Summary
Slemmet inkopplad luftvägarna hos cystisk fibros (CF) patienter är en idealisk miljö för mikrobiella patogener att frodas. Manuskriptet beskriver en ny metod för att studera CF lung microbiome i en miljö som efterliknar där de orsakar sjukdom och hur förändringar av kemiska förhållanden kan driva mikrobiella dynamik.
Abstract
Många kroniska luftvägssjukdomar resulterar i slem pluggning av luftvägarna. Lungor hos en individ med cystisk fibros är en exempelfall där deras slem-ansluten bronkioler skapa en gynnsam miljö för mikrobiell kolonisering. Olika patogener trivs i denna miljö interagerar med varandra och driver många av de symptom som förknippas med CF sjukdom. Liksom alla mikrobiella, kemiska villkoren för deras livsmiljö har en betydande inverkan på samhällsstrukturen och dynamik. Till exempel, olika mikroorganismer trivs i olika nivåer av syre eller andra lösta koncentrationer. Detta är också sant i CF lungan, där syrekoncentrationer tros driva samhälls fysiologi och struktur. De metoder som beskrivs här är utformade för att efterlikna lungmiljön och växa patogener på ett sätt som mer liknar den från vilken de orsakar sjukdom. Manipulation av de kemiska omgivningarna dessa mikrober används sedan för att studera hur kemiStryk av lunginfektioner styr sin mikrobiella ekologi. Metoden, som kallas WinCF-systemet, är baserat på artificiellt sputummedium och smala kapillärrör som är avsedda att tillhandahålla en syregradient liknande den som finns i slemkopplade bronkioler. Manipulerande kemiska förhållanden, såsom media-pH hos sputumet eller antibiotikatrycket, möjliggör visualisering av de mikrobiologiska skillnaderna i dessa prover genom att använda färgade indikatorer, titta på gas eller biofilmproduktion eller extrahera och sekvensera nukleinsyrainnehållet i varje prov.
Introduction
Metoden som beskrivs i detta manuskript kallas WinCF-systemet 1 . Det övergripande målet med WinCF är att tillhandahålla en experimentell inställning som kan simulera miljön hos en slem-fylld lungbronkiol. Detta kommer att möjliggöra ett töjbart system för att studera mikrobiella patogener av lungsjukdomar med en hypotesekretionsfenotyp inklusive cystisk fibros (CF), kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD), astma och andra. Förfarandet utformades specifikt för studien av CF, som kännetecknas av mutationer som orsakar lungsekretioner att bli tjocka och svåra att klara, slutligen fylla bronkioler och andra små passager med slem 2 . Sådana blockeringar i lunginhiberande gasutbyte eftersom inhalerad luft inte längre kan nå många alveoler och också ger ett livsmiljö för bakteriell kolonisering 3 , 4 . Oförmågan att förhindra mikrobiell tillväxt idriven lunga slem leder så småningom till utvecklingen av komplexa kroniska infektioner i luftvägarna. Dessa samhällen innehåller en mängd olika organismer, inklusive virus, svampar och bakterier som Pseudomonas aeruginosa, alla interagera med varandra 5, 6, 7, 8. Aktiviteten av den CF lung microbiome tros vara involverad i uppblossning av symptom som kallas lung exacerbationer 1, 9, 10, 11. WinCF möjliggör studier av mikrobiella beteendet kring dessa exacerbationer och nu utökas för att fungera som en bas experimentellt system för att studera lung mikrobiell ekologi. Traditionellt har exacerbationer studerats genom direkt analys av prover tagna från lungan. Många störande faktorer gör direkt analys av mikrobiell Behavior i lungorna utmanande, med WinCF systemet, många av dessa faktorer tas bort och kan studeras beteendet av lungan microbiome mer direkt, vilket möjliggör finare analys av bakteriell aktivitet i ett slem-inkopplad bronkiol.
Den WinCF systemet tillhandahåller ett förfarande för att växa och analysera bakterier på ett sätt som effektivt efterliknar lungan miljön. Traditionella metoder för odling lung bakterier ofta involverade odling prover på traditionella agarplattor. Dessa metoder lämnar proverna öppet för atmosfäriskt syre, försummar att ta hänsyn till den hypoxiska och ofta anoxiska betingelser funna i lung bronkioler pluggade med slem 12, 13. Odling på agar under aeroba förhållanden är inget som miljön i CF lungan och kan vilseleda kliniker och forskare om beteendet hos de patogener som de försöker att behandla. Dessutom de näringsämnen som finns tillgängliga för bakterier på agarplattorär olika till de som är tillgängliga i själva sputum, som redovisas i WinCF genom utnyttjande artificiell sputum media (ASM). Såsom visas av de Pseudomonas-kulturer i Sriramulu et al. 14, ASM innehåller en särskild uppsättning komponenter som efterliknar de resurser som finns tillgängliga för sputum mikrober och även replikerar den fysikaliska konsistensen hos sputum. Eftersom en sjuk lunga har en specifik microbiome bör studiet av sådana mikroorganismer helst ske i de särskilda villkoren i lungan samt.
Det WinCF systemet möjliggör snabb analys och enkel hantering av de experimentella förhållandena för att observera mikrobiella förändringar som liknar hur de skulle uppträda i en verklig lunga bronchiole. Denna teknik gör det möjligt att inokulering av en myriad av relaterade provtyper inklusive sputum, saliv, andra kroppssekret och rena eller blandade bakteriekulturer. Den typ av experimentuppställning möjliggör omedelbar visuell tolkning avden mikrobiella beteende och är utformad för att möjliggöra enkel nedströms tillämpning av en mängd mikrobiologiska och liknande områden förfaranden. Sådana studier är viktiga eftersom bakterie förändringar gemenskap komposition baserad på de fysiokemiska villkoren för deras omgivning. Med WinCF de kemiska villkoren i media kan manipuleras för att analysera effekterna på bakteriell aktivitet. Till exempel, kan surheten hos medierna ändras före inokulering med ett prov. Efter inkubation, kan den bakteriella aktiviteten i vart och ett av dessa tillstånd direkt jämföras, och slutsatser kan dras om hur bakterier i dessa sputumprover beter som svar på varierande pH. Här har vi beskriva de förfaranden för tillämpning av WinCF systemet och exempel på hur media kemi kan manipuleras för att studera effekterna på lung microbiome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Lagren för Artificial Sputum Media
- Skapa en 5% mucin lösning. Lägg 1,0 g av dehydratiserad grismage mucin till 20 ml avjoniserat vatten. Autoklavera den erhållna lösningen.
OBS! Mucin steriliseringen kommer att förstöra dess inneboende struktur; andra metoder för att sterilisera mucinet i sin torra form inkluderar UV-sterilisering och bestrålning. Dessa metoder har inte använts i stor utsträckning för WinCF systemet dock. - Lägg 2,2 g KCl till 50 ml avjoniserat vatten och låt för upplösning. Lägg 5,0 g NaCl till 50 ml avjoniserat vatten och låt för upplösning. Autoklav dessa två lösningar.
- Tillsätt 100 mg laxspermie DNA till 10 ml sterilt avjoniserat vatten. Upphetta denna lösning till ca 85 ° C i ett vattenbad under några timmar för att säkerställa upplösning.
- Lägg 5,0 mg ferritin till 5,0 ml sterilt avjoniserat vatten.
2. Beredning av artificiell Sputum Medium
- KombineraFöljande komponenter: 16 ml mucin stamlösning, 2,0 ml KCl stamlösning, 2,0 ml NaCl stamlösning, 200 | il äggula emulsion, 5,6 ml DNA stamlösning, 120 | il av ferritin stamlösning, 5,78 ml essentiell Aminosyralösning, 5,78 ml icke-essentiell aminosyralösning och 2,44 ml sterilt vatten.
- Om små mängder sediment uppträder, skaka försiktigt för att blanda.
- Pipet 5,0 ml media i åtta sterila 15 ml centrifugrör.
OBS: De kemiska förhållandena för varje rör kan manipuleras efter önskemål. Till exempel kan buffertlösningar och pH-indikatorer sättas till varje rör i syfte att jämföra mikrobiellt beteende vid olika pH-nivåer. En demonstration av detta visas i den representativa resultaten sektionen med 8 olika pH-nivåer, från 5,0 till 8,5 i 0,5 pH-steg.
- När de kemiska förhållandena i media framgångsrikt manipuleras, frysa för senare användning. Medierna kommer att vara stabila frozen vid -20 ° C under flera månader. Vortex vid upptining.
3. Beredning av en kontrollkörning av kapillärrören
- I en steril biohood, fylla åtta sterila mikrocentrifugrör med 250 ^ il av media vardera.
- Förvärva åtta mer sterila 15 ml centrifugeringsrör, varje rör motsvarar ett mikrocentrifugrör nämns i steg 3,1.
- Sterilisera en pappershandduk med 70% etanollösning och låt torka. Efter torkningen riva handduken i bitar om fyra square inches vardera, och crumple varje bit i botten av ett 15 ml centrifugrör. För ytterligare rör, spray och torka ytterligare pappershanddukar som behövs.
- Med ett klump av papper på botten av varje centrifugrör, något dämpa varje pappers klump med ca 1,0 ml sterilt vatten för att skapa en fuktig miljö.
- Erhålla tre glaskapillärrör för varje mikrocentrifugrör som framställts i steg 3,1 och ett block av kapillärrör kitt sealant.
- För varje mikrocentrifugrör fyller du tre kapillärrör med media till ca 5 mm från den blå markören nära toppen av röret.
- Fyll i genom att hålla ena änden av röret i mikrocentrifugröret och luta mot horisontell orientering, vilket möjliggör kapillärverkan för att styra mediet in i röret (se figur 1 ).
- Stoppa påfyllningen genom att försiktigt placera ett handskent finger över rörets öppna ände och försegla sedan den andra änden av röret genom att trycka ner det i tätningsblocket.
Figur 1: Exempel pH gradient, fyllning kapillärrör med konstgjord sputummedium. Mediet tillsätts genom att man sätter in en ände av röret i vätskan och lutar för att underlätta kapillärverkan. Medelfärgningen i detta exempel beror på att pH-indikatorn är tillsatt för att hjälpa demonenStrate potentiella förändringar i surhet efter inkubation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Placera varje uppsättning av tre kapillärrör i 15 ml centrifugrör fyllda med pappershanddukar helt fuktade med sterilt vatten, kittförseglad sida neråt. Häll röret och etiketten. Dessa tre kapillärrör är för replikation av varje kontrolltillstånd.
- När alla 15 ml centrifugrör är fyllda med sina utsedda kapillärrör, placera rören i en hållare. Placera stället så att rören inkuberas horisontellt (för att fånga gasbubblor) (Se bild 2 ). Inkubera kapillärrören inuti centrifugrören (innehållande de fuktiga papperskolvarna) vid 37 ° C i 48 timmar.
Figur 2: Exempel pH-gradient, kapillärrör redo för inkubation. När tre kapillärrör har fyllts och förseglats placeras de i ett centrifugrör med fuktig pappershandduk i botten. Detta rör är sedan kapat och sätts i ett ställ. Racket måste orienteras sidledes under inkubation, som bilden här, så att gasproduktionen kan observeras när inkubation är klar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Bildning av kontrollkapillärrören efter inkubation
- Ta bort racket av centrifugrör från inkubatorn, se till att rören hålls horisontella. Dra försiktigt kapillärrören ut ur centrifugrören, varigenom varje uppsättning tre är separata från andra uppsättningar.
- Ordna kapillärrören bredvid varandra på en lådkorg, alla kantade upp så att innehållet i rören är visible och belyst. Lämna ett mellanrum var tredje rör för att separera olika kemiska förhållanden.
- Med rören i linje och ljus påslagen fotografi från direkt ovanför. (Se Figur 3)
Figur 3: Exempel pH Gradient, kontrollkörning, Förinkubation, nr Sputum är tillagd. Artificiellt sputum mediet efter läggs i kapillärrör i uppsättningar om tre, ökar i pH från vänster till höger. Kombinationen av indikatorer tillsatta till mediet resulterar i flera sura tuber som uppträder mer gult, medan mindre sura rören blir mer lila. Rören är arrangerade horisontellt och belyses underifrån, fotograferad från ovan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- AvyttraKontrollmaterial i biohazardavfall.
5. Inokulera WinCF Capillary Tubes med en Sputum Prov
- I ett sterilt biohood fyller åtta sterila mikrocentrifugrör med 225 μl media vardera.
- Homogenisera sputumprovet genom att dra tillbaka och spruta sputumet upprepade gånger med en 3 ml spruta (en plastspruta utan nålen). Gör detta tills sputumet är av jämn konsistens.
- Tillsätt 25 μl homogeniserat sputum till varje mikrocentrifugrör (1/10 utspädning i ASM-medium) framställd i steg 5.1. Vortexa sedan rören i 30 s för att blanda tillräckligt.
- Tillsätt media till kapillärrör enligt samma procedur som steg 3.2 till 3.5.
6. Bildning av provkapillärrör efter inkubation
- Efter 48-timmars inkubationstid, ta bort och bild kapillärrören enligt samma procedur som steg 4.1 till 4.3.
- Om bubblor finns i rören, görSäker på att de fotografier som tagits tydligt visar avgränsningen mellan bubblorna och medierna i rören. Om biofilm är närvarande, se till att fotografierna tydligt kan visa dess närvaro.
7. Avlägsnande av media för nedströmsansökningar
- För att underlätta nedströmsanalys, ta bort mediet från kapillärrören efter bildbehandling. Potentiella tillämpningar innefattar odling och DNA / RNA-sekvensering och metabolomisk profilering.
Varning: Glaskapillärrören fyllda med patogener är ett signifikant biohazard, vilket innebär att dessa steg måste utföras mycket noga med specifik utrustning. Om kapillärröret sönderfaller, kassera i lämplig behållare för biohazard sharps. - Använd trubbiga nålar av 25 gauge och 0,5 tum i längd för att ta bort mediet. Sätt in den trubbiga änden i den pluggade änden av röret för att bryta förseglingen.
- Efter att ha tätat tätningen, vrid kapillärröret upp och ner och mediet droppar ut från övre delen. jagf medierna inte droppar ut lätt, använda en pipett med en 200 mikroliter spets och utvisa media ut ur röret genom att trycka nedåt på pipettkolven när den är införd i änden av kapillärröret. Samla den utdrivna röret media i en lämplig behållare (1,5 ml centrifugrör).
OBS! Transcriptomic eller annan RNA-analys, media kan utvisas direkt i RNA stabiliserande buffertar.
8. WinCF FLUD System
OBS! WinCF Fluid Loading Utility Device (FLUD) System är en valfri svit av kompletterande anordningar som är avsedda att optimera genomströmningen av WinCF System. Den WinCF FLUD System består främst av 3D utskrivbara material. 3D tryckt tillverkning möjliggör snabb och lätt byte av material för att säkerställa minimal stilleståndstid för forskare samt minimala tillverkningskrav. Designs, STL-filer, 3D utskriftsanvisningar och WinCF FLUD manual finns i online supplement.
- Förbereder media för kapillärrörsbelastning
- I ett sterilt biohood fyller åtta sterila 2 ml mikrocentrifugrör med 900 μl medium vardera.
- Homogenisera eventuella sputumprover genom att dra tillbaka och spruta sputumet upprepade gånger med en 3 ml spruta (en plastspruta utan nålen). Gör detta tills sputumet är av jämn konsistens.
- Tillsätt 100 μL homogeniserat sputum till varje mikrocentrifugrör (1/10 spädning i medium) framställd i steg 8.1.1. Vortexa sedan rören i 30 s för att blanda tillräckligt.
- Slå in de fyllda och öppna mikrocentrifugrören i rotorrörhållaren orienterad så att rören är vertikala.
- Placering av kapillärrör
- Hämta tre kapillärrör för varje mikrocentrifugrör i steg 8.1.
- Slå in tre rör i gummistängan så att de är inriktade mot mikrocentrifugrören vid den andra änden av apparaten.Se till att de markerade ändarna av rören vända bort från mikrocentrifugrör. Montera de tre hålen på undersidan av vaggan ordentligt under de tre tapparna på hållaren montern.
- Med de placerade kapillärrör vilar i sina styrkanaler på apparaten, placera gummi tamp över sina midsections ordentligt för att förhindra växling. (Se figur 4)
Figur 4: Den FLUD System Helt Laddad med Kapillärrör Säkrad av Gummi Tamp över deras mittsektioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Laddar media i kapillärrören
- använda omsorgsfullt en hand för att ta tag i änden av apparaten, där kapillärrören är loAded, och använd den andra handen för att hålla rotorstället i vilket mikrocentrifugrören är laddade.
- Rotera försiktigt mikrocentrifugestativet så att mikrocentrifugrören är nästan horisontella och fortsätt att sakta trycka stället mot kapillärrören. (Se figur 5 )
- När kapillärrörens ändar kommer i kontakt med media i mikrocentrifugrören, se till att kapillärverkan omedelbart börjar fylla kapillärrören. För att justera fyllningshastighet och fyllningsnivå, rotera försiktigt apparaten som helhet. Var försiktig så att du inte spolas ut ur mikrocentrifugrören. (Se figur 6 )
- När kapillärrören fylls till önskade nivåer, placera apparatnivån på en yta och dra försiktigt men snabbt racket av mikrocentrifugrör från ändarna av kapillärrören för att sluta fylla. Mikrocentrifugröret kan nu dras in hela vägen tillbaka till vertikal position och stängd.
- Tätning av kapillärrörens utskjutande ändar genom att trycka på ett tätningsblock på varje trippeluppsättning, försegla en uppsättning i taget tills alla uppsättningar är täta. För att minska risken för förorening, tryck på en annan del av tätningsblocket på varje trippeluppsättning (se Figur 7 ).
Figur 5: FLUD-systemet med medelrör som är utplacerade i en horisontell orientering, redo att göra kontakt med kapillärrör. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: FLUD-systemet med kapillärrör Laddar med media via kapilläråtgärd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Tätning Fylld Kapillärrör på FLUD System One Triplicate inställd på en gång med en Tätningsmedel Block. Denna tätningsblocket hade plast längs kanterna som klipptes av för att förhindra kontakt med angränsande trippeluppsättningar under försegling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Inkubation
- Avlägsna gummi tamp över röret mittsektioner och lyft vaggan gummi utanför huvudapparaten. Detta bör vidta alla kapillärrör med det. Nu satt vaggan och rören hålls på bild rack. detta rack har tre stubbar som passar in i vaggan, såväl som små styrkanaler för att ställa rören i.
- Ställa avbildnings rack som helhet in i klar plast inkubation låda. Blöt små mängder av sterila pappershanddukar i sterilt vatten och placera utmed de två kortare sidorna av lådan för att ge fuktighet under inkubation. (Se figur 8)
- Stänga rutan helt och ligger inne i en 37 ° C inkubator, och se till att hålla rören horisontella. Inkubera under 48 timmar.
Figur 8: Kapillärrör i Rubber Cradle Överfört från FLUD System till en Imaging Rack, som har placerats i en Clear Inkubation Box Vid sidan Fuktiga pappershanddukar för att Tillhandahålla Fuktighet. Klicka här för att se en större version av thär figur.
- Avbildning och extraktion
- Ta bort bild rack håller rören från inkubationstiden rutan och ställ in den på en ljus, belysta underifrån. Med rören redan finns i bild rack, kommer trippeluppsättningar korrekt placerade och redo att bilden omedelbart.
- Fokusera kameran på rören så att alla är synliga i synfältet och ljus från ljuslådan ger tillräcklig kontrast och visualisering av färgen i röret färgämnen. Fotografi från direkt ovanför.
- För att extrahera innehållet i rören, ta bort kapillärrör från gummi vaggan en uppsättning av tre exemplar åt gången. Lyft försiktigt rören upp och ut ur vaggan eller skjut dem.
- För varje uppsättning av triplikat, följ extraktion förfarande som beskrivs i steg 7.1 genom 7,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrobiologisk tillväxt mellan de olika kemiska betingelser inducerade inom proverna varierade kraftigt i vissa fall och mer subtilt i andra. Många förändringar i aktiviteten var visuell karaktär, är uppenbart så snart inkubationstiden slut. I exemplet i pH-manipulation, proverna över pH-spektrumet varierade kraftigt såsom visas genom flera faktorer som blev uppenbara efter inkubation. När inga sputumprover sattes till media, den enda förändringen som uppvisas över pH-spektrumet efter 48 h inkubering var en liten minskning i medium volym erhållna från mindre avdunstning (Figur 9). Inokulerade kapillärrör uppvisade volymförändringar, utseendet av gasbubblor, förändrad färgning och utseende opaka avlagringar (Figur 10).
Figur 9: Exempel pH Gradient, kontrollkörning, Post-inkubation, nr Sputum är tillagd. Samma kapillärrör visade i figur 1 efter att ha inkuberats vid 37 ° C under 48 h. Färgn förblir i stort sett oförändrad, vilket indikerar inga signifikanta förändringar i pH. Något reducerade mängder av mediet förblir på grund av mindre förångning av de öppna ändarna av rören under inkubation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Exempel pH-gradient Resultat, Post Inkubation, Sputum tillagd, Gas Produktion Skenbar. Kapillärrör innehållande artificiellt sputum mediet efter att ha blandats med slem från en CF-patient. Rören är anordnade i samma stigande ordningAv pH som kontrollkörningen. Märkbara skillnader från kontrollrundan som visas i Figur 2 inkluderar stora förändringar i färgning, med initialt låga eller mellanliggande pH-rör blir mycket lättfärgade vilket indikerar stora droppar i pH. De högsta pH-rören bytte färgning mindre drastiskt, vilket indikerar en mindre förändring i pH. Bubblor finns närvarande i rör med lågt och mellannivå pH, vilket indikerar fermentativ anaerobeaktivitet. Osynliga sektioner är också närvarande i alla rör, med högre mängd i de med lägre pH, vilket indikerar ytterligare mikrobiell aktivitet av olika slag. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Dessa resultat visar att bakterier och andra mikrober som ingår i det tillsatta sputumet kan växa och förändras inom det artificiella mediet. Skillnader mellan de simulerade kemiska förhållandena varskarp och lätt jämföras, uppvisar biofilm produktion, gasproduktion, och olika färgförändringar baserade på några tillsatta indikatorer. I fallet med pH-experimentet, den mest betydande förändringen var gasproduktionen, som var mycket mer utbredd i rör med lägre pH, med ett pH på 6,0 och 6,5 i allmänhet har de flesta bubblorna. Annat ogenomskinligt material observerades i de flesta rör, indikativ av ytterligare mikrobiell aktivitet som inträffar i media, även om högre pH-kapillärrör tenderade att ha mindre. De flesta rör hade antagit en gulare ton än tidigare, vilket tyder på att den totala pH av media sjunkit. Medier med högt pH förblev generellt liknande deras initiala färgning, vilket indikerar liten förändring i pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mikrobiologiska sminken av en lunga med CF innehåller en stor mängd organismer, men tillstånden i lungan har sannolikt ett betydande inflytande på vilka typer av mikrober som kan överleva och trivas 13 , 15 . Specifika mekanismer genom vilka dessa förhållanden förändras och de exakta effekterna de har på lungmikrobiomen är i allmänhet oklara för närvarande. I denna experimentella metod presenterar vi en analys av mikrobiologiska förändringar baserade på manipulerade kemiska tillstånd i en simulerad lungbronkiol.
Det finns några kritiska steg i protokollet. Att hålla det konstgjorda sputummediet sterilt före tillsats av sputumprover är viktigt när man beaktar mikrobiomen hos miljön som analyseras. Utländska mikrober kan eventuellt ändra tillstånd och störa noggrannheten i bronchiole-simuleringen. Mikroberna kan också utkämpa målpatogenerna i sputum prover används, att kompromissa med någon analys av förändringar efter inkubation. Det är viktigt att inkubera kapillärrör horisontellt. Detta är viktigt eftersom det gör det möjligt för observation av gasproduktionen. Inkuberades rören vertikalt den gas som produceras kan stiga upp och ut ur mediet, vilket ger ett intryck av någon gasproduktionen alls. Ansluta båda ändar kan underlätta ökad gasproduktion utan förlust av gas. Dock skulle det nödvändiga syret gradienten störas.
Protokollet är öppen för flera modifieringar, som sträcker sig från den kemiska sammansättningen av medierna för att de typer av prover ympade. Specifika mediciner kan lätt läggas i framställningsstegen, och olika inkubationsbetingelser kan simulera olika inställningar i vilka mikrober skulle bosatta. Detta experiment användes också specifikt sputumprover innehållande CF patogener, men prover från andra lungsjukdomar kan vara substituerad för att spåra trender bland dem särskiltpatogener.
En viktig begränsning av denna teknik är att innehållet i kapillärrören i huvudsak homogeniseras vid extraktion från rören, förlorar mycket data avseende mikrobiell aktivitet vid olika lager i kolonn av medium. Till exempel kan medium nära luften innehålla mer aeroba organismer, med medium längre ner som innehåller mer anaeroba organismer 12 . Dessa två separata uppsättningar mikrober skulle blandas om rören tömdes i en behållare för sekvensering eller behandling. Framtida studier med WinCF syftar till att utveckla metoder för att snitta och visualisera det mikrobiella samhället genom rörets längd.
Denna metod för lungsputumanalys ger en mer exakt inställning för tillväxten av lungmikrober än en traditionell agarplattmetod, i vilken odlingar växer på ett fast medium öppet för luften. Prov som härrör från bronkiolereller liknande inställningar är lämpligare odlades i kapillärröret arrangemanget på grund av likheter som delas med en faktisk lung bronkiol. Detta experimentella arrangemang står för den fysiska utrymmet, sputum kemi, fuktighet, medelkonsistens, och syre gradienter som skulle vara närvarande i en verklig CF lunga 12, 13.
Denna teknik kan användas för att manipulera många förhållanden relevanta för sjukdomar som involverar lungan microbiome. De kemiska förhållandena i den konstgjorda sputum mediet lätt kan manipuleras före tillsats av de önskade mikrobiella prover, vilket ger en bekväm metod för att observera effekterna av eventuella behandlingar eller ändringar. Till exempel tillägg av vissa typer av antibiotika till mediet innan du lägger lungslemprover skulle ge uppgifter om hur en sådan medicinering skulle påverka den mikrobiella samhället av en lunga bronchiole. Det WinCF systemet är ett nytt verktyg för att studeralung microbiome med direkta kliniska tillämpningar. Traditionella metoder för att studera lung microbiome innebär sekvenseslemprover direkt med WinCF samhället aktivt kan växa till bättre visualisera och analysera dess kollektiva metabolism. Tidigare studier har visat att WinCF väl reproducerar microbiome i ett sputumprov 1, vilket således utgör det ett effektivt verktyg för experimentering med enstaka patogener, samodlingar och samhällen av organismer som infekterar och skador människans lungor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Vertex Pharmaceuticals och cystisk fibros Research Innovation Award för finansiering R. Quinn och NIH / NIAID finansiering bidrag 1 U01 AI124316-01, en systembiologi strategi för behandling av multiresistenta patogener. Vi vill också tacka Institutionen för mekanik och flygteknik på UCSD grundutbildning maskinteknik senior design kurs för att underlätta samarbetet med verkstads aspekterna av detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, Suppl 4. S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
