Metoden beskrevet her muliggjør visualisering av IL-8-promotoravhengig inflammasjonsaktivering i lungene av mus gjennom ikke-invasiv bioluminescensbilder (BLI). Det samme dyret kan bli utsatt for BLI flere ganger i opptil to måneder fra leveringstidspunktet til luciferase-reporterkonstruksjonen.
Luftveisbetennelse er ofte forbundet med bakterielle infeksjoner og representerer en viktig determinant av lungesykdom. In vivo- bestemmelsen av de pro-inflammatoriske egenskapene til forskjellige faktorer er utfordrende og krever terminale prosedyrer, som for eksempel bronkoalveolær lavning og fjerning av lungene for in situ- analyse, utelukker langsgående visualisering i samme mus. Her blir lungebetennelse indusert ved intratracheal instillasjon av Pseudomonas aeruginosa kultursupernatant (SN) i transient transgeniserte mus som uttrykker luciferase reportergenet under kontroll av en heterolog IL-8 bovin promoter. Luciferaseuttrykk i lungen overvåkes ved in vivo bioluminescerende bilde (BLI) analyse over en 2,5- til 48-timers tidsramme etter instillasjonen. Prosedyren kan gjentas flere ganger innen 2 – 3 måneder, noe som gjør det mulig å evaluere den inflammatoriske responsen i de samme musene medUt behovet for å si opp dyrene. Denne tilnærmingen tillater overvåking av pro- og antiinflammatoriske faktorer som virker i lungen i sanntid og synes egnet for funksjonelle og farmakologiske studier.
Kroniske lungesykdommer, som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), cystisk fibrose (CF) og bronkiektase, er preget av luftveisinflammasjon. Luftveisinflammasjon er preget av ødem, mobil infiltrering, T-lymfocytt og mastcelleaktivering, økte luftveis sekretjoner og overdreven kollagenavsetning. CF er en multisystemforstyrrelse, og dens viktigste årsak til dødelighet og sykelighet er lungebakterieinfeksjon med økende lungekremerasjon. Nedgangen i lungefunksjonen spår et betydelig dårligere resultat 1 , 2 , 3 , 4 .
Betennelsestilstanden i luftveiene oppdages vanligvis ved evaluering av immunologiske markører som rekrutteres under den inflammatoriske prosessen i materiale avledet fra nedre og øvre luftveier, slik som sputum, som gir variabel results. Bronkoskopier utføres også 5 . Murine-modeller er verdifulle verktøy for å undersøke patogenesen og utviklingen av sykdommer som er preget av luftveisinflammasjon, og for hvilke effektive behandlinger eller botemidler ennå ikke er identifisert. Dyremodeller av lungebetennelse og betennelse har blitt brukt til å studere astma og vertspatogen-interaksjoner, inkludert rollen som kjemikalier som simulerer menneskelige forhold ( f.eks. Eksponering av sigarettrøyk, LPS, elastase, ovalbumin, poly I: C, etc. , som Samt kombinasjoner av ovennevnte) 6 . Måling av betennelsesrelaterte parametre krever dyrene, da invasive tilnærminger kreves for å måle faktorer som bakteriell belastning, cytokiner i lungene og oppsamlet bronkoalveolær lavage (BAL) væske. Dessuten er det ofte kreves histologiske undersøkelser. Muligheten for å oppnå informasjon om inflammatorisk responskinetikk krever bruk av numØkende mus. Derfor er en teknikk som vil tillate å skaffe seg slik informasjon uten behov for å ofre dyrene verdifulle på tekniske, etiske, økonomiske og operative grunnlag.
IL-8 er en viktig spiller i betennelsesprosessen, og rekrutterer leukocytter til det betente vevet. Det representerer en molekylær avlesning for studiet av aktivering av inflammatorisk vei. MIP-2 og KC kan være funksjonelle homologer av human IL-8 hos mus. Mus uttrykker bare en potensiell IL-8-reseptor, en homolog av human CXCR2 7 , 8 , men de er i stand til å modulere en heterolog IL-8-genpromotor som driver et reportergen. En murinmodell med lungebetennelse har nylig blitt utviklet etter observasjonen at en bovine IL-8-promotor / luciferase-reporterkonstruksjon kan transaktiveres i mus. Denne funksjonen tillater bruk av bioluminescensbilder (BLI) for å overvåke den inflammatoriske responsen ved å leve aNimals 9 .
Denne modellen har blitt tilpasset for å studere betennelse utløst av bakterielle eksoprodukter ( f.eks. LPS eller produkter frigjort av bakteriestammer) eller TNFalpha 10 , 11 . Narkotikaforskningsprosessen er fokusert på utvikling og optimalisering av gamle og nye antiinflammatoriske molekyler som kan behandle lungesykdommer, som CF, astma og KOL. Disse nye kjemiske enhetene må raskt og bekvemt testes i dyremodeller som kan knyttes til spesifikke kliniske fenotyper for å lette utformingen av smarte kliniske forsøk.
I et tidligere arbeid 11 ble en kontrast mellom bIL-8-Luc-avhengige BLI og BAL markører vist. Den stod på differensialgraden av følsomhet innenfor musestammer 12 . Av denne grunn krever den første applikasjonen av bIL-8-Luc-modellen til en annen musestamme en første undersøkelse av den inflammatoriske responsen, både når det gjelder BLI og mer standardiserte inflammatoriske markører.
Mustransfeksjon forårsaker mild lungebetennelse og …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av det italienske Cystic Fibrosis Foundation Project FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 og av den italienske Cystic Fibrosis League gjennom Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta Contro Fibrosi Cistica Onlus.
FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Protect from light, store the probe at 4 °C |
Female inbred BalbC | Harlan Laboratories Italy | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
bIL-8-Luc plasmid | Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy | Store the plasmid at -20 °C | |
pGL3basic vector | Promega | E1751 | Store the vector at -20 °C |
JetPEI DNA transfection reagent | Polyplus transfection | 201B-001G | The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7 |
D-luciferin potassium salt 1g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Protect from light, store at -20 °C |
Living Image software | Caliper Life Sciences, | Experimental Builder | |
Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Store the unopened kit at 4 °C |
Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
Gas anesthesia system XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
Syringe without needle 5ml | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by a scissors |
Hamilton 0,10 ml (model 1710) | Gastight | 81022 | |
Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
Syringe with needle 1ml | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
Plastic feeding tubes 18ga x 50mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |