Summary
Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.
Abstract
Entendiendo la trata de proteínas de membrana, reunión y expresión requiere un enfoque que distingue entre aquellos que residen en organelos intracelulares y aquellos localizados en la membrana plasmática. Las mediciones tradicionales basados en fluorescencia carecen de la capacidad de distinguir las proteínas de membrana que residen en diferentes orgánulos. Metodologías de corte de borde trascienden los métodos tradicionales de acoplamiento fluoróforos sensibles al pH con microscopía de fluorescencia de reflexión total interna (TIRFM). TIRF iluminación excita la muestra hasta aproximadamente 150 nm desde la interfaz vidrio-muestra, disminuyendo de este modo el fondo, el aumento de la relación señal a ruido, y la mejora de resolución. El volumen de excitación en TIRFM abarca la membrana plasmática y orgánulos cercanos, como la sala de emergencias periférica. Superecliptic pHluorin (SEP) es una versión sensible al pH de la GFP. Genéticamente que codifica septiembre en el dominio extracelular de una proteína de membrana de interés posiciona el fluoróforo enel lado luminal de la ER y en la región extracelular de la célula. SEP es fluorescente cuando el pH es mayor que 6, pero permanece en un estado apagado a valores de pH más bajos. Por lo tanto, los receptores de septiembre etiquetados con fluorescencia cuando residan en el retículo endoplásmico (ER) o después de la inserción en la membrana plasmática (PM), pero no cuando está confinado a una vesícula o el tráfico de otros orgánulos tales como el aparato de Golgi. El pH extracelular se puede ajustar para dictar la fluorescencia de los receptores en la membrana plasmática. La diferencia en la fluorescencia entre las imágenes TIRF a pH extracelular neutro y ácido para la misma célula corresponde a un número relativo de receptores en la membrana plasmática. Esto permite la medición simultánea de los receptores residentes intracelulares y de membrana plasmática. eventos de inserción individual de vesículas también pueden medirse cuando el pH extracelular es neutral, que corresponde a una vesícula de bajo tráfico de pH fusión con la membrana plasmática y la transición a un estado fluorescente. esta versatiltécnica e puede ser explotado para estudiar la localización, expresión, y el tráfico de proteínas de membrana.
Introduction
Los cambios en la expresión del receptor, la distribución, y el conjunto se han conectado a una amplia variedad de enfermedades, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, fibrosis quística, y adicción a las drogas 1, 2, 3, 4, 5. Por ejemplo, la nicotina y otros ligandos nicotínicos influyen en el tráfico de los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) que conducen a los cambios en el tráfico, la expresión y la regulación positiva 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. La nicotina aumenta el número total de nAChR ensamblados dentro de una célula, aumenta el tráfico hacia la membrana de plasma, unad altera el ensamblaje de las subunidades para favorecer una versión de alta sensibilidad de algunos subtipos. La resolución de distintos cambios en el tráfico, reunión y expresión de receptores en un modelo de enfermedad proporciona detalles mecanicistas cruciales que son esenciales para definir objetivos farmacológicos. Un enfoque ideal sería diferenciar rápidamente entre los receptores intracelulares y los localizada en la membrana plasmática. Esto es particularmente difícil en los casos en que una mayoría de una proteína particular reside intracelularmente, tal como con nAChR. Dado que la mayoría de nAChR se localiza en el retículo endoplásmico, las mediciones tradicionales tienen la resolución espacio-temporal necesaria para determinar los cambios de localización y de tráfico a lo largo de la vía secretora. Los estudios de tráfico de los receptores y la expresión de nAChR principalmente se han llevado a cabo mediante la unión de radioligando 11, 12 ensayos de biotinilación, Western Blot 13, o TECHNIQ inmunoprecipitación UES 12. Estos dependen de la especificidad de unión de una molécula indicadora o la fijación de las células y carecen de la capacidad de distinguir simultáneamente entre residente membrana plasmática y receptores intracelulares. Por lo tanto, los estudios de la dinámica de montaje de canales de iones y la vesícula se han basado en gran medida en las técnicas electrofisiológicas de bajo rendimiento 14.
resolución espacial y temporal superior es posible con los avances en microscopía de fluorescencia. Las moléculas indicadoras genéticamente codificados, como la proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes, eliminar los problemas de unión no específica y aumentan la sensibilidad a 15. Una variante sensible al pH de GFP, conocido como pHluorin superecliptic (SEP), se puede usar para explotar las diferencias de pH inherentes entre compartimentos dentro de una célula para determinar la localización 5, 7, 8,ref "> 9, 16, 17, 18. septiembre emite fluorescencia cuando el pH es superior a 6, pero permanece en un estado apagado a pH más bajo. Por lo tanto, los receptores etiquetados con septiembre de su lado luminal se detectan cuando está presente en el retículo endoplásmico ( ER) o tras la inserción en la membrana plasmática (PM), pero no cuando limita a una vesícula trata. la manipulación del pH extracelular en contacto con los receptores en la membrana plasmática en consecuencia, altera la fluorescencia y por lo tanto la detección de estos receptores. Si la misma célula se forma la imagen secuencialmente tanto a pH extracelular neutral y luego un pH inferior a 6, la diferencia entre las imágenes se atribuye a receptores situados en la membrana plasmática. Esto permite una medición simultánea de intracelular (ER periférica) y receptores de membrana residentes plasma 5, 7, 8 9. eventos de inserción individual de vesículas también se pueden resolver cuando el pH extracelular es neutral. Una vez que una vesícula de bajo tráfico de pH se fusiona con la membrana plasmática, el lado luminal de la vesícula se expone a la solución extracelular neutral, causando una transición detectada como una ráfaga de fluorescencia 7, 18, 19, 20. Septiembre permite la medición de los receptores localizados en la membrana plasmática y retículo endoplasmático periférica, y proporciona un medio para medir el tráfico de los receptores entre estas regiones subcelulares 5, 7, 18.
Para lograr una mayor resolución en la membrana plasmática, un receptor con la SEP codificados genéticamente se forma la imagen por microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM). Este método es particularmenteútil si la mayoría de los receptores están localizados en las regiones intracelulares, ya que TIRFM aumenta la visibilidad de la membrana plasmática. TIRFM también permite la resolución de la dinámica del tráfico de vesículas individuales que llevan receptores marcados SEP tras la inserción en el PM. La reflexión interna total se produce en la interfase de materiales con diferentes índices de refracción, como entre una célula y un cubre de vidrio 21, 22. Septiembre emite fluorescencia cuando se irradia con 488 nm de excitación, que está orientada para alcanzar la reflexión interna total en la interfaz de la solución de vidrio y celular. Esto produce una onda evanescente que penetra aproximadamente 150 nm en la muestra, sólo fluoróforos emocionantes dentro de este volumen. Sólo septiembre que contiene los receptores en un entorno de pH neutro dentro de este rango de excitación son detectados, correspondientes a los que residen en la membrana plasmática o retículo endoplásmico periférica. Dado que la detección es t limitadoo la excitación por la onda evanescente, la fluorescencia de fondo de la región intracelular se reduce y la relación señal a ruido se aumenta 21, 22. Además, ya que la radiación no penetra en la mayor parte de la célula, se minimiza el daño solar que permite imágenes de células vivas en el transcurso del tiempo. Como resultado, TIRFM acoplado con codificada genéticamente septiembre proporciona la requerida para la medición de localización subcelular y tráfico dinámica de los receptores de membrana a lo largo de la vía secretora de alta resolución y sensibilidad.
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Protocol
1. Cultivo de células y transfección
- Mantener las células de neuroblastoma de ratón 2a (N2a) en medio de crecimiento.
- Hacer 500 ml de medio de crecimiento N2a de 200 ml de medio de Eagle de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, 250 ml reducen medio de suero, 50 ml de suero fetal bovino (FBS), y 5 ml de penicilina / estreptomicina (100x).
- Mantener las células en un matraz T75 a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
- Dividir celdas 1:15 cuando sea necesario, o aproximadamente el 80-90% de confluencia. Esto es típicamente 2-3 veces a la semana.
- Escudo 35 milímetros de vidrio plato de fondo con poli-D-lisina.
- En una cabina de bioseguridad de flujo laminar, añadir 200 l de 0,1 mg / ml de poli-D-lisina sobre vidrio región inferior de plato estéril 35 mm.
- Introducir la cápsula en una incubadora a 37ºC durante 1 hora.
- Enjuagar cuidadosamente plato con ddH2O 3-4 veces.
- Deje secar la vajilla completamente seco durante más de 1 hora.
- Sterilize platos usando luz UV en la cabina de bioseguridad si es necesario.
- Placa células N2a para formación de imágenes TIRFM.
- Retirar el medio de crecimiento de células adherentes.
- Separar las células del matraz mediante incubación con 1 ml de 1x tripsina (+ EDTA) durante 5 min a 37 ° C en un incubador de CO2 5%.
- Inactivar la tripsina mediante la adición de 9 ml de medio de crecimiento. Mezcla de medios, tripsina, y células separadas utilizando una pipeta.
- contar visualmente células utilizando un hemocitómetro y calcular el volumen correcto de añadir 90.000 células a cada placa inferior de vidrio revestido con poli-D-lisina. Se requiere esta densidad para la transfección eficiente y sencillo de imágenes TIRF celular.
- Añadir 2 ml de medio de crecimiento para cada plato con fondo de vidrio que contiene 90.000 células.
- Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 16-24 horas.
- transfección n2a
- Obtener una construcción de plásmido que contiene un fluoróforo septiembre incorporadoen la región extracelular de la proteína de interés. Técnicas de clonación estándar tales como la amplificación PCR 5 se pueden utilizar para generar la construcción.
NOTA: septiembre debe ser incorporado en la región extracelular de la proteína de membrana de manera que reside en el lumen del retículo endoplasmático o el tráfico de vesículas y se expone a la solución extracelular cuando en la membrana plasmática. SEP es similar en tamaño a las estrategias de clonación similar GFP y se pueden utilizar. - Reemplazar el medio de crecimiento en células cultivadas en placas con 1,5 ml de medio de suero reducido (por ejemplo, Opti-MEM), aproximadamente 30 min antes de la adición del reactivo de transfección.
NOTA: Para el estudio de los cambios inducidos por fármacos en los receptores, una concentración apropiada de fármaco se puede añadir en el momento de la transfección. - Añadir 500 ng de cada plásmido deseado construir a 250 l reducido medio de suero (tubo 1).
- Añadir 2 l de reactivo de transfección a un tubo separado containing 250 l de medio de suero reducido. Incubar el tubo 2 a temperatura ambiente durante 5 min. La proporción de reactivo de transfección con el plásmido de ADN debe ser optimizado para expresar cada proteína de interés.
- Combinar los tubos 1 y 2 para hacer una solución que contiene 500 l de reactivo de transfección y la mezcla de plásmido. Incubar a temperatura ambiente durante 25 min.
- Añadir los 500 l de mezcla de transfección las células pre-plateado para un volumen total de 2 ml por placa.
- Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 24 horas.
- Después de 24 horas, retire la mezcla de transfección y aclarar las células con medio de cultivo y se añaden 2 ml de medio de crecimiento para cada plato.
NOTA: Si un fármaco se añadió en el momento de la transfección, lo que se regenera de nuevo en este paso. - Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 24 horas.
- celdas de imagen 48 horas después de la transfección.
- Obtener una construcción de plásmido que contiene un fluoróforo septiembre incorporadoen la región extracelular de la proteína de interés. Técnicas de clonación estándar tales como la amplificación PCR 5 se pueden utilizar para generar la construcción.
2. Imágenes de células vivas por Total EnLa reflexión interna microscopía de fluorescencia (TIRFM)
- Imaging creó
- Realizar formación de imágenes con un microscopio de fluorescencia configuración invertida con una etapa de exploración, como se muestra en la Figura 1. Esto requiere la alineación de una fuente de láser DPSS 488 nm, un motor paso a paso para ajustar la posición del haz 488 nm, y una alta apertura numérica (NA 1,49) 60X o 100X objetivo de inmersión en aceite.
- Pasar el haz de láser a través del filtro de excitación apropiada (paso de banda de 488/10 nm). Alinear el haz láser polarizado a través de una fibra de modo único conectado a un lanzador montado en un motor paso a paso. En el modo de epifluorescencia, el haz de excitación está centrada en el centro de la abertura posterior de la objetivo.
- Para alcanzar TIRF, utilice el motor paso a paso para traducir el haz láser enfocado a través de la abertura posterior de la lente objetivo hasta que se alcanza el ángulo crítico y haz ya no se transmite a través de la muestra y es en lugar totalmente reflejada en el cristal-cell interfaz.
- Capturar imágenes utilizando un EMCCD (512 x 512 píxeles) controlado con software de imágenes (por ejemplo Metamorph) con el filtro de emisión apropiado montados en la trayectoria de las emisiones (525/50 nm).
- Preparar la solución de imagen
- Preparar 200 ml solución extracelular (ECS) mezclando NaCl 150 mM, KCl 4 mM, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl 2, HEPES 10 mM y glucosa 10 mM en ddH 2 O. soluciones madre de NaCl, KCl, MgCl 2, y CaCl 2 se puede preparar de antemano y se combina con HEPES frescas y de glucosa en el día de obtención de imágenes.
- Ajustar el pH de una solución que contiene 100 ml ECS a pH 7,4. Ajuste los restantes 100 ml de ECS a un pH de 5,4. Enjuagar las células transfectadas con 2 ml de ECS (pH 7,4).
- Añadir 2 ml de ECS (pH 7,4) a las células transfectadas antes de formación de imágenes.
- Imágenes de células vivas en TIRF
- Encienda todo el sistema, including 488 nm láser, cámara, etapa de traducción, y un programa de formación de imágenes. Enfocar el haz de epifluorescencia y ajustar la potencia de aproximadamente 1 mW en el objetivo 60X.
- Añadir el aceite con el objetivo y colocar una placa de células transfectadas en la etapa de traducción. Asegurar el plato en su lugar usando montajes etapa para asegurar que no se mueva con respecto a la etapa de lo que las células se pueden obtener imágenes múltiples veces.
- En el modo de epifluorescencia, enfocar el microscopio y localizar las células fluorescentes, transfectadas. Las células se mantendrán centrado la mayoría de planos de enfoque. Localizar las células individuales, aislados para continuar con TIRF.
- En el programa de imagen, ajustar el tiempo de exposición a 200 ms y optimizar la intensidad de fluorescencia mediante el establecimiento de la ganancia EM.
- Transición, el rayo láser en TIRF mediante la traducción del haz a través del objetivo de una manera por etapas usando el motor paso a paso. Cuando se acerca el ángulo crítico, el haz se traducirá visiblemente a través del borde del plato hasta que converge en el thletra e de la reflexión interna total en el plano de la muestra.
- Compruebe que los elementos están en modo TIRF ajustando el botón de enfoque. En TIRF, un solo plano de las células puede ser enfocada (es decir, aproximadamente 150 nm desde la interfaz vidrio), produciendo una imagen muy definida con alta resolución de la membrana plasmática.
- Imaging SEP para determinar la localización subcelular
- Localiza transfectadas, las células sanas, solo en el plano de la imagen.
- Adquirir una imagen enfocada de la célula a un pH de 7,4. Septiembre etiquetado receptores en la membrana plasmática y retículo endoplasmático debe ser visible.
- bloquear rápidamente el haz láser llegue a la muestra para evitar photobleaching.
- Memorizar las posiciones de platina correspondientes a cada celda utilizando el software de imágenes de microscopio capaz de grabar varias ubicaciones xy.
- Repita los pasos 2.4.1-2.4.4 de 20-30 células por placa, mientras que utilizando el software para grabar la posición de cada célula.
- after se recogen todas las imágenes de células a pH 7,4, quite manualmente la solución ECS pH 7,4 usando una pipeta. No toque el plato ya que esto podría mover las posiciones de platina memorizados.
- Añadir cuidadosamente 2 ml de pH 5,4 ECS al plato y esperar 10 minutos. Durante este tiempo, guardar las imágenes adquiridas previamente.
- Bajo el conjunto idéntico de condiciones utilizadas para recoger imágenes a pH 7,4, mueva el escenario para cada posición guardada y adquirir una imagen de la misma célula a un pH de 5,4. Las células deben verse menos definidas ya que todos fluorescencia detectada se origina a partir del retículo endoplásmico confinado septiembre receptores marcados. Guardar las imágenes de células pH 5.4.
- Eventos de inserción de imágenes de vesículas individuales en células vivas
- Reemplazar medio de crecimiento de las células transfectadas con 2 ml pH 7,4 ECS, o con L-15 de Leibovitz medios de comunicación. El pH de los medios de comunicación L-15 de Leibovitz es CO 2 independiente, lo que permite formación de imágenes se lleve a cabo durante un largo período de tiempo si es necesario.
- Place la placa de células transfectadas en la platina del microscopio. Asegurar y centrarse en una sola célula TIRF siguiente paso 2.3 anterior.
- Si lo tiene, ajustar el enfoque automático por lo que el foco no se mueve durante el período de formación de imágenes.
- Grabar una serie de 1.000 imágenes, capturando imágenes de forma continua a una velocidad de 200 ms. Ráfagas de fluorescencia serán visibles durante este tiempo, que corresponde a vesículas bajos de tráfico de pH de fusión con la membrana plasmática, la exposición de la SEP en el pH extracelular 7,4.
- Localiza otra celda individual y repita el paso anterior. Restablecer el enfoque automático si es necesario.
Análisis 3. Imagen y Procesamiento de Datos
- El análisis de fluorescencia SEP para determinar la localización subcelular
- Abrir las imágenes de células usando un software de análisis de imágenes, tales como Metamorph o ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Restar el fondo tanto de pH 5,4 y pH 7,4 imágenes usando el ajuste de balanceo de la bola.
- Utilice un umbral basado intensidad para cuantificar la fluorescencia de una sola célula. seleccionar manualmente una región de interés alrededor de la celda en la imagen de pH 7,4.
- Medir la superficie celular, intensidad media, y la densidad integrada usando un plugin de ImageJ o el uso de la función integrada "Medida" en la ficha Analizar.
- Repetir los pasos 3.1.1-3.1.3 para la misma célula a un pH de 5,4, ajustando cuidadosamente el umbral basado intensidad y región de interés de la misma manera.
- Después se obtiene la densidad integrada para imágenes de células tanto a pH 7,4 y 5,4, calcular la densidad integrada de membrana plasmática restando el valor de pH 5,4 a partir de la 7,4 valor de pH. La diferencia corresponde a los receptores número relativo sobre la membrana de plasma dentro de la región TIRF de excitación.
- Como una medida de tráfico, calcular el porcentaje relativo de la SEP receptores situados en la membrana plasmática marcada en comparación con los receptores restantes visibles en las excitati TIRFen el volumen dividiendo la membrana plasmática densidad integrada por la densidad total integrada a pH 7,4, multiplicado por 100.
- El análisis de los eventos de inserción sola vesícula
- Abrir la serie de 1.000 imágenes TIFF utilizando el software de análisis de imágenes. Restar el fondo de todas las tramas utilizando el ajuste de balanceo de la bola.
- Ajustar el balance de color de la grabación para maximizar regiones intensos correspondientes a los eventos de inserción de la vesícula. contar manualmente las ráfagas de fluorescencia que duran más de 3 cuadros (> 600 ms).
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Representative Results
Septiembre incorporación en un receptor permite la detección directa de que el receptor en una célula viva. Junto con TIRFM, esto permite la evaluación de los niveles relativos de expresión en la membrana plasmática y la distribución de los receptores dentro de las ubicaciones subcelulares en la región de TIRF de excitación. eventos individuales tráfico de vesículas también pueden ser resueltos.
Los niveles relativos de expresión de receptores marcados SEP en la membrana plasmática
Septiembre de fluorescencia tras la excitación es dictada por el pH de la solución circundante. Cuando septiembre se fusiona con los receptores residentes membrana plasmática, el pH extracelular puede ser manipulado para girar esta fluorescencia o fuera de 5, 7, 8, 9, 17. cuando THe pH de la solución extracelular es un fisiológica 7.4, los receptores tanto de la membrana plasmática y retículo endoplasmático dentro de la región de TIRF fluorescencia de excitación. La solución extracelular a continuación, puede ser intercambiada con una solución por lo demás idéntica de pH 5,4. Esto hace que el residente membrana plasmática SEP para la transición a un estado apagado, es decir, toda la fluorescencia observada es ahora desde el retículo endoplásmico. La figura 2 muestra un ejemplo de las células fotografiadas tanto a pH 7,4 (A) y pH 5,4 (B). El número relativo de receptores en la membrana plasmática en comparación con el retículo endoplásmico periférica dentro de la región de TIRF de excitación se calcula entonces matemáticamente restando la densidad integrada de la fluorescencia a pH 5,4 que a pH de 7,4, representada en la Figura 2C. Esta densidad integrada de membrana de plasma calculado corresponde al número relativo de receptores marcados-septiembre situados en la membrana plasmática y dentro de la excitación TIRFvolumen. Desde la membrana plasmática y retículo endoplasmático cerca periférica están siendo preferentemente excitado con TIRF, esta comparación distribución subcelular es entre los receptores localizados en estas regiones, y no toda la región intracelular de la célula.
Subcelular Distribución de los receptores marcados SEP
Trata de los receptores se puede medir mediante la comparación de la relación entre receptores situados en la membrana plasmática en comparación con el retículo endoplásmico. La división de la membrana de plasma de densidad integrada por la densidad total integrada a pH 7,4, multiplicado por 100, da un porcentaje relativo de receptores marcados-septiembre situados en la membrana de plasma 5, 7. Como control, Brefeldina A se puede añadir a las células para alterar el tráfico intracelular de proteínas. Cuando brefeldin A está presente, virtualmente toda la rece detectadoptors dentro de la región de TIRF de excitación se limitarán al retículo endoplásmico, lo que resulta en un menor% PM. Además, mutado (Δ508-I539T) quística regulador de transmembrana de la fibrosis (Δ508-I539T-CFTR) se puede utilizar como un control positivo. En presencia de disponible comercialmente VX-809, la expresión Δ508-I539T-CFTR en la superficie celular aumenta de 2 a 3 veces.
Eventos individuales de inserción Vesícula
Septiembre no se muestra fluorescente o fotoblanqueador en el bajo pH de una vesícula de transporte, pero recupera la fluorescencia tras la exposición a un pH extracelular de 7,4 en la membrana plasmática 7, 16, 18. eventos de inserción se visualizan como una ráfaga de fluorescencia en la membrana plasmática de al menos 3 marcos (600 ms), correspondiente a la fusión completa de la vesícula de transporte en la membrana plasmática, como se muestra en la Figura 3. Antes de una inserción (Figura 3B), no ráfaga discernible está presente. Un aumento en la intensidad de fluorescencia se ve como la vesícula de transporte llega (Figura 3C), la difusión a través de la membrana (Figura 3D - 3G), hasta que la incorporación en la fluorescencia mayor de la célula (Figura 3H - 3I).
Figura 1: Esquema de TIRF microscopio. Esta configuración TIRF utiliza un láser DPSS 488 nm para septiembre de excitación, la fibra acoplado a un motor paso a paso para ajustar el ángulo crítico de la viga de excitación mediante la traducción del haz a través de la abertura posterior de la objetivo. Las células son imágenes utilizando un 60X, 1,49 NA objetivo de inmersión en aceite. La emisión se detecta usando una carga de electrones multiplicando dispositivo acoplado.archivos / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Expresión y el tráfico en la membrana plasmática. Una célula que expresa N2a α3-sep nAChR / β4-WT a pH 7,4 (A) muestra los receptores situados en la membrana plasmática y retículo endoplasmático. A pH 5,4 (B), los receptores en la membrana plasmática no emiten fluorescencia, de modo que sólo los receptores residentes retículo endoplasmático son visibles. La diferencia entre la densidad integrada a pH 7,4 y pH 5,4 (C) corresponde a los receptores localizados en la membrana plasmática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Individual Vesícula inserción de eventos. Una célula que expresa N2a nAChR α3-sep / beta 4-en peso con un pH extracelular 7.4 se muestra en (A). Inmediatamente antes de una inserción (B), no ráfaga de fluorescencia es visible. Una vesícula tráfico de realización septiembre llega (C), y los receptores marcados con septiembre difundirse a través de la membrana plasmática (D - G), hasta indistinguibles de los receptores previamente insertados (H - I). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La sensibilidad al pH de la SEP permite receptores que residen en la membrana plasmática a distinguirse de los receptores intracelulares en el retículo endoplásmico, y se puede utilizar para resolver los eventos de inserción de receptor de transporte de vesículas 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Varias técnicas que incluyen la biotinilación de la superficie y la unión del ligando se usan ampliamente para medir los niveles de superficie de la proteína. En algunos casos, las transferencias Western también pueden utilizarse para distinguir entre ER y la proteína residente PM. Esta técnica basada en la SEP es complementaria a las medidas tradicionales, proporcionando una rápida lectura de la expresión en superficie y la capacidad de cuantificar los cambios en la proteína localizada en el ER a la PM. Desde sep está codificada genéticamente en la proteína de interés, problemas con nonspeespe- unión se eliminan y se aumenta la sensibilidad. Septiembre sufre de excitación de 488 nm a pH neutro, pero no se excita en condiciones ácidas de pH <6. Cuando el pH extracelular es 7,4, la fluorescencia se mide para los nAChR que residen en el retículo endoplasmático y en la membrana plasmática, pero no para aquellos en las vesículas secretoras pH más bajos o Golgi (pH <6) 23. Durante estas pruebas, el ECS de pH 7,4 se cambia por una solución por lo demás idéntica a pH 5,4. La diferencia entre la densidad integrada en estas imágenes es la densidad integrada de la membrana plasmática de una célula. Dividiendo esta cantidad por la densidad total integrada dentro de la región de TIRF de excitación, a pH 7,4, multiplicado por 100, indica el porcentaje en la membrana plasmática 5, 7, 8, 9. Si bien estos estudios utilizaron TIRFM, ensayos similares se pueden realizar usando epi-fluorescencia.Para receptores de membrana como nAChR donde la mayoría de los receptores residen en el ER, TIRM es ideal ya que el volumen de excitación estrecho aumenta la fracción de receptores visibles residentes PM frente a receptores intracelulares. Esto aumenta la sensibilidad del ensayo a los cambios en la distribución del receptor entre orgánulos. Para las proteínas con altos niveles de expresión en el PM, los estudios basados SEP epi-fluorescencia son suficientes para medir los cambios en la expresión del receptor. Sin embargo, los eventos de inserción de vesículas individuales que también se han registrado a pH 7,4 requieren TIRFM. La ráfaga de fluorescencia correspondiente a la vesícula bajo tráfico de pH fusión con la membrana plasmática pH más alto mientras que fácilmente se ve en TIRFM típicamente no discernible en epi-fluorescencia.
La incorporación de la SEP TIRF Imaging Condiciones
Septiembre puede incorporarse genéticamente en el dominio extracelular de una proteína de membrana. Debido al tamaño y la ubicación de la SEP, es crítico para verif y que la proteína modificada no difiere significativamente en el tráfico o la función de una proteína de tipo salvaje. Los ensayos deben realizarse utilizando la SEP etiquetado de proteínas para verificar que la incorporación de la etiqueta no interrumpir la actividad. Para los canales de iones, las mediciones de electrofisiología y permeabilidad de iones son ideales, mientras que para otros receptores de unión a ligando fluorescente y Western Blot se puede utilizar para verificar el tráfico. Las células adherentes son idealmente adecuados para la transfección con los reactivos de transfección comerciales y de formación de imágenes con TIRFM porque se conectan directamente a la placa de fondo de cristal. Este accesorio es necesario garantizar excitación TIRF por la onda evanescente dentro de aproximadamente 150 nm desde la interfaz vidrio-muestra. Para lograr imágenes de alta resolución TIRF, la muestra debe permanecer plana cuando se toman imágenes 21. recubrimiento de poli-D-lisina es beneficioso cuando imágenes de células N2a, ya que proporciona una matriz de ligadura que minimiza los movimientos celulares para mantener una superficie planalass = "xref"> 7. La densidad de célula de recubrimiento debe ser optimizado para asegurar células se aíslan en el plato de cristal para lograr TIRF. agrupación celular impide la reflexión interna total mediante la prevención de la adherencia celular plana en un solo plano óptico. Desde un solo plano se centra en TIRF, el mantenimiento de la morfología celular adecuada es fundamental para la imagen. Esto es particularmente importante cuando las soluciones se están intercambiando en los estudios de la SEP. Para reducir al mínimo los cambios morfológicos, imágenes a pH 7,4 y pH 5,4 que es necesario recoger rápidamente. Además, el ECS (pH 5,4) con el tiempo impregnar las membranas intracelulares, la alteración de la estructura de orgánulos y la fluorescencia de los receptores internos marcados-septiembre Esto se puede evitar fácilmente mediante la recopilación de imágenes en cada condición pH dentro de unos pocos minutos. Los datos de múltiples platos en la misma sesión de formación de imágenes se pueden combinar para aumentar el número de células analizadas. Al cambiar las soluciones, retire con cuidado la solución ECS pH 7,4 con una pipeta y añadir pH 5,4 ECS gota a gota en tque plato. La eliminación o la adición de solución demasiado rápido puede subrayar las células o mover el plato con respecto a las posiciones de la etapa guardados. Un sistema de perfusión de soluciones de intercambio también puede ser utilizado, siempre que el cambio de solución es completa y se produce rápidamente. Se requieren concentraciones de sal exactas en cada solución para minimizar las distorsiones de células. Una incubadora de etapa superior se puede incorporar para reducir las fluctuaciones de la temperatura, mientras que la formación de imágenes.
TIRF Imaging
imágenes TIRF reduce la fluorescencia de fondo, centrándose en un solo plano óptico. Esto aumenta la relación señal a ruido por fluoróforos selectivamente emocionantes dentro de aproximadamente 150 nm desde la interfaz vidrio-muestra de 21, 22. Dentro de esta región, la resolución se incrementa en gran medida, particularmente en la membrana plasmática. Esto es necesario si la mayoría de los receptores están localizados intracelularmente. Si una alta fracción de los receptores de membrana essituado en la membrana plasmática, este enfoque basado en septiembre puede ser utilizado para determinar la localización subcelular en epifluorescencia. Sin embargo, si un pequeño porcentaje del total de los receptores son objeto de tráfico a la membrana plasmática, al igual que con los nAChR, TIRFM es necesario cuantificar los cambios dependientes del pH de la fluorescencia en la membrana plasmática. También, TIRFM permite la resolución de los eventos de tráfico de vesículas individuales y distribución de los receptores dentro de la vía secretora. Una configuración básica TIRF emplea un láser DPSS 488 nm para septiembre de excitación, la fibra acoplado a un motor paso a paso para ajustar el ángulo crítico de la viga de excitación. Para lograr TIR, el haz se traduce lateralmente a través de la abertura posterior de la objetivo hasta que se alcanza un ángulo crítico. Las células son imágenes utilizando un 60X o 100X, 1,49 NA objetivo de inmersión en aceite. Es necesaria una apertura numérica más alta que el índice de refracción de la muestra (> 1,38 para las células) para alcanzar el ángulo crítico requerido para TIRF. Un objetivo de 1,45 NA sería suficiente, pero 1.49NA es más práctico cuando se manipula el ángulo de excitación. La emisión se detecta mediante un dispositivo de acoplamiento de carga del electrón-multiplicando (EMCCD) con una serie de 8 mm de 512 x 512 píxeles. Utilizando un objetivo de 60X, múltiples células aisladas pueden ser capturados dentro de un campo de visión.
Uno de los mayores inconvenientes a la fluorescencia estudios basados de expresión de la proteína se photobleaching 15. Esta excitación inducida descomposición de los resultados de fluoróforos en una disminución irreversible de la intensidad de fluorescencia con el tiempo. Por esta razón, las imágenes de éxito se basa en un delicado equilibrio entre la intensidad del haz de ganancia de excitación y en el chip utilizado en el EMCCD. La intensidad de excitación tiene que ser suficiente para excitar un fluoróforo para la detección de alto, pero no tan alta como para fotoblanqueador la molécula rápidamente. ganancia de la cámara se puede utilizar para multiplicar la señal para la detección, en comparación con el aumento de la intensidad de excitación, pero esto también aumenta en el fondointensidad. Además, se debe tener cuidado al elegir los ajustes de ganancia EM, para evitar la saturación de las imágenes. En entre las mediciones, bloqueando el haz de excitación antes de que alcance la muestra minimiza photobleaching. Esto es necesario en la recogida de imágenes de células en un ECS de pH 7,4 a comparar a pH 5,4. Photobleaching se produce entre las dos imágenes es indistinguible de una falta de fluorescencia debido a cambio de pH, por lo que este efecto debe ser minimizado. Se debe tener cuidado al usar láser de baja potencia y para exponer la celda sólo durante el tiempo necesario para capturar las imágenes necesarias. Para cada experimento, un conjunto de células se puede medir a pH 7 en condiciones de formación de imágenes idénticos como un control. El uso de ningún intervalo y la exposición durante un tiempo con la duración de exposición necesaria para realizar el ensayo proporciona un control para determinar la extensión de photobleaching. Si photobleaching es mayor que 10% de la intensidad original, una curva de corrección se puede utilizar de la rata photobleaching observadoe recogiendo una marca temporal de la intensidad de fluorescencia. Para los eventos de inserción de vesículas individuales, receptores SEP-etiquetado en el tráfico de vesículas no se excitan hasta la fusión con la membrana plasmática, ya sea porque el pH dicta un estado apagado o que están fuera de la región TIRF de la excitación. Por lo tanto, septiembre etiquetada receptores no photobleach hasta la inserción, lo que permite una mayor potencia de excitación para ser utilizado con el fin de detectar moléculas individuales SEP.
En conclusión, esta técnica se puede utilizar con una variedad de tipos de células adherentes. Septiembre puede ser incorporado en prácticamente cualquier proteína de membrana, siempre y cuando las propiedades de la función de proteínas y tráfico se mantienen. TIRF mejora la resolución en la membrana plasmática. Septiembre permite la diferenciación de las proteínas etiquetadas situados en la membrana plasmática de los que están dentro del retículo endoplásmico periférica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
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