Summary
Märkning av den extracellulära domänen av ett membranprotein med en pH-känslig fluorofor, superecliptic pHluorin (september), tillåter subcellulära lokalisering, uttryck, och handel som skall bestämmas. Imaging september-märkta proteiner med total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM) möjliggör kvantifiering av proteinnivåer i det perifera ER och plasmamembranet.
Abstract
Förståelse membranprotein trafficking, montering och uttryck kräver en strategi som skiljer mellan de som bor i intracellulära organeller och de lokaliserade på plasmamembranet. Traditionella fluorescensbaserade mätningar saknar förmågan att skilja membranproteiner som är bosatta i olika organeller. Banbrytande metodik överskrida traditionella metoder genom koppling pH-känsliga fluoroforer med total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM). TIRF belysning exciterar provet upp till ungefär 150 nm från glas-prov gränsyta och därmed minska bakgrunden, vilket ökar signal-brusförhållandet, och öka upplösningen. Exciteringsvolymen i TIRFM omfattar plasmamembranet och närliggande organeller, såsom den perifera ER. Superecliptic pHluorin (SEP) är en pH-känslig version av GFP. Genetiskt kodande september in i den extracellulära domänen av ett membranprotein av intresse positionerar fluorofor påden luminala sidan av ER och i den extracellulära regionen av cellen. September är fluorescerande när pH är större än 6, men förblir i ett av-tillstånd vid lägre pH-värden. Därför receptorer märkta med september fluorescerar om den finns i det endoplasmatiska nätverket (ER) eller vid insättning i plasmamembranet (PM) men inte när begränsas till en handel vesikler eller andra organeller såsom Golgi. Den extracellulära pH kan justeras för att diktera fluorescensen av receptorer på plasmamembranet. Skillnaden i fluorescens mellan TIRF bilder vid neutralt och surt extracellulärt pH för samma cell motsvarar en relativ antal receptorer på plasmamembranet. Detta möjliggör en samtidig mätning av intracellulära och plasmamembran bosatta receptorer. Enda vesikel insättningshändelser kan också mätas när den extracellulära pH-värdet är neutralt, vilket motsvarar ett lågt pH trafficking vesikel sammansmältning med plasmamembranet och övergår i en fluorescerande tillstånd. denna versatile teknik kan utnyttjas för att studera lokalisering, uttryck, och handel med membranproteiner.
Introduction
Förändringar i receptoruttryck, distribution och montering har anslutits till en mängd olika sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, cystisk fibros, och narkotikamissbruk 1, 2, 3, 4, 5. Till exempel, nikotin och andra nikotinligander påverkar handeln med nikotinacetylkolinreceptorer (nAChRs) leder till förändringar i trafficking, uttryck, och uppreglering 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nikotin ökar det totala antalet hopsatta nAChRs inom en cell, ökar trafficking mot plasmamembranet, end förändrar sammansättningen av subenheter att gynna en hög känslighet version av vissa subtyper. Lösa tydliga förändringar i trafficking, montering, och uttryck av receptorer i en sjukdomsmodell ger viktiga mekanistiska detaljer som är nödvändiga för att definiera läkemedelsmål. En idealisk metod skulle snabbt skilja mellan intracellulära receptorer och de lokaliserade på plasmamembranet. Detta är speciellt utmanande i de fall där en majoritet av ett speciellt protein bosatt intracellulärt, såsom med nAChRs. Eftersom majoriteten av nAChRs är lokaliserade till det endoplasmatiska retiklet, traditionella mätningar saknar den spatio-temporala upplösningen som krävs för att sätta fingret på lokaliserings- och trafficking förändringar längs den sekretoriska vägen. Receptor handel och expressionsstudier av nAChRs har främst utförts med hjälp av radioligandbindning 11 biotinylering analyser 12, western blotting 13, eller immunoprecipitation techniq UE: ar 12. Dessa beror på bindningsspecificiteten för en reportermolekyl eller fixering av celler och saknar förmågan att samtidigt skilja mellan plasmamembranet bosatt och intracellulära receptorer. Därför har studier av jonkanaler montering och vesikel dynamik till stor del förlitat sig på låg genomströmning elektrofysiologiska tekniker 14.
Överlägsen rumslig och tidsmässig upplösning är möjlig med framsteg inom fluorescensmikroskopi. Genetiskt kodade reportermolekyler, såsom grönt fluorescerande protein (GFP) och dess varianter, eliminera icke-specifika bindnings frågor och öka känsligheten 15. En pH-känslig variant av GFP, känd som superecliptic pHluorin (september), kan användas för att utnyttja inneboende pH skillnader mellan fack inom en cell för att bestämma lokaliseringen 5, 7, 8,ref "> 9, 16, 17, 18. September fluorescerar när pH är högre än 6, men förblir i ett av-tillstånd vid lägre pH. Därför är receptorer märkta med september på sin luminala sidan detekteras när den är närvarande i det endoplasmatiska retiklet ( ER) eller vid insättning i plasmamembranet (PM), men inte när begränsad till en trafficking vesikeln. Manipulering av den extracellulära pH i kontakt med receptorer på plasmamembranet förändrar följaktligen fluorescensen och därför detektering av dessa receptorer. Om samma cell sekventiellt avbildas både en neutral extracellulärt pH och sedan ett pH lägre än 6, är skillnaden mellan bilderna skrivs receptorer på plasmamembranet. tillåter detta en samtidig mätning av intracellulära (perifer ER) och plasmamembran bosatta receptorer 5, 7, 8 p>, 9. Enda vesikler införande händelser kan också lösas när den extracellulära pH är neutralt. När ett lågt pH trafficking vesikel säkringar med plasmamembranet, är den luminala sidan av vesikeln exponeras för den neutrala extracellulära lösningen, vilket orsakar en övergång detekteras som en skur av fluorescens 7, 18, 19, 20. September möjliggör mätning av receptorer lokaliserade till plasmamembranet och perifer endoplasmatiska retiklet, och tillhandahåller ett medel för att mäta handel med receptorer mellan dessa subcellulära regioner 5, 7, 18.
För att uppnå högre upplösning vid plasmamembranet, är en receptor med September genetiskt kodad med bild genom total inre reflektion florescence mikroskopi (TIRFM). Denna metod är specielltanvändbart om de flesta receptorer är lokaliserade till intracellulära regioner, eftersom TIRFM ökar synligheten av plasmamembranet. TIRFM möjliggör även upplösningen för trafficking dynamiken i enstaka vesiklar som transporterar september-märkta receptorer vid införande i PM. Total inre reflektion inträffar vid gränsytan av material med olika brytningsindex, såsom mellan en cell och en glastäckglas 21, 22. September fluorescerar vid bestrålning med 488 nm excitation, som är orienterad för att uppnå total inre reflektion vid gränsytan mellan glaset och cellösningen. Detta ger en evanescent våg som penetrerar ungefär 150 nm i provet, bara spännande fluoroforer inom denna volym. Endast september receptorer i ett neutralt pH-miljö inom detta område av excitation upptäcks, motsvarar dem som är bosatta på plasmamembranet eller perifera endoplasmatiska retiklet. Eftersom upptäckt är begränsad to excitation av den evanescenta vågen, bakgrundsfluorescens från intracellulära regionen reduceras och signal-brusförhållandet ökas 21, 22. Dessutom, eftersom strålning tränger inte huvuddelen av cellen, fotoskada minimeras vilket möjliggör levande cell imaging under loppet av tiden. Som ett resultat, TIRFM kombination med genetiskt kodad september ger den höga upplösning och känslighet krävs för att mäta subcellulära lokalisering och trafficking dynamik membranreceptorer längs den sekretoriska vägen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling och transfektion
- Behåll mus neuroblastom 2a (N2a) celler i tillväxtmedier.
- Gör 500 ml N2a tillväxtmedier från 200 ml Dulbeccos Eagle-medium (DMEM) med hög glukoshalt, 250 ml reducerad serummedier, 50 ml fetalt bovint serum (FBS) och 5 ml penicillin / streptomycin (100x).
- Upprätthålla celler i en T75-flaska vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Split celler 1:15 vid behov, eller till cirka 80-90% konfluens. Detta är vanligtvis 2-3 gånger i veckan.
- Coat 35 mm glas nedre skålen med poly-D-lysin.
- I ett laminärt flöde biosäkerhet skåp, tillsätt 200 pl av 0,1 pg / ml poly-D-lysin på glas bottenområde steril 35 mm skål.
- Placera skålen i en 37 ° C inkubator under 1 timme.
- Skölj noga skålen med DDH 2 O 3-4 gånger.
- Tillåt rätter att helt torr för mer än en timme.
- Sterilize rätter med UV-ljus i biosäkerhet skåpet om det behövs.
- Plattan N2A-celler för TIRFM avbildning.
- Avlägsna tillväxtmedia från vidhäftande celler.
- Lösgöra cellerna från kolven genom inkubation med 1 ml 1x trypsin (+ EDTA) under 5 min vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Inaktivera trypsin genom tillsats av 9 ml odlingsmedier. Blanda media, trypsin och fristående celler med hjälp av en pipett.
- räkna visuellt celler med användning av en hemocytometer och beräkna den korrekta volymen för att lägga till 90.000 celler till varje poly-D-lysin belagda glaset nedre skålen. Denna densitet krävs för effektiv transfektion och enda cell TIRF avbildning.
- Tillsätt 2 ml tillväxtmedier till varje glas-nedre skålen innehållande 90.000 celler.
- Inkubera skålen vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator under 16 till 24 h.
- N2A transfektion
- Skaffa en plasmidkonstruktion innehållande en September fluorofor införlivasin i den extracellulära regionen av proteinet av intresse. Standardkloningstekniker såsom PCR-förstärkning 5 kan användas för att generera konstruktionen.
OBS: September bör införlivas i den extracellulära regionen av membranprotein, så att den befinner sig inuti hålrummet i det endoplasmatiska retiklet eller trafficking vesiklar och utsätts för extracellulär lösning när på plasmamembranet. September är ungefär lika stor som GFP och liknande kloningsstrategier kan användas. - Ersätta tillväxtmediet på strukna cellerna med 1,5 ml reducerad serum medier (t.ex., Opti-MEM), ca 30 min före tillsatsen av transfektionsreagens.
OBS: För att studera drog inducerade förändringar i receptorer, kan en lämplig koncentration av läkemedlet tillsättas vid tidpunkten för transfektion. - Tillsätt 500 ng av varje önskad plasmidkonstruktion till 250 pl reducerad serummedier (rör 1).
- Tillsätt 2 pl av transfektionsreagens till ett separat rör containing 250 pl av minskade serummedier. Inkubera röret 2 vid rumstemperatur under 5 min. Förhållandet av transfektionsreagens till plasmid-DNA bör optimeras för att uttrycka varje protein av intresse.
- Kombinera rören 1 och 2 för att göra en lösning innehållande 500 | il transfektionsreagens och plasmid mix. Inkubera vid rumstemperatur i 25 min.
- Tillsätt 500 | il transfektion mix till pre-strukna cellerna för en total volym av 2 ml per skål.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator under 24 timmar.
- Efter 24 timmar, ta bort transfektion mix och spola cellerna med tillväxtmedia och sedan tillsätt 2 ml tillväxtmedium till varje skål.
OBS: Om ett läkemedel tillsattes vid tiden för transfektion, kan den fyllas på igen vid detta steg. - Inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator under 24 timmar.
- Bildceller 48 timmar efter transfektion.
- Skaffa en plasmidkonstruktion innehållande en September fluorofor införlivasin i den extracellulära regionen av proteinet av intresse. Standardkloningstekniker såsom PCR-förstärkning 5 kan användas för att generera konstruktionen.
2. Levande cell imaging av Totalt Iinterna Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)
- Imaging inrätta
- Utföra avbildning med ett inverterat fluorescensmikroskop set-up med en avsökningssteget som visas i Figur 1. Detta kräver inriktning av en 488 nm DPSS laserkälla, till en stegmotor justera 488 nm strålposition, och en hög numerisk apertur (1,49 NA) 60X eller 100X oljeimmersionsobjektiv.
- Passera laserstrålen genom lämplig excitationsfilter (bandpass 488/10 nm). Rikta in polariserade laserstrålen genom en enkelmodfiber ansluten till en bärraket monterad på en stegmotor. I epifluorescence läge, är exciteringsstrålen centrerad i mitten av den bakre öppningen av målet.
- För att uppnå TIRF, använd stegmotor för att översätta den fokuserade laserstrålen över baksidan öppningen i objektivlinsen tills den kritiska vinkeln har nåtts och strålen inte längre överförs genom provet och i stället helt reflekteras från glas-cell-gränssnittet.
- Ta bilder med hjälp av en EMCCD (512 x 512 pixlar) kontrolleras med bildbehandlingsprogram (t.ex. Metamorph) med lämpligt filter emissions monterad i vägen emission (525/50 nm).
- Förbered bildlösning
- Förbereda 200 ml extracellulär lösning (ECS) genom att blanda 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES och 10 mM glukos i DDH 2 O. Stamlösningar av NaCl, KCl, MgCl2, och CaCl2 kan framställas i förväg och i kombination med färska HEPES och glukos på dagen för avbildning.
- Justera pH i en lösning innehållande 100 ml ECS till pH 7,4. Justera de återstående 100 ml av ECS till ett pH av 5,4. Skölj de transfekterade cellerna med 2 ml av ECS (pH 7,4).
- Tillsätt 2 ml av ECS (pH 7,4) till de transfekterade cellerna innan avbildning.
- Levande cell imaging i TIRF
- Slå på hela systemet, including 488 nm laser, kamera, översättningsstadiet och bildbehandlingsprogram. Fokusera epifluorescence trålen och justera strömmen till cirka 1 mW vid 60X mål.
- Tillsätt olja till målet och placera en skål med transfekterade celler vid omräkning scenen. Fäst skålen på plats med scen fästen för att säkerställa att det inte rör sig i förhållande till scenen så att cellerna kan avbildas flera gånger.
- I epifluorescence läget fokuserar mikroskopet och lokalisera fluorescerande, transfekterade celler. Celler kommer att fortsätta fokusera på flera fokus plan. Lokalisera enskilda, isolerade celler att gå vidare med TIRF.
- I bild programmet, ställ in exponeringstiden till 200 ms och optimera fluorescensintensiteten genom att ställa in EM vinst.
- Övergången av laserstrålen in i TIRF genom att översätta strålen över målet på ett stegvis sätt med användning av stegmotorn. Som den kritiska vinkeln närmar sig kommer strålen synbart översätta över kanten av skålen till dess att den konvergerar vid the punkt total inre reflektion på preparatplanet.
- Kontrollera att cellerna är i TIRF läge genom att justera fokuseringsvredet. I TIRF kan bara ett plan av celler fokuseras (dvs. ungefär 150 nm från glasgränssnitt), vilket ger en mycket definierad bild med hög upplösning av plasmamembranet.
- Avbildning september för att bestämma subcellulära lokalisering
- Leta friska, transfekterade, enstaka celler i bildplanet.
- Skaffa en fokuserad bild av cell vid pH 7,4. September märkta receptorer på plasmamembranet och endoplasmatiska nätverket ska vara synlig.
- Snabbt blockera laserstrålen från att nå prov för att förhindra fotoblekning.
- Memorera scenlägen som motsvarar varje cell med hjälp av mikroskop bildbehandlingsprogram kan registrera flera xy platser.
- Upprepa steg 2.4.1-2.4.4 för 20-30 celler per skål när du använder programmet för att registrera positionen för varje cell.
- After alla cellbilder vid pH 7,4 samlas in, manuellt ta bort pH 7,4 ECS lösningen med en pipett. Rör inte skålen eftersom detta kan flytta sparade scenlägen.
- Försiktigt 2 ml pH 5,4 ECS till skålen och vänta 10 minuter. Under denna tid, spara tidigare förvärvade bilder.
- Under identiska uppsättning villkor som används för att samla in bilder vid pH 7,4, flytta scenen till varje sparad position och förvärva en bild av samma cell vid pH 5,4. Celler bör se mindre definierat eftersom alla detekterade fluorescens som härrör från endoplasmatiska nätverket begränsas september märkta receptorer. Spara cellbilder pH 5.4.
- Imaging enstaka vesikler införande händelser i levande celler
- Byt tillväxtmedium av transfekterade celler med 2 ml pH 7,4 ECS, eller med Leibovitz L-15 media. PH i Leibovitz L-15 media är CO 2 oberoende, så att avbildning för att äga rum under en lång tidsperiod vid behov.
- place skålen av transfekterade celler på scenen i mikroskop. Säkert och fokusera en enda cell i TIRF följande steg 2,3 ovan.
- Om sådan finns, ställa in autofokus så att fokus inte glida under perioden av avbildning.
- Spela in en serie av 1000 ramar kontinuerligt ta bilder med en bildhastighet på 200 millisekunder. Skurar av fluorescens kommer att vara synlig under denna tid, vilket motsvarar låga pH trafficking vesiklar fusing med plasmamembranet, utsätta september till den extracellulära pH 7,4.
- Hitta en annan enskild cell och upprepa ovanstående steg. Återställ autofokus om nödvändigt.
3. Bildanalys och databehandling
- Analysera september fluorescens för att bestämma subcellulära lokalisering
- Öppna cellbilder med hjälp av ett bildanalysprogram såsom metamorfa eller ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Subtrahera bakgrund från både pH 5,4 och pH 7,4 bilder med hjälp av bollen inställningen rullning.
- Använda en intensitet baserade tröskeln för att kvantifiera fluorescens från en enda cell. manuellt välja en region av intresse runt cellen i pH 7,4 bilden.
- Mät cellområdet, medelintensitet och integrerad densitet med hjälp av en plugin i ImageJ eller använda den inbyggda "Measure" -funktion under fliken Analysera.
- Upprepa steg 3.1.1-3.1.3 för samma cell vid pH 5,4, noggrant justera intensiteten baserade tröskeln och regionen av intresse på samma sätt.
- Efter den integrerade densiteten erhålls för cellbilder på både pH 7,4 och 5,4, beräkna plasmamembranet integrerade densitet genom att subtrahera pH 5,4 värde från 7,4 värdet pH. Skillnaden motsvarar det relativa antalet receptorer på plasmamembranet inom TIRF exciteringsområdet.
- Som ett mått på trafficking, beräkna den relativa andelen av september märkta receptorer på plasmamembranet jämfört med de återstående receptorer synliga i TIRF excitatipå volymen genom att dividera den plasmamembran integrerad densitet genom hela den integrerade densiteten vid pH 7,4, multiplicerat med 100.
- Analysera enstaka vesikel insättningshändelser
- Öppna serie 1000 TIFF-bilder med hjälp av bildanalysmjukvara. Subtrahera bakgrund från alla ramar med bollen inställningen rullning.
- Justera färgbalansen på inspelningen för att maximera intensiva regioner som motsvarar vesikler insättningshändelser. Manuellt räkna skurar av fluorescens som varar längre än 3 bilder (> 600 ms).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
September införlivande i en receptor tillåter direkt detektion av denna receptor i en levande cell. Kopplad med TIRFM, ger detta en utvärdering av de relativa expressionsnivåerna på plasmamembranet och fördelningen av receptorer inom de subcellulära platser i regionen av TIRF excitation. Enstaka händelser vesikler människohandel kan också lösas.
Relativa uttrycksnivåer av september-märkta receptorer på plasmamembranet
September fluorescens vid excitering dikteras av pH-värdet hos den omgivande lösningen. När september fuseras med plasmamembranet inhemska receptorer, kan den extracellulära pH manipuleras för att stänga av denna fluorescens på eller av 5, 7, 8, 9, 17. när the pH av den extracellulära lösningen är en fysiologisk 7,4, receptorer från både plasmamembranet och det endoplasmatiska nätverket inom området för TIRF excitation fluorescera. Den extracellulära lösningen kan sedan utbytas med en i övrigt identisk lösning med pH 5,4. Detta medför att plasmamembranet bosatt september att övergången till en av staten, det vill säga alla observerade fluorescens är nu från det endoplasmatiska retiklet. Figur 2 visar ett exempel på celler avbildas vid både pH 7,4 (A) och pH 5,4 (B). Det relativa antalet receptorer på plasmamembranet jämfört med den perifera endoplasmatiska retiklet inom området för TIRF excitation beräknas därefter matematiskt genom att subtrahera den integrerade densiteten hos fluorescens vid pH 5,4 från den vid pH 7,4, som visas i fig 2C. Denna beräknade plasmamembranet integrerad densitet motsvarar det relativa antalet september-märkta receptorer på plasmamembranet och i TIRF excitationvolym. Eftersom plasmamembranet och närliggande perifer endoplasmatiskt retikulum kringgås preferentiellt exciteras med TIRF är detta subcellulära jämförelse fördelning mellan receptorer lokaliserade till dessa regioner, och inte hela intracellulära regionen av cellen.
Subcellulär Fördelning av september-märkta receptorer
Trafficking av receptorer kan mätas genom att jämföra förhållandet mellan receptorer belägna på plasmamembranet jämfört med det endoplasmatiska retiklet. Dividera plasmamembranet integrerad densitet genom hela den integrerade densiteten vid pH 7,4, multiplicerat med 100, ger en relativ procentandel av september-märkta receptorer belägna på plasmamembranet 5, 7. Som en kontroll, brefeldin A kan tillsättas till celler för att störa intracellulärt protein trafficking. När brefeldin A är närvarande, nästan alla av den detekterade receptors inom regionen TIRF excitation kommer att begränsas till det endoplasmatiska nätverket, vilket resulterar i en lägre% PM. Dessutom kan muteras (Δ508-I539T) cystisk fibros transmembranregulator (Δ508-I539T-CFTR) användas som en positiv kontroll. I närvaro av kommersiellt tillgängliga VX-809, Δ508-I539T-CFTR-expression på cellytan ökar 2 till 3-faldig.
Enkel Vesikel Inser Events
September inte fluorescerar eller ljusbleknings i det låga pH-värdet hos en transport vesikel, men återfår fluorescens vid exponering för ett extracellulärt pH av 7,4 vid plasmamembranet 7, 16, 18. Inser händelser visualiseras som en explosion av fluorescens vid plasmamembranet som varar minst 3 ramar (600 ms), vilket motsvarar full fusion av transport vesikeln i plasmamembranet, såsom visas i figur 3. Innan en insättning (Figur 3B), är ingen urskiljbar brast närvarande. En ökning i fluorescensintensitet ses som transport vesikeln anländer (figur 3C), diffunderar över membranet (Figur 3D - 3G), tills inkorporering i bulk fluorescensen av cellen (figur 3H - 3I).
Figur 1: Schematisk bild av TIRF mikroskop. Denna TIRF konfiguration använder en 488 nm DPSS laser för september excitation, fiber kopplad till en stegmotor för att justera den kritiska vinkeln för excitationsstrålen genom att översätta strålen tvärs över bakre öppningen av målet. Celler avbildas med en 60X, 1,49 NA oljeimmersionsobjektiv. Emission detekteras med hjälp av en elektron multiplicera Charge Coupled Device.filer / ftp_upload / 55466 / 55466fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Expression och handel på plasmamembranet. En N2a cell som uttrycker α3-Sep / β4-wt-nAChRs vid pH 7,4 (A) visar receptorer belägna på plasmamembranet och endoplasmatiskt retikulum. Vid pH 5,4 (B), behöver receptorer på plasmamembranet inte fluorescerar, så att bara det endoplasmatiska retiklet bosatta receptorer är synliga. Skillnaden mellan integrerade densitet vid pH 7,4 och pH 5,4 (C) motsvarar receptorer lokaliserade till plasmamembranet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Singel Blås Insertion Event. En N2a cell som uttrycker α3-september / p4-wt nAChRs med ett extracellulärt pH 7,4 visas i (A). Omedelbart före en insättning (B), är ingen explosion av fluorescens synlig. En handel vesikel som bär september anländer (C), och september-märkta receptorer diffundera över plasmamembranet (D - G), tills omöjlig att skilja från tidigare införda receptorer (H - I). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PH känslighet september möjliggör receptorer bosatta på plasmamembranet som skall särskiljas från intracellulära receptorer i det endoplasmatiska retiklet, och det kan användas för att lösa inser händelser av receptorbärande vesiklar 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Flera tekniker, inklusive yta biotinylering och ligandbindning används ofta för att mäta protein ytan nivåer. I vissa fall, kan western blottar också användas för att skilja mellan ER och PM bosatt protein. Detta september-baserad teknik är komplementär till traditionella mätningar, vilket ger en snabb avläsning av ytexpression och förmågan att kvantifiera förändringar i protein lokaliserade på ER till PM. Sedan september är genetiskt kodade i proteinet av intresse, problem med nonspecifik bindning elimineras och känsligheten ökas. September undergår 488 nm excitation vid neutralt pH, men är inte attraheras under sura betingelser med pH <6. När den extracellulära pH är 7,4, är fluorescens mäts för nAChRs är bosatta i det endoplasmatiska nätverket och på plasmamembranet, men inte för dem i de lägre pH-sekretoriska vesiklar eller Golgi (pH <6) 23. Under avbildning är ECS med pH 7,4 bytas ut mot en i övrigt identisk lösning vid pH 5,4. Skillnaden mellan den integrerade densiteten i dessa bilder är plasmamembranet integrerade densiteten hos en cell. Dividera detta tal med den totala integrerade densiteten inom området för TIRF excitation, vid pH 7,4, multiplicerat med 100 ger den procentuella på plasmamembranet 5, 7, 8, 9. Även om dessa studier använde TIRFM kan liknande analyser utföras med epi-fluorescens.För membranreceptorer som nAChR där en majoritet av receptorer är bosatta i ER är TIRM idealiskt eftersom den smala excitation volymen ökar fraktionen av synliga PM bosatta receptorer kontra intracellulära receptorer. Detta ökar analysens känslighet för förändringar i receptorfördelning mellan organeller. För proteiner med högre expressionsnivåer på PM, epi-fluorescens baserade SEP studier är tillräckliga för att mäta förändringar i receptorexpression. Men enstaka vesikler införande händelser som också mäts vid pH 7,4 kräva TIRFM. Den explosion av fluorescens som motsvarar den låga pH-handel vesikler sammansmältning med högre pH plasmamembranet medan lätt ses i TIRFM är normalt inte urskiljas i epi-fluorescens.
Införliva september med TIRF Imaging Villkor
September kan vara genetiskt införlivas i den extracellulära domänen av ett membranprotein. På grund av storleken och placeringen av september, är det viktigt att verif y att det modifierade proteinet inte avsevärt skiljer sig åt i trafficking eller funktion från en vild typ protein. Analyser bör utföras med september märkta proteinet att kontrollera att införlivandet av märkningen inte störa aktiviteten. För jonkanaler, elektrofysiologi och jonpermeabilitetsmätningar är idealiska, medan andra receptorer fluorescerande ligandbindning och western blotting kan användas för att verifiera trafficking. Vidhäftande celler är idealiska för transfektion med kommersiella transfektionsreagens och avbildning med TIRFM eftersom de fäster direkt på glaset nedre skålen. Denna fastsättning är nödvändig för att säkerställa TIRF excitation av evanescenta vågen inom ca 150 nm från glasprov gränssnitt. För att uppnå hög upplösning TIRF bilder, behöver provet att förbli oförändrad under avbildning 21. Poly-D-lysin beläggning är fördelaktig vid avbildning N2A-celler eftersom det ger en fästmatris som minimerar cellrörelser för att upprätthålla en plan ytalass = "xref"> 7. Bordläggning celltätheten måste optimeras för att säkerställa celler isoleras på glasskål att uppnå TIRF. Cell klustring hindrar total inre reflektion genom att förhindra platt cell vidhäftning i en enda optisk plan. Eftersom endast ett plan är inriktad i TIRF, är avgörande för avbildning upprätthålla god cellmorfologi. Detta är särskilt viktigt när lösningar byts i SEP studierna. För att minimera morfologiska förändringar, bilder vid pH 7,4 och pH 5,4 måste samlas in snabbt. Dessutom kommer ECS (pH 5,4) så småningom tränga intracellulära membran, förändra organell struktur och fluorescens interna september-märkta receptorer. Detta är lätt undvikas genom att samla bilder under varje pH skick inom några minuter. Data från flera rätter i samma bildsession kan kombineras för att öka antalet celler som analyserats. Vid byte lösningar, försiktigt bort pH 7,4 ECS lösning med en pipett och tillsätt pH 5,4 ECS droppvis till than skålen. Ta bort eller lägga lösning för snabbt kan betona celler eller flytta skålen med avseende på de sparade scenlägen. Ett perfusionssystem att utbyta lösningar kan också utnyttjas, så länge som lösningen utbyte är fullständig och sker snabbt. Exakta saltkoncentrationer i varje lösning för att minimera snedvridning cell. En scen top inkubator kan införlivas för att minska svängningar i temperaturen under avbildning.
TIRF Imaging
TIRF avbildning minskar bakgrundsfluorescens genom att fokusera på en enda optisk plan. Detta ökar signal-brusförhållandet genom att selektivt spännande fluoroforer inom ungefär 150 nm från glas-prov gränsyta 21, 22. Inom denna region, är upplösningen ökat kraftigt, särskilt vid plasmamembranet. Detta är nödvändigt om en majoritet av receptorer är lokaliserade intracellulärt. Om en hög fraktion av membranreceptorer ärligger på plasmamembranet, kan utnyttjas denna september baserad metod för att bestämma subcellulära lokalisering i epifluorescence. Men om en liten andel av de totala receptorer är trafikerade till plasmamembranet, såsom med nAChRs är TIRFM nödvändiga för att kvantifiera pH-beroende förändringar i fluorescens vid plasmamembranet. Dessutom tillåter TIRFM upplösningen av enstaka vesikler människohandel händelser och distribution av receptorer inom den sekretoriska vägen. En grundläggande TIRF inställnings utnyttjar en 488 nm DPSS laser för september excitation, fiber kopplad till en stegmotor för att justera den kritiska vinkeln för excitationsstrålen. För att uppnå TIR är balken översatt i sidled över bakre öppningen av målet till dess att en kritisk vinkel har uppnåtts. Celler avbildas med en 60X eller 100X, 1,49 NA oljeimmersionsobjektiv. En numerisk apertur högre än brytningsindexet hos provet (> 1,38 för celler) krävs för att uppnå den kritiska vinkel som krävs för TIRF. En 1,45 NA mål skulle räcka, men 1,49NA är mer praktiskt när manipulera vinkeln på excitation. Emission detekteras med hjälp av en elektron multiplicera laddningskopplad enhet (EMCCD) med en 8 mm matris 512 x 512 bildpunkter. Med hjälp av en 60X objektiv kan flera isolerade celler fångas inom ett synfält.
En av de stora nackdelarna att fluorescensbaserade studier av proteinuttryck är fotoblekning 15. Denna excitation inducerad nedbrytning av fluoroforen resulterar i en irreversibel minskning av fluorescensintensitet över tiden. Av denna anledning, förlitar sig framgångsrik avbildning på en ömtålig balans mellan intensiteten hos strålen av excitation och on-chip förstärkningen användas inom EMCCD. Exciteringsintensitet måste vara tillräckligt hög för att excitera en fluorofor för detektering, men inte så hög att den photobleach molekylen snabbt. Kamera förstärkning kan användas för att multiplicera signalen för upptäckt, i motsats till att öka exciteringsintensitet, men detta ökar även bakgrund iSPÄNNING. Dessutom måste man vara försiktig när man väljer de inställningar EM förstärkning, för att undvika mättnad av bilderna. I mellan mätningarna, blockering excitationsstrålen innan den når provet minimerar fotoblekning. Detta krävs när man samlar in cellbilder på en ECS med pH 7,4 att jämföra med pH 5,4. Fotoblekning som uppträder mellan de två bilderna är omöjlig att skilja från en brist av fluorescens på grund av pH-förändring, så denna effekt måste minimeras. Försiktighet bör vidtas för att använda låg lasereffekt och att exponera cellen endast för den tid som behövs för att fånga de nödvändiga bilderna. För varje experiment, kan en uppsättning av celler mätas vid pH 7 under identiska avbildningsbetingelser som en kontroll. Utan användning av intervall och exponering för en varaktighet som matchar den exponeringstid som behövs för att utföra analysen ger en kontroll för att bestämma graden av fotoblekning. Om fotoblekning är större än 10% av den ursprungliga intensitet, kan en korrigeringskurva användas från den observerade fotoblekning råttae genom att samla in en tidskurva för fluorescensintensitet. För enstaka vesikel införande händelser, september-märkta receptorer i människohandel blåsor är inte glada tills fusion med plasmamembranet, antingen på grund av pH dikterar en av staten eller de är utanför TIRF regionen excitation. Därför september taggade receptorer kommer inte photobleach tills insättningen, vilket tillåter högre excitation effekt som skall användas för att detektera enstaka SEP-molekyler.
Sammanfattningsvis kan denna teknik användas med en mängd olika adherenta celltyper. September kan införlivas i nästan alla membranprotein, så länge som proteinfunktion och trafficking egenskaper bibehålls. TIRF förbättrar upplösningen vid plasmamembranet. September tillåter differentiering av märkta proteiner belägna på plasmamembranet från de inom den perifera endoplasmatiska retiklet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom Petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60X, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25x36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A.
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y.
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
