Summary

Модель переходной трансгенерации IL-8 для<em> В Виво</em> Долгосрочный мониторинг воспалительных реакций

Published: July 07, 2017
doi:

Summary

Описанный здесь способ позволяет визуализировать активацию IL-8-зависимого воспаления в легких мышей посредством неинвазивной биолюминесцентной визуализации (BLI). Одно и то же животное может быть подвергнуто BLI несколько раз в течение двух месяцев с момента доставки конструкции репортера люциферазы.

Abstract

Воспаление дыхательных путей часто ассоциируется с бактериальными инфекциями и является основным фактором, определяющим заболевание легких. Определение in vivo провоспалительных возможностей различных факторов является сложным и требует терминальных процедур, таких как бронхоальвеолярный лаваж и удаление легких для анализа in situ , исключая продольную визуализацию у той же мыши. Здесь воспаление легких индуцируется путем интратрахеальной инстилляции супернатанта культуры Pseudomonas aeruginosa (SN) у временно трансгенных мышей, экспрессирующих репортерный ген люциферазы под контролем гетерологичного промотора коровы IL-8. Экспрессия люциферазы в легких контролируется анализом биолюминесцентного изображения in vivo (BLI) в течение 2,5-48-часовой таймфрейма после инстилляции. Процедуру можно повторять несколько раз в течение 2 – 3 месяцев, что позволяет оценить воспалительную реакцию у одних и тех же мышей сНеобходимость прекращения животных. Такой подход позволяет контролировать про-и противовоспалительные факторы, действующие в легких в реальном времени, и представляется пригодным для функциональных и фармакологических исследований.

Introduction

Хронические заболевания легких, такие как астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), кистозный фиброз (CF) и бронхоэктазы, характеризуются воспалением дыхательных путей. Воспаление дыхательных путей характеризуется отеком, клеточной инфильтрацией, активацией Т-лимфоцитов и тучных клеток, увеличением выделения дыхательных путей и чрезмерным осаждением коллагена. CF является мультисистемным расстройством, и его основной причиной смертности и заболеваемости является бактериальная инфекция легких с увеличением обострения легочной артерии. Снижение функции легких предсказывает значительно худший результат 1 , 2 , 3 , 4 .

Состояние воспаления дыхательных путей обычно наблюдается путем оценки иммунологических маркеров, набранных во время воспалительного процесса, в материалах, полученных из нижних и верхних дыхательных путей, таких как мокрота, которая обеспечивает переменные resULTS. Бронхоскопия также выполняется 5 . Молекулы мурина являются ценными инструментами для исследования патогенеза и развития заболеваний, характеризующихся воспалением дыхательных путей, и для которых эффективные методы лечения или лечения еще не определены. Для изучения астмы и взаимодействия хозяина-патогена использовались животные модели инфекции легких и воспаления, включая роль химических веществ, которые имитируют состояние человека ( например, воздействие сигаретного дыма, LPS, эластаза, овальбумин, поли I: C и т. Д. , Как А также комбинации вышеуказанного). 6 . Измерение параметров, связанных с воспалением, требует жертвоприношения животных, так как необходимы инвазивные подходы для измерения таких факторов, как бактериальная нагрузка, цитокины в легких и собранная жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Кроме того, гистологические обследования часто требуются. Возможность получения информации о кинетике воспалительных реакций требует использования numМышей. Поэтому метод, позволяющий получать такую ​​информацию без необходимости жертвовать животными, ценен на технических, этических, экономических и эксплуатационных основаниях.

IL-8 является существенным игроком в процессе воспаления, рекрутируя лейкоциты в воспаленную ткань. Он представляет собой молекулярное считывание для изучения активации воспалительного пути. MIP-2 и KC могут быть функциональными гомологами человеческого IL-8 у мышей. Мыши экспрессируют только один потенциальный рецептор IL-8, гомолог человека CXCR2 7 , 8 , но они способны модулировать гетерологичный промотор гена IL-8, который управляет репортерным геном. Недавно была разработана модель мышиного воспаления легкого, после того как было обнаружено, что конструкция мышиного рецептора IL-8 / люциферазы может быть трансактивирована у мышей. Эта функция позволяет использовать биолюминесцентную визуализацию (BLI) для мониторинга воспалительного ответа при жизни9 .

Эта модель была адаптирована для изучения воспаления, вызванного бактериальными экзопроводами ( например, LPS или продуктами, высвобождаемыми бактериальными штаммами) или TNFalpha 10 , 11 . Процесс открытия лекарств ориентирован на разработку и оптимизацию старых и новых противовоспалительных молекул, которые могут лечить заболевания легких, такие как CF, астма и ХОБЛ. Эти новые химические объекты должны быть быстро и удобно протестированы на животных моделях, которые могут быть связаны с конкретными клиническими фенотипами, чтобы облегчить разработку интеллектуальных клинических испытаний.

Protocol

Все описанные эксперименты на животных были одобрены комитетом по животноводству для экспериментов на животных, проведенным Межведомственным центром службы экспериментальных исследований в Веронском университете и соответствовали Европейской директиве 2010/63 UE, итальянской версии D…

Representative Results

Модель транзиторной трансгенной мыши bIL-8-Luc использовалась для мониторинга in vivo воспаления легких у мышей, которым была назначена концентрированная бактериальная супернатант (30x), содержащий секретируемые факторы вирулентности. Индуцированный воспалительный о?…

Discussion

В предыдущей работе 11 был показан контраст между bIL-8-Luc-зависимыми BLI и BAL-маркерами. Он полагался на дифференциальную степень чувствительности внутри мышей 12 . По этой причине первое применение модели bIL-8-Luc к другому штамму мыши требует первоначального изучени…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана проектом итальянского проекта кистозного фиброза FFC № 18/2013, FFC № 29/2015 и итальянской линией мускулистого фиброза через Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.

Materials

FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 750 FAST Perkin Elmer Inc. NEV10001EX Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC Harlan Laboratories Italy Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector Promega E1751 Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent Polyplus transfection 201B-001G The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1g Perkin Elmer Inc. 122796 Protect from light, store at -20 °C
Living Image software Caliper Life Sciences, Experimental Builder
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit Bio-Rad Laboratories M60-009RDPD Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8 Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5ml Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 ml (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1ml Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

References

  1. Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
  2. Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
  3. Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
  4. Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
  5. Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
  6. Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
  7. Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
  8. Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
  9. Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
  10. Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
  11. Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
  12. De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).

Play Video

Cite This Article
Bergamini, G., Stellari, F., Sandri, A., M. Lleo, M., Donofrio, G., Ruscitti, F., Boschi, F., Sbarbati, A., Villetti, G., Melotti, P., Sorio, C. An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses. J. Vis. Exp. (125), e55499, doi:10.3791/55499 (2017).

View Video