Summary
Slim tilsluttet luftvejene hos cystisk fibrose (CF) patienter er et ideelt miljø for mikrobielle patogener at trives. Manuskriptet beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til at studere CF lunge microbiome i et miljø, der efterligner hvor de forårsager sygdom og hvordan ændringer i kemiske forhold kan køre mikrobielle dynamik.
Abstract
Mange kroniske luftvejssygdomme resulterer i slimplugning af luftvejene. Lunger af en person med cystisk fibrose er et eksempel på tilfælde, hvor deres slimpluggede bronchioler skaber et gunstigt habitat for mikrobiell kolonisering. Forskellige patogener trives i dette miljø interagerer med hinanden og kører mange af symptomerne forbundet med CF sygdom. Ligesom ethvert mikrobielt samfund har de kemiske forhold i deres habitat en betydelig indvirkning på samfundets struktur og dynamik. For eksempel trives forskellige mikroorganismer i forskellige niveauer af ilt eller andre opløste koncentrationer. Dette gælder også i CF lungen, hvor iltkoncentrationer antages at drive samfundsfysiologi og struktur. De her beskrevne metoder er designet til at efterligne lungemiljøet og dyrke patogener på en måde, der ligner det, hvorfra de forårsager sygdom. Manipulation af disse mikrobers kemiske omgivelser bruges til at studere, hvordan kemienStry af lungeinfektioner styrer sin mikrobielle økologi. Metoden, kaldet WinCF-systemet, er baseret på kunstigt sputummedium og smalle kapillærrør, der er beregnet til at tilvejebringe en oxygengradient svarende til den, der findes i slimpluggede bronchioler. Manipulerende kemiske tilstande, såsom mediernes pH i sputumet eller antibiotikapresset, muliggør visualisering af de mikrobiologiske forskelle i disse prøver ved anvendelse af farvede indikatorer, overvågning af gas- eller biofilmproduktion eller ekstraktion og sekventering af nukleinsyreindholdet i hver prøve.
Introduction
Den i dette manuskript metode kaldes WinCF systemet 1. Det overordnede mål med WinCF er at give en forsøgsopstilling i stand til at simulere miljøet i en slim-fyldte lunge bronchiole. Dette vil muliggøre et bearbejdeligt system til at studere mikrobielle patogener af lungesygdomme med en mucus-hypersekretion fænotype herunder cystisk fibrose (CF), kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD), astma og andre. Proceduren er designet specielt til studiet af CF, der er kendetegnet ved mutationer, der forårsager lungesekret at blive tyk og svært at klare, vinder påfyldning bronkioler og andre små passager med slim 2. Sådanne blokeringer i lungen inhiberer gasudveksling fordi inhaleret luft er ikke længere i stand til at nå mange alveoler og også give et levested for bakteriel kolonisering 3, 4. Den manglende evne til at forhindre mikrobiel vækst ioverdreven lunge slim sidste ende fører til udvikling af komplekse kroniske infektioner i luftvejene. Disse samfund indeholder en række organismer, herunder vira, svampe og bakterier som Pseudomonas aeruginosa, alle interagere med hinanden 5, 6, 7, 8. Aktiviteten af CF lunge microbiome menes at være involveret i opblussen af symptomer kaldes pulmonale eksacerbationer 1, 9, 10, 11. WinCF muliggør undersøgelse af mikrobielle samfund opførsel omkring disse eksacerbationer og udvides nu til at virke som en base eksperimentelle system til at studere lunge mikrobiel økologi. Traditionelt har forværringer blevet undersøgt ved direkte analyse af prøver udtaget fra lungerne. Mange forstyrrende faktorer gør direkte analyse af mikrobiel bUdfordring i lungerne udfordrer, med WinCF-systemet fjernes mange af disse faktorer, og lungemikrobiets adfærd kan studeres mere direkte, hvilket muliggør en finere analyse af bakteriel aktivitet i en slimplugget bronchiole.
WinCF-systemet giver en metode til at dyrke og analysere bakterier på en måde, der effektivt efterligner lungemiljøet. Traditionelle metoder til dyrkning af lungebakterier involverede ofte dyrkningsprover på traditionelle agarplader. Disse metoder forlader prøverne åbne for atmosfærisk oxygen, idet de forsømmer at tage højde for de hypoxiske og ofte anoxiske tilstande, der findes i lungebronchioler, der er plugget med slim 12 , 13 . Kultivering på agar under aerobiske forhold er intet som CF-lungens miljø og kan vildlede klinikere og forskere vedrørende adfærd hos patogener, som de forsøger at behandle. Derudover er næringsstoffer tilgængelige for bakterier på agarpladerer ulig dem, der findes i selve spyt, som tegner sig for i WinCF ved at udnytte kunstig spyt medier (ASM). Som vist af Pseudomonas kulturer i Sriramulu et al. 14, ASM indeholder et bestemt sæt af komponenter, der efterligner de ressourcer til rådighed for sputum mikrober og også replikerer den fysiske sammenhæng i spyt. Fordi en syg lunge har en specifik microbiome skal undersøgelsen af sådanne mikroorganismer ideelt finde sted i de særlige betingelser i lungerne så godt.
Den WinCF Systemet muliggør hurtig analyse og let manipulation af de eksperimentelle betingelser for at observere mikrobielle ændringer ligner hvordan de ville forekomme i en faktiske lunge bronkiole. Denne teknik muliggør podning af et utal af relaterede prøvetyper herunder sputum, spyt, andre kropssekreter og rene eller blandede bakteriekulturer. Arten af forsøgsopstillingen giver mulighed for øjeblikkelig visuel fortolkning afden mikrobielle samfund adfærd og er designet til at gøre det muligt let nedstrøms anvendelse af et væld af mikrobiologiske og omik procedurer. Sådanne undersøgelser er vigtige, fordi bakterielle ændringer samfund sammensætning baseret på de fysisk-kemiske betingelser for deres omgivelser. Med WinCF de kemiske forhold for medierne kan manipuleres til at analysere virkningerne på bakteriel aktivitet. For eksempel kan surheden af medierne ændres forud for inokulering med en prøve. Efter inkubering kan den bakterielle aktivitet i hver af disse tilstande sammenlignes direkte, og kan drages konklusioner om hvordan bakterier i disse sputumprøver opfører som reaktion på varierende pH. Her har vi skitsere de procedurer for anvendelsen af WinCF systemet og eksempler på, hvordan medierne kemi kan manipuleres til at studere virkningerne på lungerne microbiome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af lagre til kunstig sputummedie
- Opret en 5% mucinopløsning. Tilsæt 1,0 g dehydratiseret svin mave mucin til 20 ml deioniseret vand. Autoklaver den resulterende opløsning.
BEMÆRK: Mucinsteriliseringen vil ødelægge den iboende struktur; Andre metoder til sterilisering af mucinet i dets tørre form indbefatter UV sterilisering og bestråling. Disse metoder er imidlertid ikke blevet anvendt i vid udstrækning til WinCF-systemet. - Tilsæt 2,2 g KCl til 50 ml deioniseret vand og tillade opløsning. Tilsæt 5,0 g NaCl til 50 ml deioniseret vand og tillade opløsning. Autoklaver disse to løsninger.
- Tilsæt 100 mg laksesperm DNA til 10 ml sterilt deioniseret vand. Opvarm denne opløsning til ca. 85 ° C i et vandbad i nogle få timer for at sikre opløsning.
- Tilsæt 5,0 mg ferritin til 5,0 ml sterilt deioniseret vand.
2. Fremstilling af det kunstige sputummedium
- ForeneFølgende komponenter: 16 ml mucin stamopløsning, 2,0 ml KCl stamopløsning, 2,0 ml NaCl stamopløsning, 200 μl æggeblomme emulsion, 5,6 ml DNA stamopløsning, 120 μl ferritin stamopløsning, 5,78 ml essentiel Aminosyreopløsning, 5,78 ml ikke-essentiel aminosyreopløsning og 2,44 ml sterilt vand.
- Hvis der forekommer små mængder af sediment, skak forsigtigt for at blande.
- Pipet 5,0 ml medier i otte sterile 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: De kemiske forhold i hvert rør kan manipuleres efter ønske. For eksempel kan bufferopløsninger og pH-indikatorer tilsættes til hvert rør med det formål at sammenligne mikrobiel adfærd ved forskellige pH-niveauer. En demonstration af dette er vist i den repræsentative resultater sektion med 8 forskellige pH-niveauer, fra 5,0 til 8,5 i 0,5 pH-intervaller.
- Når mediernes kemiske forhold er vellykket manipuleret, frys til senere brug. Medierne forbliver stabile fremoverZen ved -20 ° C i flere måneder. Vortex efter optøning.
3. Fremstilling af et kontrolforløb af kapillarrørene
- I et sterilt biohood skal du fylde otte sterile mikrocentrifugerør med 250 μl medier hver.
- Opnå otte mere sterile 15 ml centrifugerør, hvert rør svarende til et mikrocentrifugerør nævnt i trin 3.1.
- Steriliser et papirhåndklæde med 70% ethanolopløsning og lad tørre. Når du er tør, skal du tørre håndklædet i stykker omkring fire firkantede inches hver og smuldre hvert stykke i bunden af et 15 ml centrifugerør. For yderligere rør spray og tør yderligere papirhåndklæder efter behov.
- Med ét klump papir i bunden af hvert centrifugerør dæmpes hvert papirklump med ca. 1,0 ml sterilt vand for at skabe en fugtig miljø.
- Opnå tre glaskapillærrør til hvert mikrocentrifugerør fremstillet i trin 3.1, og en blok af kapillærrør kittet sealant.
- For hver mikrocentrifugerør, fylde tre kapillarrør med medier til ca. 5 mm væk fra den blå markering nær toppen af røret.
- Udfylde ved at holde den ene ende af røret i mikrocentrifugerøret og vippe til horisontal orientering, tillader kapillarvirkning at lede mediet i røret (se figur 1).
- Stoppe påfyldningen ved forsigtigt at placere en behandsket finger over den åbne ende af røret, og derefter forsegle den anden ende af røret ved at trykke det ned i tætningsmidlet blok.
Figur 1: Eksempel pH Gradient, Påfyldning Capillary Tube med Artificial sputum Medium. Mediet tilsættes ved at indsætte den ene ende af røret i væsken og vippe at lette kapillarvirkning. Mediet farvning i dette eksempel skyldes pH-indikator hvormed hjælpe dæmonStrate potentielle ændringer i surhed efter inkubation. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Anbring hvert sæt af tre kapillærrør i 15 ml centrifugerør fyldt med papirhåndklæder fuldstændigt fugtet med sterilt vand, kittetæt side nedad. Hættet på røret og etiketten. Disse tre kapillarrør er til replikation af hver kontrolbetingelse.
- Når alle 15 ml centrifugerør er fyldt med deres udpegede kapillærrør, skal rørene placeres i et holdeelement. Placer stativet således, at rørene bliver inkuberet vandret (for at fange gasbobler) (Se figur 2 ). Inkuber kapillarrørene inde i centrifugerørene (indeholdende de fugtede papirklumper) ved 37 ° C i 48 timer.
Figur 2: Eksempel pH-gradient, kapillarrør klar til inkubation. Når 3 kapillarrør er blevet fyldt og forseglet, placeres de i et centrifugerør med et fugtigt papirhåndklæde i bunden. Dette rør er derefter afkortet og sat i et stativ. Stativet skal orienteres sidelæns under inkubation som vist her, således at gasproduktionen kan observeres, når inkubation er afsluttet. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Imaging af kontrolkapillærrørene efter inkubation
- Fjern stativet fra centrifugerørene fra inkubatoren, og sørg for at holde rørene vandret. Glid kapillarrørene forsigtigt ud af centrifugerørene, og hold hvert sæt af tre adskilt fra andre sæt.
- Arranger kapillærrørene ved siden af hinanden på en lightbox, så alle røres op, så rørets indhold er vissibel og belyst. Efterlad et hul hver tredje rør for at adskille forskellige kemiske forhold.
- Med rørene justeret og lightbox tændt, fotografi fra direkte over. (Se figur 3)
Figur 3: Eksempel pH Gradient, Kontrolkørsel, Præinkubering, nr sputum tilføjet. Kunstigt spyt medium efter tilsætning til kapillarrør i sæt af tre, stigende i pH fra venstre til højre. Kombinationen af indikatorer tilsættes til det medium resultat i flere sure rør optræder mere gul, mens mindre sure rør bliver mere lilla. Rørene er anbragt vandret og belyses nedefra, fotograferet fra oven. Klik her for at se en større version af dette tal.
- BortskafKontrolmaterialer i biofarligt affald.
5. Inokulering af WinCF Capillary Tubes med en Sputum Prøve
- I et sterilt biohood fylder otte sterile mikrocentrifugerør med 225 μl medier hver.
- Homogeniser sputumprøven ved at trække sputumet gentagne gange og skubbe det ud igen med en 3 ml sprøjte (en plastiksprøjte uden nålen). Gør dette indtil sputumet er af jævn konsistens.
- Tilsæt 25 μl homogeniseret sputum til hvert mikrocentrifugerør (1/10 fortynding i ASM-medier) fremstillet i trin 5.1. Vortex derefter rørene i 30 s for at blande tilstrækkeligt.
- Tilsæt medierne til kapillærrør efter samme fremgangsmåde som trin 3.2 til 3.5.
6. Imaging af prøve kapillærrør efter inkubation
- Efter 48-h inkubationstiden skal du fjerne og afbilde kapillarrørene efter samme fremgangsmåde som trin 4.1 til 4.3.
- Hvis der er bobler til stede i rørene, lavsikker på fotografier taget klart skildrer afgrænsningen mellem boblerne og medier i rørene. Hvis biofilm er til stede, skal du sørge for fotografierne kan tydeligt skildrer sin tilstedeværelse så godt.
7. Fjernelse af Media for downstream-applikationer
- For at lette downstream analyse, fjern mediet fra kapillarrørene efter billeddannelse. Potentielle anvendelser indbefatter dyrkning og DNA / RNA-sekventering og metabolomiske profilering.
Forsigtig: Glasset kapillarrør fyldt med patogener er en betydelig biohazard dermed disse trin skal udføres meget omhyggeligt med specifikt udstyr. Hvis kapillarrørene stykker, bortskaffes i korrekt smittefarligt affaldsbeholder. - Bruge blunt ended nåle af 25 gauge og 0,5 inch i længden for at fjerne medierne. Sæt den stumpe nål ind i den tilproppede ende af røret for at bryde forseglingen.
- Efter at have brudt forseglingen, drej kapillarrøret på hovedet, og medierne vil dryppe ud fra den øverste del. jegF medierne ikke drypper ud let, brug en pipette med en 200 μl spids og uddriv medierne ud af røret ved at trykke ned på pipettestemplet, når de sættes i enden af kapillarrøret. Saml det udstødte rørmedium i en passende beholder (1,5 ml centrifugerør).
BEMÆRK: Ved transskriptomisk eller anden RNA-analyse kan medierne udvises direkte i RNA-stabiliserende buffere.
8. WinCF FLUD System
BEMÆRK: WinCF Fluid Loading Utility Device (FLUD) System er en valgfri pakke af komplementære enheder designet til at optimere gennemstrømningen af WinCF System. WinCF FLUD-systemet består primært af 3D-printbare materialer. 3D-trykt fremstilling muliggør hurtig og nem udskiftning af materialer for at sikre minimal nedetid for forskere samt minimale fremstillingsbehov. Design, stl-filer, 3D-udskrivningsanvisninger og WinCF FLUD manualen er tilgængelige i online-supplement.
- Forberedelse af medier til kapillærrørbelastning
- I et sterilt biohood fylder otte sterile 2 ml mikrocentrifugerør med 900 μl medium hver.
- Homogeniser eventuelle sputumprøver ved at trække sputumet gentagne gange og skubbe det ud med en 3 ml sprøjte (en plastiksprøjte uden nålen). Gør dette indtil sputumet er af jævn konsistens.
- Tilsæt 100 μl homogeniseret sputum til hvert mikrocentrifugerør (1/10 fortynding i medium) fremstillet i trin 8.1.1. Vortex derefter rørene i 30 s for at blande tilstrækkeligt.
- Slå de fyldte og åbne mikrocentrifugerør ind i rotorrørholderen orienteret, så rørene er lodrette.
- Placering af kapillarrør
- Hent tre kapillærrør til hvert mikrocentrifugerør i trin 8.1.
- Slå tre rør ind i gummistativet, så de er justeret med mikrocentrifugerørene i den anden ende af apparatet.Sørg for de afmærkede ender af rørene står væk fra mikrocentrifugerør. Montér de tre huller på bunden af holderen korrekt i løbet af de tre nitter på vuggen standen.
- Med de placerede kapillarrør hviler i deres styrekanaler på apparatet, placere gummi tamp over deres midsections sikkert for at undgå forskydning. (Se figur 4)
Figur 4: Flud System fuldt lastet med Kapillærrør Secured af Rubber Tamp Over Deres midsections. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Ilægning af medier i kapillarrørene
- anvende omhyggeligt ene hånd at gribe enden af apparatet, hvor kapillarrørene er loAded, og brug den anden hånd til at holde rotorholderen, hvori mikrocentrifugerørene er anbragt.
- Drej mikrocentrifugestativet forsigtigt, så mikrocentrifugerørene er næsten vandrette og fortsæt med at skubbe langsomt stativet mod kapillarrørene. (Se figur 5 )
- Når enderne af kapillærrørene kommer i kontakt med mediet i mikrocentrifugerørene, skal du sørge for, at kapillærvirkning straks begynder at fylde kapillarrørene. For at justere fyldehastigheden og påfyldningsniveauet drejes apparatet som helhed forsigtigt. Vær opmærksom på, at du ikke spilder medier ud af mikrocentrifugerørene. (Se figur 6 )
- Når kapillærrørene er fyldt til de ønskede niveauer, skal apparatniveauet være på en overflade og omhyggeligt trække risten på mikrocentrifugerørene forsigtigt ud af enderne af kapillarrørene for at stoppe påfyldningen. Mikrocentrifugerørene kan nu trækkes helt tilbage til lodret stilling og lukkes.
- Tæt de udragende kanter af kapillærrørene ved at trykke en tætningsmiddelblok på hvert tredobbelt sæt, forsegling et sæt ad gangen, indtil alle sæt er forseglet. For at reducere risikoen for forurening skal du trykke en anden del af tætningsblokken på hvert triplicat sæt (se figur 7 ).
Figur 5: FLUD-systemet med mellemrør udrullet til en horisontal orientering, klar til at gøre kontakt med kapillarrør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: FLUD-systemet med kapillærrørene indlæses med medier via kapillær handling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Tætning af fyldte kapillærrør på FLUD System One Triplicate Sæt ad gangen ved brug af en forseglingsblok. Denne tætningsmiddelblok havde plastik langs kanterne, der blev afskåret for at forhindre kontakt med nabobesætninger under forsegling. Klik her for at se en større version af denne figur.
- inkubation
- Fjern gummistemplet over rørets midtersektioner og løft gummistativet fra hovedapparatet. Dette bør tage alle kapillarrørene med sig. Indstil nu vuggen og rørene fastholdes på billedholderen. Denne rack har tre stubbe der passer ind i holderen, samt små ledekanaler at indstille rørene ind.
- Indstil den billeddannende rack som helhed i det klare plastik inkubation kassen. Sættetid små mængder af sterile papirservietter i sterilt vand og sæt langs de to kortere sider af kassen for at tilvejebringe fugtighed under inkubation. (Se figur 8)
- Luk kassen helt og ligger i en 37 ° C inkubator, og sørg for at holde rørene vandret. Inkuber i 48 timer.
Figur 8: Kapillarrør i Rubber Cradle Overført fra Flud System til en Imaging Rack, der er opstillet i en Clear Inkubation Box Sideløbende fugtige papirservietter til at give fugtighed. Klik her for at se en større version af thEr figur.
- Billedbehandling og udvinding
- Fjern billedholderen, der holder rørene fra inkubationsboks og sæt det på en lysboks, belyst nedenfra. Med rørene, der allerede er i billedstativet, vil de tredobbelte sæt være ordentligt fordelt og klar til billede med det samme.
- Fokuser kameraet på rørene, så alle er synlige i synsfeltet, og lys fra lysboksen giver tilstrækkelig kontrast og visualisering af farven i rørfarverne. Foto fra direkte over.
- For at ekstrahere rørets indhold fjernes kapillarrørene fra gummistativet et sæt triplikater ad gangen. Løft forsigtigt rørene op og ud af holderen eller skub dem ud.
- For hvert sæt triplicater skal du følge udvindingsproceduren, der er beskrevet i trin 7.1 til 7.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrobiologisk vækst på tværs af de forskellige kemiske forhold induceret i prøverne varierede dramatisk i nogle tilfælde og mere subtilt hos andre. Mange aktivitetsændringer var synlige i naturen, og det viste sig umiddelbart, så snart inkubationsperioden sluttede. I eksemplet om pH-manipulation varierede prøverne over pH-spektret kraftigt som vist ved flere faktorer, der blev tydelige efter inkubation. Når der ikke blev tilsat sputumprøver til mediet, udviste den eneste ændring, som var udvist over pH-spektret efter 48 timers inkubation, et lille fald i mediumvolumenet som følge af mindre fordampning ( figur 9 ). Inokulerede kapillarrør udviste volumenændringer, udseende af gasbobler, ændret farve og udseendet af uigennemsigtige aflejringer ( figur 10 ).
Figur 9: Eksempel pH-gradient, kontrolkørsel, postinkubation, ingen sputum tilsat. De samme kapillarrør vist i figur 1 efter inkubering ved 37 ° C i 48 timer. Farvningen forbliver stort set uændret, hvilket indikerer ingen signifikante forskydninger i pH. Lidt reducerede mængder af mediet forbliver på grund af mindre fordampning ud af rørets åbne ender under inkubation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Eksempel pH Gradient Results, Post Incubation, Sputum Added, Gas Production Apparent. Kapillærrør indeholdende kunstigt sputummedium efter blanding med sputum fra en CF-patient. Rørene er anbragt i samme stigende rækkefølgeAf pH som kontrolløb. Mærkbare forskelle fra kontrolløb vist i figur 2 indbefatter større forskydninger i farvning, idet indledningsvis lave eller mellemliggende pH-rør bliver meget let farvede, hvilket indikerer store dråber i pH. De højeste pH-rør ændrede farvningen mindre drastisk, hvilket indikerer en mindre ændring i pH. Bobler er til stede i rør med lav og mellemklasse pH, hvilket indikerer fermentativ anaerobeaktivitet. Uigennemsigtige sektioner er også til stede i alle rør, med højere mængde i dem med lavere pH, hvilket indikerer yderligere mikrobiel aktivitet af forskellige slags. Klik her for at se en større version af denne figur.
Disse resultater viser, at bakterier og andre mikrober indeholdt i det tilsatte sputum er i stand til at vokse og ændre sig i det kunstige medium. Forskelle mellem de simulerede kemiske forhold varStærk og let sammenlignet, udviser biofilmproduktion, gasproduktion og forskellige farveændringer baseret på eventuelle yderligere indikatorer. I tilfælde af pH-eksperimentet var den mest signifikante ændring gasproduktionen, som var meget mere udbredt i rør med lavere pH, med en pH på 6,0 og 6,5, der generelt havde mest bobler. Andre uigennemtrængelige materialer blev observeret i de fleste rør, hvilket tyder på yderligere mikrobiel aktivitet, der forekommer i medierne, selv om højere pH-kapillarrør tendens til at have mindre. De fleste rør havde antaget en mere gul tone end tidligere, hvilket indikerede, at den samlede pH i medierne faldt. Medier med høj pH forblev generelt lig med deres oprindelige farve, hvilket indikerer lille ændring i pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mikrobiologiske sminke af en lunge med CF indeholder et stort udvalg af organismer, men betingelserne i lungen har sandsynligvis en betydelig indflydelse på, hvilke typer mikrober der kan overleve og trives 13 , 15 . Specifikke mekanismer, som disse betingelser ændrer sig, og de nøjagtige virkninger, de har på lungemikrobiomet, er generelt uklare i øjeblikket. I denne eksperimentelle metode præsenterer vi en analyse af mikrobiologiske ændringer baseret på manipulerede kemiske tilstande i en simuleret lunge bronchiole.
Der er nogle kritiske trin i protokollen. At holde det kunstige sputummedium sterilt før tilsætning af sputumprøver er vigtigt, når man vurderer mikrobiomet af det miljø, der analyseres. Udenlandske mikrober kan muligvis ændre forholdene og forstyrre nøjagtigheden af bronchiole-simuleringen. Mikroberne kunne også udkonkurrere målpatogenerne i sPutum prøver anvendt, hvilket kompromitterer enhver analyse af ændringer efter inkubation. Det er vigtigt at inkubere kapillarrørene vandret. Dette er vigtigt, fordi det muliggør observation af gasproduktionen. Hvis rørene inkuberes lodret, kan den producerede gas opstå op og ud af mediet, hvilket overhovedet ikke frembyder nogen gasproduktion. Plugging begge ender kan lette større gasproduktion uden tab af gas. Imidlertid vil den nødvendige oxygengradient blive forstyrret.
Protokollen er åben for adskillige modifikationer, der spænder fra mediernes kemiske sammensætning til de typer af prøver podet. Specifikke medikamenter kan nemt tilsættes i forberedelsesfasen, og forskellige inkubationsbetingelser kan simulere forskellige indstillinger, hvor mikroberne ville opholde sig. Dette eksperiment anvendte også specifikt sputumprøver indeholdende CF-patogener, men prøver fra andre lungesygdomme kunne erstattes for at spore tendenser blandt de særligepatogener.
En vigtig begrænsning ved denne teknik er, at indholdet af kapillarrørene væsentlige homogeniseres ved ekstraktion fra rørene, mister mange data om mikrobiel aktivitet ved forskellige lag inde i søjlen medium. For eksempel, ville medium tæt på luften potentielt indeholde mere aerob, med medium længere nede indeholdende flere anaerobe organismer 12. Disse to separate sæt af mikrober ville blive blandet sammen, hvis rørene blev tømt i en beholder til sekventering eller forarbejdning. Fremtidige studier med WinCF sigte mod at udvikle metoder til sektion og visualisere de mikrobielle samfund gennem længden af røret.
Denne tilgang til lunge sputum analyse giver en mere nøjagtig indstilling for væksten af lunge mikrober end ville en traditionel agarplade metode, hvor kulturer vokser på et fast medium åben til luften. Prøver, der stammer fra bronkiolerEller lignende indstillinger dyrkes mere hensigtsmæssigt i kapillærrørarrangementet på grund af ligheder, der deles med en faktisk lungebrysthinde. Dette eksperimentelle arrangement tegner sig for det fysiske rum, sputumkemi, fugtighed, middelkonsistens og iltgradienter, som ville være til stede i en faktisk CF-lunge 12 , 13 .
Denne teknik kan bruges til at manipulere mange tilstande, der er relevante for sygdomme, der involverer lungemikrobiomet. De kemiske betingelser i det kunstige sputummedium kan let manipuleres inden tilsætning af de ønskede mikrobielle prøver, hvilket tilvejebringer en bekvem metode til at observere virkningerne af mulige behandlinger eller ændringer. For eksempel ville tilsætningen af specifikke typer af antibiotika til mediet før tilsætning af lungesputumprøver tilvejebringe data om, hvordan sådan medicin ville påvirke det mikrobielle fællesskab af en lungebrysthinde. WinCF-systemet er et nyt værktøj til at studerelunge microbiome med direkte kliniske anvendelser. Traditionelle metoder til at studere lunge microbiome involverer sekventering slimprøver direkte, med WinCF fællesskabet kan aktivt vokset til bedre at visualisere og analysere dens kollektive stofskifte. Tidligere undersøgelser har vist, at WinCF godt gengiver microbiome i en sputumprøve 1, således, det repræsenterer et effektivt værktøj til eksperimenter med enkelte patogener, co-kulturer og samfund af organismer, som inficerer og skader humane lunger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Vertex Pharmaceuticals og Cystic Fibrosis Research Innovation Award for at finansiere R. Quinn og NIH / NIAID for finansieringstilskud 1 U01 AI124316-01, en systembiologi tilgang til behandling af multidrugs resistente patogener. Vi vil også gerne takke Institut for Mekanik og Aerospace Engineering ved UCSDs bachelorstuderende maskinteknik senior design kursus for at lette samarbejdet med de tekniske aspekter af dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, Suppl 4. S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
