Живые клетки меченых клеток крови при циркуляции глаз могут предоставить информацию о воспалении и ишемии при диабетической ретинопатии и возрастной макулярной дегенерации. Описан протокол для маркировки клеток крови и изображения меченых клеток в кровообращении сетчатки.
Динамика сетчатки и хориоидального кровотока может дать представление о патофизиологии и последствиях различных глазных заболеваний, таких как глаукома, диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) и другие воспалительные состояния глаз. Это также может помочь контролировать терапевтические реакции в глазу. Надлежащая маркировка клеток крови, в сочетании с визуализацией живых клеток меченых клеток, позволяет исследовать динамику потока в сетчатке и хориоидальной циркуляции. Здесь мы описываем стандартизированные протоколы 1,5% индоцианинового зеленого (ICG) и 1% флюоресцеиновой метки для мышей эритроцитов мышей и лейкоцитов соответственно. Сканирующая лазерная офтальмоскопия (SLO) применялась для визуализации меченых клеток в ретинальном кровообращении мышей C57BL / 6J (дикого типа). Оба метода продемонстрировали различные флуоресцентно меченные клетки в циркуляции сетчатки мыши. Эти методы маркировки могут иметь более широкое применение при различных заболеваниях глазмоделей.
Изучение динамики течения клеток крови в сетчатке и хориоидальной циркуляции необходимо для понимания патогенеза потенциально опасных для зрения глазных заболеваний и других глазных воспалительных состояний. Однако обычные методы ангиографии, которые связаны с связыванием флуоресцентных красителей с белками плазмы, не дают никакой информации о динамике эритроцитов или лейкоцитов 1 . Динамика потока сетчатки эритроцитов важна для изучения метаболически эффективной циркуляции в сетчатке и динамики потока лейкоцитов, для понимания миграции клеток, распознавания, адгезии и разрушения в различных воспалительных состояниях. Существует несколько флуоресцентных молекул, используемых при идентификации и характеристике различных типов клеток 3 . Гемодинамику клеток крови можно измерить, окрашивая их соответствующими флуоресценциямиИ применяя надлежащие методы визуализации 4 .
Наличие воспалительных реакций при внутриглазных заболеваниях, таких как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) и диабетическая ретинопатия (DR), включает накопление лимфоцитов в пораженной области 5 , 6 . Отслеживание иммунных клеток в тканях может помочь понять сложные события, связанные с механизмом патогенеза болезни. Радиоактивные изотопы, такие как 51 Cr и 125 I, использовались в качестве клеточных индикаторов в ранних исследованиях. Эти красители являются токсичными и влияют на жизнеспособность клеток. Хотя радиоактивные маркеры 3 H и 14 C менее токсичны для клеток, из-за их более низких энергий излучения трудно обнаружить их сигналы в системе 7 , 8 . Ряд флуорохромных красителей был введен для преодоления потенциальных проблем, связанных сС радиоактивными маркерами и миграцией трековых лимфоцитов in vitro с использованием флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии 9 , 10 . Hoechst 33342 и тиазол апельсин представляют собой связывающие ДНК флуоресцентные красители, которые используются для отслеживания лимфоцитов in vivo. Hoechst 33342 связывается с богатыми AT областями в ДНК, является мембранопроницаемой, сохраняет флуоресцентные сигналы в течение 2-4 дней и устойчив к тушению 9 , 10 . Недостатками Hoechst 33342 и тиазола оранжевого являются ингибирование пролиферации лимфоцитов 11 и короткий период полувыведения, соответственно 9 .
Кальцеин-AM, диацетат флуоресцеина (FDA), 2 ', 7'-бис- (2-карбоксиэтил) -5- (и -6) -карбоксифлуоресцеин, ацетоксиметиловый эфир (BCECF-AM), 5- (и -6) – Карбоксифлуоресцеиндиацетат (CFDA) и 5- (и -6) -карбоксифлуоресцеиндиацетат ацетоксиметиловый эфир (CFDA-AM)Являются цитоплазматические флуоресцентные красители, используемые для изучения миграции лимфоцитов. Однако FDA, CFDA и CFDA-AM имеют более низкое удерживание в клетках 9 . BCECF-AM снижает пролиферативный ответ и влияет на хемотаксис и продуцирование супероксида 9 , 12 . Кальцеин-AM – флуоресцентный краситель и полезен для краткосрочных исследований миграции лимфоцитов in vivo . Он излучает сильные флуоресцентные сигналы, не мешает большинству сотовых функций и сохраняет флуоресцентные сигналы на срок до 3 дней 12 , 13 . Флуоресцеиновый изотиоцианат (FITC) и карбоксифлуоресцеин-диацетатсукцинимидиловый эфир (CFDA-SE) представляют собой ковалентные связующие флуоресцентные красители, которые используются для изучения миграции лимфоцитов. FITC не оказывает влияния на жизнеспособность клеток и имеет более сильное сродство с В-лимфоцитами, чем Т-лимфоциты 14 , 15 </suр>. Маркированные лимфоциты CFDA-SE можно отследить in vivo в течение более 8 недель и до 8 клеточных делений 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианиновый перхлорат), DiO (3,3'-диоктадецилоксакарбоцианиновый перхлорат), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 и PKH26 являются мембранно- Вставляя флуоресцентные липофильные карбоцианиновые красители, используемые для маркировки лейкоцитов и эритроцитов. C18 Dil и DiO проявляют более высокие сигналы при включении в клеточную мембрану и относительно нетоксичны 12 , 17 . Меченые клетки PKH2, PKH3 и PKH26 демонстрируют хорошее удерживание флуоресцентных сигналов с меньшей токсичностью 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Однако PKH2 down регулирует экспрессию CD62L и уменьшает Жизнеспособность мфоцитов 23 .
Большинство вышеупомянутых исследований были проведены для отслеживания миграции и пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах и изучения меченых эритроцитов в неокрубальной циркуляции. Есть очень мало исследований, применяющих методы маркировки для изучения клеток крови в циркуляции глаз. Применение сканирующей лазерной офтальмоскопии (SLO) имеет большое преимущество при изучении меченых клеток в сетчатке и хориоидальной циркуляции in vivo андрогенологией дна. Существует несколько флуоресцентных красителей, таких как ICG, акридиновый апельсин, FITC, флюоресцеин натрия и CFDA, которые используются для изучения лейкоцитов в циркуляции сетчатки с помощью SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Фототоксичность и канцерогенность акридинового апельсина 26 , 27 , интерференция FITC с клеточной активностью и потребность внутрисосудистого контрастного агента для разрешения сетчатки и сосудистых сосудов ограничивают их применение в экспериментах на животных in vivo 29 . Флюоресцеин натрия и МКГ нетоксичны, одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами и безопасны для тестирования на людях 32 , 35 . Большинство динамических исследований потока связаны с маркировкой лейкоцитов или эритроцитов и его визуализацией в сетчатке и сосудистых сосудах 36 , 37 , 38 , 39 </sвверх>. Здесь мы описываем стандартизованный протокол маркировки ICG эритроцитов, флюоресцеиновую лейкоцитов натрия и отслеживание визуализированных меченых клеток в циркуляции сетчатки мыши с использованием SLO.
Изучение гемодинамики в сетчатке и хориоидальной циркуляции жизненно важно для понимания патофизиологии многих глазных заболеваний. Динамику кровотока в кровообращении сетчатки можно исследовать с помощью фурье-оптической когерентной томографии (FD-OCT), лазерной спекл-флюографии (LSFG…
The authors have nothing to disclose.
Исследовательский проект финансировался по гранту New Investigator от Национального совета по медицинским исследованиям (NMRC), Сингапур. Команда хотела бы поблагодарить доктора Агравала в Институте офтальмологии (IoO), Университетского колледжа Лондона (UCL) в рамках Национального исследовательского совета по медицинским исследованиям (NMRC) за период с ноября 2012 года по октябрь 2014 года под руководством профессора Дэвид Шима. Доктор Агравал приобрел концепцию и навыки для маркировки клеток и визуализации в лаборатории доктора Шимы. Команда, таким образом, будет признавать надзор и руководство во время обучения стипендиатам от профессора Дэвида Шимы, профессора Кенита Мейснера, доктора Питера Лунда и доктора Дайю Ивата.
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) – EDTA concentration – 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
Microcentrifuge tubes 2mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
Shaker incubator | Lab Tech | ||
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
Terumo syringe with needle 1cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
Vidisic Gel 10G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |