A imagem em células vivas das células sanguíneas marcadas na circulação ocular pode fornecer informações sobre inflamação e isquemia na retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. É descrito um protocolo para rotular as células do sangue e imagem das células rotuladas na circulação da retina.
A dinâmica da corrente retiniana e coroidal pode fornecer informações sobre a fisiopatologia e seqüelas de várias doenças oculares, como glaucoma, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD) e outras condições inflamatórias oculares. Também pode ajudar a monitorar as respostas terapêuticas no olho. A rotulagem adequada das células do sangue, juntamente com imagens de células vivas das células rotuladas, permite a investigação da dinâmica do fluxo na circulação retiniana e coróide. Aqui, descrevemos os protocolos padronizados de 1,5% de indocyanina verde (ICG) e 1% de marcação de fluoresceína de sódio de ratos eritrócitos e leucócitos, respectivamente. Foi aplicada a oftalmoscopia laser de varredura (SLO) para visualizar as células rotuladas na circulação da retina de camundongos C57BL / 6J (tipo selvagem). Ambos os métodos demonstraram células distintas marcadas fluorescentemente na circulação da retina do mouse. Estes métodos de rotulagem podem ter aplicações mais amplas em várias doenças ocularesModelos.
Estudar a dinâmica do fluxo das células sanguíneas na circulação retiniana e coróide é imperativo para a compreensão da patogênese de doenças oculares potencialmente ameaçadoras de visão e outras condições inflamatórias oculares. No entanto, as técnicas de angiografia convencional, que envolvem a ligação de corantes fluorescentes a proteínas plasmáticas, não fornecem nenhuma informação sobre a dinâmica dos eritrócitos ou leucócitos 1 . A dinâmica do fluxo da retina dos eritrócitos é importante para estudar a circulação metabolicamente eficiente na retina e a dinâmica do fluxo de leucócitos, para entender a migração celular, reconhecimento, adesão e destruição em várias condições inflamatórias 2 . Existem várias moléculas fluorescentes usadas na identificação e caracterização de vários tipos de células 3 . A hemodinâmica das células do sangue pode ser medida por coloração com as fluorescências apropriadasCorantes centrais e aplicando as técnicas adequadas de imagem 4 .
A presença de respostas inflamatórias em doenças intraoculares como a degeneração macular relacionada à idade (AMD) e a retinopatia diabética (DR) envolvem a acumulação de linfócitos na área doente 5,6. O rastreamento das células imunes nos tecidos pode ajudar a compreender os eventos complexos envolvidos no mecanismo da patogênese da doença. Os isótopos radioativos como 51 Cr e 125 I foram utilizados como traçadores celulares em estudos iniciais. Esses corantes são tóxicos e afetam a viabilidade celular. Embora os marcadores radioativos 3 H e 14 C sejam menos tóxicos para as células, devido às suas energias de emissão mais baixas, é difícil detectar seus sinais no sistema 7 , 8 . Uma série de corantes de fluorochrome foram introduzidos para superar os problemas potenciais associados wIth marcadores radioativos e acompanhar a migração de linfócitos in vitro usando microscopia fluorescente e citometria de fluxo 9 , 10 . Hoechst 33342 e laranja de tiazol são corantes fluorescentes que ligam DNA, que são utilizados para rastrear linfócitos in vivo. O Hoechst 33342 liga-se a regiões ricas em AT no DNA, é permeável à membrana, mantém os sinais fluorescentes durante 2 a 4 dias e é resistente à extinção 9 , 10 . As desvantagens do Hoechst 33342 e da laranja de tiazole são a inibição da proliferação de linfócitos 11 e a meia-vida curta, respectivamente 9 .
Calcein-AM, diacetate de fluoresceína (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (e -6) -carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo (BCECF-AM), 5- (e -6) Diacetate de carboxifluoresceína (CFDA) e éster de acetoximetilo de ácido 5- (e -6) -carboxifluoresceína (CFDA-AM)São os corantes fluorescentes citoplasmáticos utilizados para estudos de migração de linfócitos. No entanto, FDA, CFDA e CFDA-AM têm menor retenção nas células 9 . BCECF-AM reduz a resposta proliferativa e influencia a produção de quimiotaxia e superóxido 9 , 12 . Calcein-AM é um corante fluorescente e útil para estudos de migração de linfócitos in vivo a curto prazo. Ele emite sinais fluorescentes fortes, não interfere com a maioria das funções celulares e retém sinais fluorescentes por até 3 dias 12 , 13 . O isotiocianato de fluoresceína (FITC) e o éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA-SE) são corantes fluorescentes de acoplamento covalente, que são utilizados para estudos de migração de linfócitos. FITC não exibe nenhum efeito sobre a viabilidade celular e tem maior afinidade com os linfócitos B do que os linfócitos T 14 , 15 </suP>. Os linfócitos marcados com CFDA-SE podem ser rastreados in vivo por mais de 8 semanas e até 8 divisões de células 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3-tetrametilindocarbocanina perclorato), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanina perclorato), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 e PKH26 são membrana- Inserindo corantes de carbocyanina lipofílicos fluorescentes usados para rotular leucócitos e eritrócitos. C18 Dil e DiO exibem sinais mais elevados quando incorporados na membrana celular e são relativamente não tóxicos 12 , 17 . As células marcadas com PKH2, PKH3 e PKH26 exibem uma boa retenção dos sinais fluorescentes com menos toxicidade 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . No entanto, o PKH2 regula a expressão CD62L e reduz-se Viabilidade de mphocyte 23 .
A maioria dos estudos acima mencionados foram realizados para rastrear a migração e proliferação de linfócitos no linfatismo e estudar os eritrócitos marcados na circulação não ocular. Existem poucos estudos aplicando as técnicas de rotulagem para estudar as células sanguíneas na circulação ocular. A aplicação de oftalmose de laser de varredura (SLO) tem uma grande vantagem ao estudar as células marcadas na circulação retiniana e coróide in vivo pela angiografia do fundo 26. Existem vários corantes fluorescentes, como ICG, laranja de acridina, FITC, fluoresceína de sódio e CFDA que são utilizados para estudar os leucócitos na circulação da retina por SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . A fototoxicidade e a carcinogenicidade da laranja de acridina 26 , 27 , a interferência da FITC com a atividade celular e a exigência de um agente de contraste intravascular para a resolução dos vasos sanguíneos retinianos e coroidais limitam sua aplicação em experiências com animais in vivo 29 . A fluoresceína de sódio e o ICG são não tóxicos, aprovados pela Food and Drug Administration e seguros para testes em seres humanos 32 , 35 . A maioria dos estudos dinâmicos de fluxo estão relacionados à rotulagem dos leucócitos ou eritrócitos e sua visualização nos vasos sanguíneos da retina e coróide 36 , 37 , 38 , 39 </sUp>. Aqui, descrevemos um protocolo padronizado de rotulagem ICG dos eritrócitos, marcação com fluoresceína de sódio dos leucócitos e rastreamento das células marcadas visualizadas na circulação da retina do mouse usando SLO.
Estudar a hemodinâmica na circulação retiniana e coróide é vital para a compreensão da fisiopatologia de muitas doenças oculares. A dinâmica do fluxo sanguíneo na circulação da retina pode ser estudada por tomografia de coerência óptica de domínio de Fourier (FD-OCT), fluxografia de speckle laser (LSFG) e oximetria retiniana. Embora estes métodos utilizem diferentes abordagens para estudar o fluxo sanguíneo total na circulação da retina 40 , 41…
The authors have nothing to disclose.
O projeto de pesquisa foi financiado pela bolsa do New Investigator do National Medical Research Council (NMRC), em Cingapura. A equipe gostaria de reconhecer o treinamento de pesquisa fornecido ao Dr. Agrawal no Instituto de Oftalmologia (IOO), University College London (UCL) sob a Associação de Treinamento de Pesquisa no Exterior do National Research Research (NMRC) de novembro de 2012 a outubro de 2014 sob orientação do Prof. David Shima. O Dr. Agrawal adquiriu o conceito e habilidades para rotular as células e imagens em vivo no laboratório do Dr. Shima. Por conseguinte, a equipe gostaria de reconhecer supervisão e orientação durante a bolsa de treinamento do Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh e Dr. Daiju Iwata.
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
Shaker incubator | Lab Tech | ||
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |