Fluorescerende farvestofmærkning af erytrocytter og leukocytter til at studere strømdynamikken i muskelspiralcirkulation

Summary

Levende cellebilleddannelse af de mærkede blodceller i okulærcirkulationen kan give information om inflammation og iskæmi i diabetisk retinopati og aldersrelateret maculadegenerering. En protokol til mærkning af blodceller og billede af de mærkede celler i nethindecirkulationen er beskrevet.

Abstract

Den retinale og choroidale blodstrømdynamik kan give indsigt i patofysiologien og følgerne af forskellige okulære sygdomme, såsom glaukom, diabetisk retinopati, aldersrelateret maculadegeneration (AMD) og andre okulære inflammatoriske tilstande. Det kan også hjælpe med at overvåge de terapeutiske reaktioner i øjet. Den korrekte mærkning af blodcellerne, kombineret med levende celledannelse af de mærkede celler, muliggør undersøgelse af strømningsdynamikken i retinal og choroid cirkulation. Her beskriver vi de standardiserede protokoller af henholdsvis 1,5% indocyaningrøn (ICG) og 1% natriumfluoresceinmærkning af henholdsvis mus-erythrocytter og leukocytter. Scanning laser ophthalmoskopi (SLO) blev anvendt til at visualisere de mærkede celler i retinalcirkulationen af ​​C57BL / 6J mus (vildtype). Begge metoder demonstrerede tydelige fluorescensmærkede celler i mus-retinalcirkulationen. Disse mærkningsmetoder kan have bredere anvendelser i forskellige okulære sygdommemodeller.

Introduction

At studere blodcellernes strømningsdynamik i retinal og choroid cirkulation er afgørende for at forstå patogenesen af ​​potentielt synstruende okulære sygdomme og andre okulære inflammatoriske tilstande. De konventionelle angiografiteknikker, der involverer binding af fluorescerende farvestoffer til plasmaproteiner, tilvejebringer imidlertid ingen oplysninger om dynamikken af ​​erythrocytterne eller leukocytterne ¹ . Den erytrocytiske retinale strømningsdynamik er vigtig for at studere metabolisk effektiv cirkulation i nethinden og leukocytflowdynamikken til forståelse af cellemigration, genkendelse, vedhæftning og ødelæggelse under forskellige inflammatoriske tilstande ² . Der er flere fluorescerende molekyler anvendt til identifikation og karakterisering af forskellige celletyper ³ . Hemodynamikken af ​​blodcellerne kan måles ved farvning af dem med de passende fluorerCent farvestoffer og anvende de rette billeddannelsesteknikker ⁴ .

Tilstedeværelsen af ​​inflammatoriske responser i intraokulære sygdomme som aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og diabetisk retinopati (DR) involverer ophobning af lymfocytter i det syge område ^{5 , 6} . Sporing af immuncellerne i vævene kan hjælpe med at forstå de komplekse hændelser, der er involveret i sygdomspatogenesemekanismen. Radioaktive isotoper som ⁵¹ Cr og ¹²⁵ I blev anvendt som cellestoffer i tidlige studier. Disse farvestoffer er toksiske og påvirker cellens levedygtighed. Skønt de radioaktive markører ³ H og ¹⁴ C er mindre giftige for cellerne, er det på grund af deres lavere emissionsenergier vanskeligt at detektere deres signaler i systemet ^{7 , 8} . En række fluorochromfarvestoffer blev indført for at overvinde de potentielle problemer forbundet med wMed radioaktive markører og sporlymfocytmigrering in vitro under anvendelse af fluorescerende mikroskopi og flowcytometri ^{9 , 10} . Hoechst 33342 og thiazolorange er DNA-bindende fluorescerende farvestoffer, som anvendes til at spore lymfocytter in vivo. Hoechst 33342 binder til AT-rige regioner i DNA'et, er membrangennemtrængeligt, bevarer fluorescerende signaler i 2 – 4 dage og er modstandsdygtig over for slukning ^{9 , 10} . Ulemperne ved Hoechst 33342 og thiazolorange er inhiberingen af ​​lymfocytproliferation ¹¹ og den korte halveringstid henholdsvis ⁹ .

Calcein-AM, fluoresceindiacetat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (og -6) -carboxyfluorescein, acetoxymethylester (BCECF-AM), 5- (og -6) Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) og 5- (og -6) -carboxyfluoresceindiacetatacetoxymethylester (CFDA-AM)Er de cytoplasmatiske fluorescerende farvestoffer anvendt til lymfocytmigrationsundersøgelser. FDA, CFDA og CFDA-AM har imidlertid lavere retention i cellerne ⁹ . BCECF-AM reducerer det proliferative respons og påvirker kemotaxis- og superoxidproduktionen ^{9 , 12} . Calcein-AM er et fluorescerende farvestof og anvendeligt til kortvarige in vivo lymfocytmigrationsundersøgelser. Det udsender stærke fluorescerende signaler, interfererer ikke med de fleste af de cellulære funktioner og bevarer fluorescerende signaler i op til 3 dage ^{12 , 13} . Fluoresceinisothiocyanat (FITC) og carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFDA-SE) er kovalente koblings fluorescerende farvestoffer, som anvendes til lymfocytmigrationsstudier. FITC udviser ingen virkning på cellens levedygtighed og har en stærkere affinitet med B-lymfocytter end T-lymfocytter ^{14 , 15} </sup>. CFDA-SE-mærkede lymfocytter kan spores in vivo i mere end 8 uger og op til 8 celledele ^{9 , 16} . C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 og PKH26 er membran- Indsættelse af fluorescerende lipofile carbocyaninfarvestoffer anvendt til mærkning af leukocytter og erythrocytter. C18 Dil og DiO udviser højere signaler, når de inkorporeres i cellemembranen og er relativt ikke-toksiske ^{12 , 17} . PKH2-, PKH3- og PKH26-mærkede celler udviser en god retention af fluorescerende signaler med mindre toksicitet ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22} . Imidlertid regulerer PKH2 ned CD62L-udtrykket og reducerer ly Mphocyt-levedygtighed ²³ .

De fleste af de ovennævnte undersøgelser er blevet udført for at spore lymfocytmigrationen og proliferationen i lymfatika og studere de mærkede erytrocytter i den ikke-okulære cirkulation. Der er meget få undersøgelser, der anvender mærkningsteknikkerne til at studere blodcellerne i okulærcirkulationen. Anvendelse af scanning laser ophthalmoskopi (SLO) har en stor fordel ved at studere de mærkede celler i retinal og choroid cirkulation in vivo ved fundus angiography ²⁴ . Der er flere fluorescerende farvestoffer, såsom ICG, acridinorange, FITC, natriumfluorescein og CFDA, der anvendes til at studere leukocytterne i retinalcirkulationen ved SLO ^{25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,}Class = "xref"> 31 ^{, 32 , 33 , 34} . Fototoksiciteten og carcinogeniciteten af ​​acridinorange ^{26 , 27} , interferensen af ​​FITC med den cellulære aktivitet og behovet for et intravaskulært kontrastmiddel til opløsning af retinale og choroidale blodkar begrænser deres anvendelse i in vivo dyreforsøg ²⁹ . Natriumfluorescein og ICG er ikke-toksiske, godkendt af Food and Drug Administration, og er sikre til test på mennesker ^{32 , 35} . De fleste flowdynamiske undersøgelser er relateret til mærkning af leukocytterne eller erythrocytterne og dets visualisering i retinale og choroidale blodkar ^{36 , 37 , 38 , 39} </sop>. Her beskriver vi en standardiseret protokol for ICG-mærkning af erythrocytterne, natriumfluoresceinmærkning af leukocytterne og sporing af de visualiserede mærket celler i mus-retinalcirkulationen ved anvendelse af SLO.

Protocol

Dyreprotokollerne anvendt i denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle dyrepleje- og brugskomité for SingHealth, Singapore, og er i overensstemmelse med retningslinjerne fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklæring om brug af dyr i øjet og øjne Forskning. 1. Mærkning af erythrocytter og leukocytter med fluorescerende farvestoffer Fremstilling af reagenser Forbered ICG (1,5 mg / ml) ved at opløse 3 mg ICG i 1800 μL steriliseret…

Representative Results

Erythrocytter mærket med 1,5% ICG blev visualiseret i retinalcirkulationen af ​​C57BL / 6J mus (vildtype). Både 1% og 5% hæmatokrit af 1,5% ICG-mærket erythrocytter skelnes i retinalcirkulationen. De individuelle mærkede celler blev dog tydeligere visualiseret med 1% hæmatokrit af 1,5% ICG-mærket erythrocytter ( Figur 1 ). I 5% hæmatokrit var det ikke muligt at markere den enkelte celle på grund af det store antal mærkede celler i retinalkarren…

Discussion

At studere hæmodynamikken i retinal og choroid cirkulation er afgørende for at forstå patofysiologien i mange okulære sygdomme. Blodstrømningsdynamikken i nethindecirkulationen kan studeres ved Fourier-domæne optisk kohærens tomografi (FD-OCT), laser speckle flowgraphy (LSFG) og retinal oximetri. Selvom disse metoder bruger forskellige metoder til at studere den totale blodgennemstrømning i nethindecirkulationen ^{40 , 41 , 42<…}

Materials

Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green)	Sigma Aldrich	12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL	Novartis	U1705A/H-1330292
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade	1st BASE	BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood	BD, USA	REF 365974
Histopaque 1077 solution	Sigma Aldrich	10771
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	05-413-401
Microcentrifuge tubes 2mL	Axygen	MCT-200-C-S
Vortex mixer	Insta BioAnalytik pte. ltd	FINE VORTEX
Shaker incubator	Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL)	Ceva	KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml)	Troy Laboratories PTY. Limited	LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)	Alcon Laboratories, Inc. USA	NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%)	Alcon Laboratories, Inc. USA	NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin	Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines	SS-01T2613
Vidisic Gel 10G	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs	Assure medical disposables	7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2)	Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0	Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope	ZEISS	Model: axio imager z1