aumenta anche sfondotensity. Inoltre, è necessario prestare attenzione al momento di scegliere le impostazioni di guadagno EM, per evitare la saturazione delle immagini. Tra le misure, bloccando il fascio di eccitazione prima che raggiunga il campione minimizza photobleaching. Questo è necessario quando si raccolgono le immagini cellulari a un ECS di pH 7,4 per confrontare a pH 5.4. Photobleaching verificano tra le due immagini è indistinguibile da una mancanza di fluorescenza a causa del cambiamento di pH, quindi questo effetto deve essere ridotto al minimo. Si deve prestare attenzione a usare il potere laser a bassa e ad esporre la cella solo per la durata necessaria per catturare le immagini richieste. Per ogni esperimento, un insieme di celle può essere misurata a pH 7 in condizioni di imaging identiche come controllo. Utilizzando alcun intervallo ed esponendo per una durata corrispondente al tempo di esposizione necessario per eseguire il saggio fornisce un controllo per determinare il grado di photobleaching. Se photobleaching è maggiore del 10% dell'intensità originale, una curva di correzione può essere utilizzato dal ratto photobleaching osservatae raccogliendo una traccia temporale di intensità di fluorescenza. Per gli eventi di inserimento singole vescicole, i recettori SEP-etichettato traffico di vescicole non sono eccitato fino a quando la fusione con la membrana plasmatica, sia perché il pH impone uno stato spento o sono al di fuori della regione TIRF dell'eccitazione. Pertanto, la SEP etichettato recettori non photobleach fino all'inserimento, permettendo potenza di eccitazione più elevato per essere utilizzato al fine di rilevare singole molecole SEP.
In conclusione, questa tecnica può essere utilizzato con una varietà di tipi di cellule aderenti. SEP possa essere incorporato in praticamente qualsiasi proteina di membrana, purché le proprietà funzionali della proteina e traffico sono mantenuti. TIRF aumenta la risoluzione a livello della membrana plasmatica. Settembre consente la differenziazione delle proteine contrassegnate situati sulla membrana plasmatica da quelli all'interno del reticolo endoplasmatico periferico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
