공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출
Summary
이 프로토콜은 포유 동물 세포에서 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)의 내재화 초점 현미경 검출을 설명한다. 이것은 기본적인 세포 배양, 형질 전환, 및 공 초점 현미경 절차를 포함하는 융합 발현 GPCR의 세포 내 위치 파악 및 내재화를 검출하는 효율적이고 쉽게 해석 방법을 제공한다.
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
세포를 수송하는화물 피킹 기계를 가지고 세포 외 물질 – 리간드 등, 미생물 영양분, 및 막 관통 단백질 -로 정보, 에너지 및 다른 목적 1,2 셀있다. 그것은 세포 항상성, 조직의 기능, 및 전체 세포 생존에 중요하다. 형광 융합 단백질의 세포 – 기반 표현은 신호 경로 (3)의 위치 파악 및 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)와 같은 막 횡단 수용체의 내재화를 연구 할 수있는 강력한 방법이다.
직접 형광 검출 기술과 결합 된 해파리 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터의 녹색 형광 단백질 (GFP)로 태그 된 융합 단백질의 발현은, 넓은 수용을 얻은 단백질 타겟팅 연구 4, 5, 6. GFP 기반 detecti에는 고정 아티팩트 (7)을 피하면서 살아있는 세포의 실시간 영상을 허용하는 장점이있다. 다목적 클로닝 벡터 일련 9는 다양한 세포 8에 GFP 단백질 융합체의 발현을 용이하도록 구성되어있다. 및 pEGFP-N1 벡터는 포유류 세포에서보다 밝은 형광 발현 야생형 GFP에서 최적화 된 개선 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 코딩하는 널리 상용화 된 플라스미드 벡터이다. EGFP의 형광 신호가 포유 동물 세포에서 발현 관찰, 형광 현미경, 바람직하게는 공 촛점 현미경으로 488 nm에서 여기 및 507 nm에서의 방출과 함께 이루어져야한다.
세포 내 위치 파악 및 수용체의 리간드 – 매개 된 내재화를 모니터링 된 GPCR (10)의 신호 전달과 기능을 조사하기 위해 일반적인 기법 </s11>까지. 대부분의 경우에는 내재화 된 GPCR의 탈감작 (작용제의 존재에도 불구하고, 자극 반응의 감쇠) (12, 13)로 이끈다. 내재화 수용체 리소좀에 통합 저하하거나 수용체는 상기 실험에서 사용 된 세포주의 특성에 따라 다시 세포 표면에 재활용 될 수 수있다.
고나 도트로 핀 방출 호르몬 수용체 (GnRHRs)는 GPCR 패밀리에 속하고, 세포 외 아미노 말단 세포 내 -COOH 단자 전형적인 GPCR 단백질 구조를 가지고 있고, 일곱 막 횡단 (TM)는 14 도메인들. (Sepiella 자포니카에서 GnRHR 유전자) 재조합 플라스미드 Sj에 GnRHR-EGFP의 형질 감염 및 (HEK293 세포에서 발현) EGFP 태깅 에스 GnRHR 공 초점 현미경의 검출은 기존에보고 된교활한 및 GFP 형광은 막 횡단 단백질 제이션 분석법 15 기자로 설치되었다. 이제, S. 자포니카 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에 Sj에)에 의해 활성화 Sj에 GnRHR의 내재화는 공 촛점 현미경으로 시간 및 용량 – 의존적 방식으로 입증되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 HEK293 세포에서 세포 내 발현 및 위치 파악 GPCR 융합 단백질의 내재화를 검출하는 효율적이고 쉽게 해석 방법을 제공한다. 이 기술은 쉽게 HEK293 세포 BMN 및 봄 빅스 모리 (16)로부터 corazonin 수용체의 세포 내재화 제이션을위한 많은 다른 유전자와 세포 유형에 대해 적응 될 수있다.
이 강력한 분석의 성공적인 응용 프로그램은…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
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