Summary

En IL-8 Transient Transgenized Mouse Model for<em> In vivo</em> Langsiktig overvåking av inflammatoriske responser

Published: July 07, 2017
doi:

Summary

Metoden beskrevet her muliggjør visualisering av IL-8-promotoravhengig inflammasjonsaktivering i lungene av mus gjennom ikke-invasiv bioluminescensbilder (BLI). Det samme dyret kan bli utsatt for BLI flere ganger i opptil to måneder fra leveringstidspunktet til luciferase-reporterkonstruksjonen.

Abstract

Luftveisbetennelse er ofte forbundet med bakterielle infeksjoner og representerer en viktig determinant av lungesykdom. In vivo- bestemmelsen av de pro-inflammatoriske egenskapene til forskjellige faktorer er utfordrende og krever terminale prosedyrer, som for eksempel bronkoalveolær lavning og fjerning av lungene for in situ- analyse, utelukker langsgående visualisering i samme mus. Her blir lungebetennelse indusert ved intratracheal instillasjon av Pseudomonas aeruginosa kultursupernatant (SN) i transient transgeniserte mus som uttrykker luciferase reportergenet under kontroll av en heterolog IL-8 bovin promoter. Luciferaseuttrykk i lungen overvåkes ved in vivo bioluminescerende bilde (BLI) analyse over en 2,5- til 48-timers tidsramme etter instillasjonen. Prosedyren kan gjentas flere ganger innen 2 – 3 måneder, noe som gjør det mulig å evaluere den inflammatoriske responsen i de samme musene medUt behovet for å si opp dyrene. Denne tilnærmingen tillater overvåking av pro- og antiinflammatoriske faktorer som virker i lungen i sanntid og synes egnet for funksjonelle og farmakologiske studier.

Introduction

Kroniske lungesykdommer, som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), cystisk fibrose (CF) og bronkiektase, er preget av luftveisinflammasjon. Luftveisinflammasjon er preget av ødem, mobil infiltrering, T-lymfocytt og mastcelleaktivering, økte luftveis sekretjoner og overdreven kollagenavsetning. CF er en multisystemforstyrrelse, og dens viktigste årsak til dødelighet og sykelighet er lungebakterieinfeksjon med økende lungekremerasjon. Nedgangen i lungefunksjonen spår et betydelig dårligere resultat 1 , 2 , 3 , 4 .

Betennelsestilstanden i luftveiene oppdages vanligvis ved evaluering av immunologiske markører som rekrutteres under den inflammatoriske prosessen i materiale avledet fra nedre og øvre luftveier, slik som sputum, som gir variabel results. Bronkoskopier utføres også 5 . Murine-modeller er verdifulle verktøy for å undersøke patogenesen og utviklingen av sykdommer som er preget av luftveisinflammasjon, og for hvilke effektive behandlinger eller botemidler ennå ikke er identifisert. Dyremodeller av lungebetennelse og betennelse har blitt brukt til å studere astma og vertspatogen-interaksjoner, inkludert rollen som kjemikalier som simulerer menneskelige forhold ( f.eks. Eksponering av sigarettrøyk, LPS, elastase, ovalbumin, poly I: C, etc. , som Samt kombinasjoner av ovennevnte) 6 . Måling av betennelsesrelaterte parametre krever dyrene, da invasive tilnærminger kreves for å måle faktorer som bakteriell belastning, cytokiner i lungene og oppsamlet bronkoalveolær lavage (BAL) væske. Dessuten er det ofte kreves histologiske undersøkelser. Muligheten for å oppnå informasjon om inflammatorisk responskinetikk krever bruk av numØkende mus. Derfor er en teknikk som vil tillate å skaffe seg slik informasjon uten behov for å ofre dyrene verdifulle på tekniske, etiske, økonomiske og operative grunnlag.

IL-8 er en viktig spiller i betennelsesprosessen, og rekrutterer leukocytter til det betente vevet. Det representerer en molekylær avlesning for studiet av aktivering av inflammatorisk vei. MIP-2 og KC kan være funksjonelle homologer av human IL-8 hos mus. Mus uttrykker bare en potensiell IL-8-reseptor, en homolog av human CXCR2 7 , 8 , men de er i stand til å modulere en heterolog IL-8-genpromotor som driver et reportergen. En murinmodell med lungebetennelse har nylig blitt utviklet etter observasjonen at en bovine IL-8-promotor / luciferase-reporterkonstruksjon kan transaktiveres i mus. Denne funksjonen tillater bruk av bioluminescensbilder (BLI) for å overvåke den inflammatoriske responsen ved å leve aNimals 9 .

Denne modellen har blitt tilpasset for å studere betennelse utløst av bakterielle eksoprodukter ( f.eks. LPS eller produkter frigjort av bakteriestammer) eller TNFalpha 10 , 11 . Narkotikaforskningsprosessen er fokusert på utvikling og optimalisering av gamle og nye antiinflammatoriske molekyler som kan behandle lungesykdommer, som CF, astma og KOL. Disse nye kjemiske enhetene må raskt og bekvemt testes i dyremodeller som kan knyttes til spesifikke kliniske fenotyper for å lette utformingen av smarte kliniske forsøk.

Protocol

Alle dyreforsøkene som ble beskrevet, ble godkjent av den intramurale dyrevelferdsutvalget for dyreforsøk av Interdepartmental Center for eksperimentell forskningstjeneste ved Universitetet i Verona og i samsvar med europeisk direktiv 2010/63 UE, italiensk D.Lgs 26/2014 og den reviderte "Guide for pleie og bruk av laboratoriedyr", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Denne protokollen og eksperimenter ble godkjent av National Institutes of Health (n 273/15). Dyrene hadde fri adgang til standard gnag…

Representative Results

BIL-8-Luc forbigående transgen musemodell ble brukt til in vivo overvåking av lungebetennelse hos mus utfordret med konsentrert bakteriell supernatant (30x) som inneholdt utskillede virulensfaktorer. Den induserte inflammatoriske responsen ble detekterbar ved in vivo avbildning som en økning i BLI-signalet. Pro-inflammatorisk aktivitet var tydelig detekterbar 2,5 timer etter instillasjon, selv om BLI-signalet nådde den høyeste toppen mellom 5 og 24 timer og var for…

Discussion

I et tidligere arbeid 11 ble en kontrast mellom bIL-8-Luc-avhengige BLI og BAL markører vist. Den stod på differensialgraden av følsomhet innenfor musestammer 12 . Av denne grunn krever den første applikasjonen av bIL-8-Luc-modellen til en annen musestamme en første undersøkelse av den inflammatoriske responsen, både når det gjelder BLI og mer standardiserte inflammatoriske markører.

Mustransfeksjon forårsaker mild lungebetennelse og …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av det italienske Cystic Fibrosis Foundation Project FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 og av den italienske Cystic Fibrosis League gjennom Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta Contro Fibrosi Cistica Onlus.

Materials

FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 750 FAST Perkin Elmer Inc. NEV10001EX Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC Harlan Laboratories Italy Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector Promega E1751 Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent Polyplus transfection 201B-001G The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1g Perkin Elmer Inc. 122796 Protect from light, store at -20 °C
Living Image software Caliper Life Sciences, Experimental Builder
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit Bio-Rad Laboratories M60-009RDPD Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8 Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5ml Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 ml (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1ml Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

References

  1. Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
  2. Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
  3. Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
  4. Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
  5. Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
  6. Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
  7. Cacalano, G., et al. Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science. 265 (5172), 682-684 (1994).
  8. Simonet, W. S., et al. Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8. J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).
  9. Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PLoS One. 7 (6), e39716 (2012).
  10. Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
  11. Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
  12. De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS One. 9 (9), e106873 (2014).

Play Video

Cite This Article
Bergamini, G., Stellari, F., Sandri, A., M. Lleo, M., Donofrio, G., Ruscitti, F., Boschi, F., Sbarbati, A., Villetti, G., Melotti, P., Sorio, C. An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses. J. Vis. Exp. (125), e55499, doi:10.3791/55499 (2017).

View Video