Summary

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em> In Vivo</em> Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Published: July 07, 2017
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Summary

O método aqui descrito permite a visualização da ativação da inflamação dependente do promotor de IL-8 nos pulmões de camundongos através de imagem de bioluminescência não-invasiva (BLI). O mesmo animal pode ser submetido a BLI várias vezes por até dois meses a partir do momento da entrega da construção repórter de luciferase.

Abstract

A inflamação das vias aéreas é freqüentemente associada a infecções bacterianas e representa um importante determinante da doença pulmonar. A determinação in vivo das capacidades pró-inflamatórias de vários fatores é desafiadora e requer procedimentos terminais, como lavagem broncoalveolar e remoção de pulmões para análise in situ , impedindo a visualização longitudinal no mesmo mouse. Aqui, a inflamação do pulmão é induzida através da instilação intratraqueal do sobrenadante de cultura de Pseudomonas aeruginosa (SN) em camundongos transitórios transgenizados que expressam o gene repórter de luciferase sob o controle de um promotor bovino de IL-8 heteróloga. A expressão da luciferase no pulmão é monitorada por análise de imagem bioluminescente in vivo (BLI) em um período de 2,5 a 48 h após a instilação. O procedimento pode ser repetido várias vezes em 2 a 3 meses, permitindo a avaliação da resposta inflamatória nos mesmos ratos comA necessidade de terminar os animais. Esta abordagem permite o monitoramento de fatores pró e anti-inflamatórios atuando no pulmão em tempo real e parece adequado para estudos funcionais e farmacológicos.

Introduction

Doenças pulmonares crônicas, como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (FC) e bronquiectasias, são caracterizadas por inflamação das vias aéreas. A inflamação das vias aéreas é caracterizada por edema, infiltração celular, ativação de linfócitos T e mastócitos, aumento das secreções das vias aéreas e deposição excessiva de colágeno. A FC é uma desordem multissistêmica e sua principal causa de mortalidade e morbidade é a infecção bacteriana do pulmão com aumento da exacerbação pulmonar. O declínio da função pulmonar prevê um resultado significativamente mais desfavorável 1 , 2 , 3 , 4 .

O estado inflamatório do trato respiratório geralmente é observado através da avaliação de marcadores imunológicos recrutados durante o processo inflamatório em material derivado das vias aéreas inferior e superior, como o escarro, que fornece res variávelUlts. Broncoscopias também são realizadas 5 . Os modelos murinos são ferramentas valiosas para investigar a patogênese e a evolução das doenças caracterizadas pela inflamação das vias aéreas e para as quais tratamentos ou curas efetivos ainda não foram identificados. Modelos animais de infecção pulmonar e inflamação têm sido utilizados para estudar a asma e as interações hospedeiro-patógeno, incluindo o papel dos produtos químicos que simulam condições humanas ( por exemplo, exposição ao fumo do cigarro, LPS, elastase, ovalbumina, poli I: C, etc. Bem como combinações do acima) 6 . A medida dos parâmetros relacionados à inflamação requer o sacrifício dos animais, uma vez que são necessárias abordagens invasivas para medir fatores como carga bacteriana, citoquinas nos pulmões e líquido lavado broncoalveolar coletado (BAL). Além disso, os exames histológicos são freqüentemente necessários. A possibilidade de obter informações sobre a cinética de resposta inflamatória requer o uso de numRatos erosos. Portanto, uma técnica que permita obter essa informação sem a necessidade de sacrificar os animais é valiosa em bases técnicas, éticas, econômicas e operacionais.

A IL-8 é um jogador essencial no processo de inflamação, recrutando leucócitos para o tecido inflamado. Representa uma leitura molecular para o estudo da ativação da via inflamatória. MIP-2 e KC podem ser homólogos funcionais de IL-8 humana em camundongos. Os ratos expressam apenas um potencial receptor de IL-8, um homólogo de CXCR2 7 humano , 8 , mas são capazes de modular um promotor de gene de IL-8 heteróloga que conduz um gene repórter. Um modelo murino de inflamação pulmonar foi recentemente desenvolvido após a observação de que uma construção repórter de IL-8 bovina / repórter de luciferase pode ser transactivada em camundongos. Este recurso permite a utilização de imagens de bioluminescência (BLI) para monitorar a resposta inflamatória ao viver umNimals 9 .

Este modelo foi adaptado para estudar a inflamação desencadeada por exoprodutos bacterianos ( por exemplo, LPS ou produtos liberados por estirpes bacterianas) ou TNFalpha 10 , 11 . O processo de descoberta de drogas está focado no desenvolvimento e otimização de moléculas anti-inflamatórias antigas e novas que podem tratar doenças pulmonares, como CF, asma e DPOC. Essas novas entidades químicas devem ser testadas rápida e convenientemente em modelos animais que podem ser vinculados a fenótipos clínicos específicos para facilitar o projeto de ensaios clínicos inteligentes.

Protocol

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo comité intramural de bem-estar animal para experimentação animal pelo Centro Interdepartamental de Serviço de Pesquisa Experimental na Universidade de Verona e cumprem a Diretiva Européia 2010/63 UE, D.Lgs 26/2014 italiano e a revista "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Este protocolo e experimentação foram aprovados pelos Institutos Nacionais de Saúde (n 273/15). Os animai…

Representative Results

O modelo de rato transgênico transiente BIL-8-Luc foi usado para o monitoramento in vivo da inflamação pulmonar em camundongos desafiados com sobrenadante bacteriano concentrado (30x) contendo fatores de virulência segregados. A resposta inflamatória induzida foi detectada por imagem in vivo como um aumento no sinal BLI. A atividade pró-inflamatória foi claramente detectável 2,5 h pós-instilação, embora o sinal BLI atingisse o pico mais alto entre 5 e 24 h e …

Discussion

Em um trabalho anterior 11 , mostrou-se um contraste entre os marcadores BLI e BAL dependentes de BIL-8-Luc. Baseou-se no grau diferencial de sensibilidade dentro das cepas de mouse 12 . Por esta razão, a primeira aplicação do modelo bIL-8-Luc a uma estirpe de rato diferente requer um estudo inicial da resposta inflamatória, tanto em termos de BLI quanto em marcadores inflamatórios mais padronizados.

A transfecção de ratos causa inflama?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Falsificação Física Fibrosis da Fisicologia Cística # 18/2013, FFC # 29/2015 e pela Liga Italiana de Fibrose Cística através do Veneto Branch-Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.

Materials

FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 750 FAST Perkin Elmer Inc. NEV10001EX Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC Harlan Laboratories Italy Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector Promega E1751 Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent Polyplus transfection 201B-001G The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1g Perkin Elmer Inc. 122796 Protect from light, store at -20 °C
Living Image software Caliper Life Sciences, Experimental Builder
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit Bio-Rad Laboratories M60-009RDPD Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8 Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5ml Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 ml (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1ml Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

References

  1. Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
  2. Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications. Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).
  3. Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies. Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).
  4. Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease. Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).
  5. Sagel, S. D. Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).
  6. Starkey, M. R., et al. Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).
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  10. Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
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Cite This Article
Bergamini, G., Stellari, F., Sandri, A., M. Lleo, M., Donofrio, G., Ruscitti, F., Boschi, F., Sbarbati, A., Villetti, G., Melotti, P., Sorio, C. An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses. J. Vis. Exp. (125), e55499, doi:10.3791/55499 (2017).

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