Fluorescerende fargemerking av erytrocytter og leukocytter for å studere strømdynamikken i musens retinalsirkulasjon

Summary

Levende cellebilder av de merkede blodceller i okulær sirkulasjon kan gi informasjon om betennelse og iskemi ved diabetisk retinopati og aldersrelatert makuladegenerasjon. En protokoll for å merke blodceller og bilde de merkede cellene i retinalsirkulasjonen er beskrevet.

Abstract

Retinal og choroidal blodstrømdynamikk kan gi innsikt i patofysiologien og følgerne av ulike okulære sykdommer, som for eksempel glaukom, diabetisk retinopati, aldersrelatert macular degenerasjon (AMD) og andre okulære inflammatoriske tilstander. Det kan også bidra til å overvåke terapeutiske responsene i øyet. Den riktige merking av blodcellene, kombinert med levende celledannelse av de merkede cellene, muliggjør undersøkelse av strømningsdynamikken i retinal og choroidal sirkulasjon. Her beskriver vi standardiserte protokoller av 1,5% indocyaningrønn (ICG) og 1% natriumfluorescein-merking av henholdsvis mus-erytrocytter og leukocytter. Scanning laser oftalmokopi (SLO) ble påført for å visualisere de merkede cellene i retinal sirkulasjonen av C57BL / 6J mus (villtype). Begge metoder demonstrerte tydelige fluorescensmerkede celler i muskelsirkulasjonen. Disse merkemetoder kan ha bredere anvendelser i ulike okulære sykdommermodeller.

Introduction

Studier av strømningsdynamikken til blodcellene i retinal og choroidal sirkulasjon er viktig for å forstå patogenesen av potensielt syn-truende okulære sykdommer og andre okulære inflammatoriske tilstander. Imidlertid gir de konvensjonelle angiografiteknikker, som involverer binding av fluorescerende fargestoffer til plasmaproteiner, ingen informasjon om dynamikken til erytrocyter eller leukocytter ¹ . Den erytrocytiske retinalstrømdynamikken er viktig for å studere metabolisk effektiv sirkulasjon i netthinnen, og leukocytflowdynamikken, for å forstå cellemigrering, anerkjennelse, vedheft og ødeleggelse i forskjellige inflammatoriske tilstander ² . Det finnes flere fluorescerende molekyler som brukes i identifisering og karakterisering av forskjellige celletyper ³ . Hemodynamikken til blodcellene kan måles ved å fargelegge dem med passende fluorerSent fargestoffer og anvende riktig bildebehandling teknikker ⁴ .

Tilstedeværelsen av inflammatoriske responser i intraokulære sykdommer som aldersrelatert macular degenerasjon (AMD) og diabetisk retinopati (DR) involverer akkumulering av lymfocytter i det sykeområde ^{5 , 6} . Sporing av immunceller i vevet kan bidra til å forstå de komplekse hendelsene som er involvert i sykdomspatogenesens mekanisme. Radioaktive isotoper som ⁵¹ Cr og ¹²⁵ I ble brukt som cellesporere i tidlige studier. Disse fargestoffene er toksiske og påvirker cellens levedyktighet. Selv om de radioaktive markørene ³ H og ¹⁴ C er mindre giftige for cellene, er det på grunn av deres lavere utslippsenergier vanskelig å oppdage deres signaler i systemet ^{7 , 8} . En rekke fluorokromfarger ble introdusert for å overvinne de potensielle problemene forbundet med wMed radioaktive markører og sporlymfocytmigrering in vitro ved bruk av fluorescensmikroskopi og strømningscytometri ^{9 , 10} . Hoechst 33342 og tiazolorange er DNA-bindende fluorescerende fargestoffer, som brukes til å spore lymfocytter in vivo. Hoechst 33342 binder seg til AT-rike regioner i DNA, er membran gjennomtrengelig, beholder fluorescerende signaler i 2 – 4 dager og er motstandsdyktig mot slukking ^{9 , 10} . Ulempene med Hoechst 33342 og tiazolorange er inhiberingen av lymfocytproliferasjon ¹¹ og den korte halveringstid henholdsvis ⁹ .

Calcein-AM, fluoresceindiacetat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-karboksyetyl) -5- (og -6) -karboksyfluorescein, acetoksymetylester (BCECF-AM), 5- (og -6) Karbokyfluoresceindiacetat (CFDA) og 5- (og -6) -karboksyfluoresceindiacetat-acetoksymetylester (CFDA-AM)Er de cytoplasmatiske fluorescerende fargestoffene som brukes til lymfocytmigreringsstudier. FDA, CFDA og CFDA-AM har imidlertid lavere retensjon i cellene ⁹ . BCECF-AM reduserer proliferativ respons og påvirker kjemotaksis og superoksydproduksjon ^{9 , 12} . Calcein-AM er et fluorescerende fargestoff og er nyttig for kortvarige in vivo lymfocytmigreringsstudier. Det avgir sterke fluorescerende signaler, forstyrrer ikke de fleste av de cellulære funksjonene og beholder fluorescerende signaler i opptil 3 dager ^{12 , 13} . Fluorescein-isotiocyanat (FITC) og karbokfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFDA-SE) er kovalente koblings fluorescerende fargestoffer som brukes til lymfocyttmigreringsstudier. FITC utviser ingen effekt på cellens levedyktighet og har sterkere affinitet med B-lymfocytter enn T-lymfocytter ^{14 , 15} </sup>. CFDA-SE-merkede lymfocytter kan spores in vivo i mer enn 8 uker og opptil 8 celleavdelinger ^{9 , 16} . C18 DiI (1,1'-dioktadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyaninperklorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 og PKH26 er membran- Innsetting av fluorescerende lipofile karbocyaninfarger som brukes til å merke leukocytter og erytrocytter. C18 Dil og DiO utviser høyere signaler når de innlemmes i cellemembranen og er relativt giftfri ^{12 , 17} . PKH2-, PKH3- og PKH26-merkede celler utviser en god retensjon av fluorescerende signaler med mindre toksisitet ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22} . Imidlertid regulerer PKH2 ned CD62L-uttrykket og reduserer ly Mfocyt levedyktighet ²³ .

De fleste av de ovennevnte studiene har blitt utført for å spore lymfocyttmigrasjonen og proliferasjonen i lymfatika og studere de merkede erytrocyter i den ikke-okulære sirkulasjon. Det er svært få studier som bruker merketeknikker for å studere blodcellene i okulær sirkulasjon. Anvendelse av skanning laser oftalmokopi (SLO) har en stor fordel ved å studere de merkede cellene i retinal og choroid sirkulasjon in vivo ved fundus angiography ²⁴ . Det finnes flere fluorescerende fargestoffer, slik som ICG, akridinorange, FITC, natriumfluorescein og CFDA som brukes til å studere leukocyttene i retinalsirkulasjonen ved SLO ^{25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,}Class = "xref"> 31 ^{, 32 , 33 , 34} . Fototoksisiteten og karsinogeniteten av akridinorange ^{26 , 27} , interferensen av FITC med den cellulære aktiviteten og kravet til et intravaskulært kontrastmiddel for oppløsning av retinale og koroidale blodkar begrenser deres anvendelse i in vivo dyreforsøk ²⁹ . Natriumfluorescein og ICG er giftfri, godkjent av Food and Drug Administration, og trygt for testing på mennesker ^{32 , 35} . De fleste av de flytende dynamiske studiene er relatert til merking av leukocytter eller erytrocytter og dets visualisering i retinale og koloride blodkar ^{36 , 37 , 38 , 39} </sopp>. Her beskriver vi en standardisert protokoll for ICG-merking av erytrocytter, natriumfluorescein-merking av leukocytene, og sporing av de visualiserte merkede cellene i mus-retinal-sirkulasjonen ved bruk av SLO.

Protocol

Dyreprotokollene som ble benyttet i denne studien ble godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk av SingHealth, Singapore, og er i samsvar med retningslinjene fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for bruk av dyr i øyelege og visjon Forskning. 1. Merking av erytrocytter og leukocytter med fluorescerende fargestoffer Fremstilling av reagenser Forbered ICG (1,5 mg / mL) ved å oppløse 3 mg ICG i 1800 μL sterilisert destillert vann. Tilset…

Representative Results

Erytrocyter merket med 1,5% ICG ble visualisert i retinal sirkulasjon av C57BL / 6J mus (villtype). Både 1% og 5% hematokrit av 1,5% ICG-merket erythrocytter ble skilt i retinal sirkulasjon. De individuelle merkede cellene ble imidlertid tydeligere visualisert med 1% hematokrit av 1,5% ICG-merkede erytrocytter ( Figur 1 ). I 5% hematokrit, på grunn av det store antall merkede celler i retinale kar, var det ikke mulig å markere den enkelte celle. Enkelte e…

Discussion

Å studere hemodynamikken i retinal og choroidal sirkulasjon er viktig for å forstå patofysiologien til mange okulære sykdommer. Blodstrømningsdynamikken i retinalsirkulasjonen kan studeres ved hjelp av Fourier-domene optisk koherens tomografi (FD-OCT), laserspjeld flowgraphy (LSFG) og retinaloksymetri. Selv om disse metodene bruker forskjellige tilnærminger for å studere total blodstrøm i retinalsirkulasjonen ^{40 , 41 , 42</su…}

Materials

Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green)	Sigma Aldrich	12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL	Novartis	U1705A/H-1330292
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade	1st BASE	BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood	BD, USA	REF 365974
Histopaque 1077 solution	Sigma Aldrich	10771
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	05-413-401
Microcentrifuge tubes 2mL	Axygen	MCT-200-C-S
Vortex mixer	Insta BioAnalytik pte. ltd	FINE VORTEX
Shaker incubator	Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL)	Ceva	KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml)	Troy Laboratories PTY. Limited	LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)	Alcon Laboratories, Inc. USA	NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%)	Alcon Laboratories, Inc. USA	NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin	Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines	SS-01T2613
Vidisic Gel 10G	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs	Assure medical disposables	7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2)	Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0	Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope	ZEISS	Model: axio imager z1