Summary
점액은 낭포 성 섬유증의기도가 (CF) 환자는 미생물 병원균이 번창 할 수있는 이상적인 환경이다 연결. 원고들은 화학 조건의 질병 및 방법 변경의 원인이 모방 미생물 역학을 구동 할 수있는 환경에서 CF 폐 마이크로 바이 옴을 연구하기위한 새로운 방법을 설명합니다.
Abstract
많은 만성기도 질환으로 인해 점액이 막히게됩니다. 낭포 성 섬유증을 앓고있는 개인의 폐는 점막이 막힌 세기관지가 미생물의 식민지화에 유리한 서식처를 만드는 대표적인 사례입니다. 이 환경에서 서로간에 상호 작용하며 CF 질환과 관련된 많은 증상을 유발하는 다양한 병원체가 번창합니다. 미생물 군집과 마찬가지로, 서식지의 화학적 조건은 지역 사회 구조와 역 동성에 중요한 영향을 미친다. 예를 들어, 서로 다른 미생물은 서로 다른 수준의 산소 또는 다른 용질 농도로 번성합니다. 이는 산소 농도가 지역 사회의 생리 및 구조를 유도하는 것으로 여겨지는 CF 폐에서도 마찬가지입니다. 여기에 설명 된 방법은 폐 환경을 모방하고 질병을 유발하는 것과 유사한 방식으로 병원균을 성장 시키도록 고안되었습니다. 이러한 미생물의 화학적 환경에 대한 조작은 화학 물질폐 감염의 stry는 미생물의 생태를 제어합니다. 상기 방법은 시스템 WinCF 불리는 인공 타액 매체 및 기관지 점액 플러그에 존재하는 것과 유사한 산소 구배를 제공하기위한 좁은 모세관에 기초한다. 이러한 객담 항생제 압력 매체의 pH와 같은 화학적 조건을 조작하는 것과 샘플의 미생물의 차이, 컬러 표시를 이용하여 가스 또는 바이오 필름 제조 시청하거나 추출하고, 각 샘플의 핵산 함량 시퀀싱의 시각화를 허용한다.
Introduction
이 논문에 기재된 방법은 WinCF 시스템 (1)라고한다. WinCF의 전반적인 목표는 점액 가득 찬 폐의 세기관지의 환경을 시뮬레이션 할 수있는 실험 장치를 제공하는 것입니다. 다루기 쉬운 시스템은 낭포 성 섬유증 (CF), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식 등을 포함한 점액 과분비 표현형과 폐 질환의 미생물 병원체를 연구하기 위해이 허용됩니다. 절차는 폐 분비물이 결국 점액 2 세기관지 및 다른 작은 통로를 작성, 삭제하는 두꺼운 하드되는 원인 돌연변이에 의해 특징 CF의 연구를 위해 특별히 설계되었습니다. 흡입 공기가 더 이상 많은 폐포에 도달하고 또한 세균성 식민지 3, 4의 서식지를 제공 할 수 있기 때문에 폐에서 이러한 방해는 가스 교환을 억제하지 않습니다. 무능력은 미생물의 성장을 방지하기 위해과도한 폐 점액은 결국기도의 복잡한 만성 감염의 발달로 이어진다. 이 공동체에는 바이러스, 균류 및 녹농균 과 같은 박테리아를 비롯한 다양한 유기체가 포함되어 있으며 모두 서로 상호 작용합니다 ( 5 , 6 , 7 , 8) . CF 폐 Microbiome의 활동은 폐 악화 1 , 9 , 10 , 11 이라고 불리는 증상의 발적과 관련이 있다고 여겨집니다. WinCF는 이러한 악화 주변의 미생물 군 행동에 대한 연구를 가능하게하고 현재는 폐 미생물 생태학을 연구하기위한 기본 실험 시스템으로 확장되고 있습니다. 전통적으로 악화는 폐에서 채취 한 표본을 직접 분석하여 연구되었습니다. 많은 교란 요인이 미생물 b의 직접 분석을합니다.WinCF 시스템을 사용하여 폐에 생기가 생기면 이러한 많은 요인들이 제거되고 폐 Microbiome의 행동을보다 직접적으로 연구 할 수있어 점액이 막힌 기관지 내 박테리아 활동을보다 세밀하게 분석 할 수 있습니다.
WinCF 시스템은 효과적으로 폐 환경을 모방하는 방식으로 박테리아를 증식 및 분석하는 방법을 제공합니다. 폐 박테리아를 재배하기위한 전통적인 방법은 종종 전통적인 한천 접시에서 표본을 배양하는 것과 관련이 있습니다. 이 방법은 샘플을 대기 중의 산소로 개방하여 점액 12 , 13로 막힌 폐 기관지에서 발견되는 저산소 상태 및 종종 무산소 상태를 설명하지 않습니다. 호기성 조건에서 한천 배양은 CF 폐의 환경과 아무런 상관이 없으며 치료하려고하는 병원체의 행동과 관련하여 임상의와 연구원을 오도 할 수 있습니다. 또한, 한천 플레이트의 박테리아가 이용할 수있는 영양물인공 가래 매체 (ASM)를 이용하여 WinCF에서 차지하는 실제 가래에서 사용 가능한 것과는 다른 것입니다. Sriramulu et al. 의 Pseudomonas 배양 물에 나타난 것처럼 . 14 에서 ASM은 가래에 사용할 수있는 자원을 모방하고 객담의 물리적 일관성을 복제하는 특정 구성 요소 세트를 포함합니다. 질병이있는 폐에는 특정 미생물이 있기 때문에 이러한 미생물에 대한 연구는 이상적으로 폐의 특정 조건에서도 이루어져야합니다.
WinCF 시스템은 실험 조건을 신속하게 분석하고 조작하여 실제 폐 기관지에서 발생하는 것과 유사한 미생물 변화를 관찰 할 수 있습니다. 이 기술은 객담, 타액, 다른 체액 분비물 및 순수 또는 혼합 세균 배양과 같은 무수한 관련 표본 유형의 접종을 허용합니다. 실험 설정의 본질은 다음을 즉시 시각적으로 해석 할 수 있습니다.미생물 군집 행동과 미생물 및 오 믹스 절차의 다수의 쉬운 하위 응용 프로그램을 가능하게하도록 설계되었습니다. 이러한 연구는 세균 공동체 구성이 환경의 물리 화학적 조건에 따라 달라지기 때문에 중요합니다. WinCF를 사용하면 배지의 화학적 조건을 조작하여 세균 활동에 미치는 영향을 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 시료의 접종 전에 배지의 산도를 변경할 수 있습니다. 배양 후, 이들 각각의 조건에서 박테리아 활성을 직접 비교할 수 있으며, 그 가래 샘플의 박테리아가 다양한 pH에 반응하여 어떻게 행동하는지에 대한 결론을 도출 할 수 있습니다. 여기에서는 WinCF 시스템을 적용하는 절차와 폐 화학 미생물에 미치는 영향을 연구하기 위해 매개 화학이 어떻게 조작 될 수 있는지에 대한 예를 설명합니다.
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Protocol
인공 객담 미디어 종목의 제조 1
- 5 % 점액 솔루션을 만듭니다. 탈 이온수 20 ㎖에 점액 탈수 돼지 위 1.0 g을 추가한다. 이 용액을 압력솥.
참고 : 점액 살균 고유의 구조를 파괴 할 것이다; 건식 형태 뮤신 살균 다른 방법은 UV 살균 및 사출을 포함한다. 이러한 방법은 광범위하지만 WinCF 시스템에 사용되지 않았다. - 탈 이온수 50 ㎖에 2.2 g의 KCl을 첨가하고 용해를 위해 허용한다. 탈 이온수 50 ㎖에 염화나트륨 5.0 g을 첨가하고 용해를 위해 허용한다. 이 두 가지 솔루션을 압력솥.
- 멸균 증류수를 10 ㎖의 연어 정자 DNA 100 mg을 추가. 몇 시간이 해산을 보장하기위한 수조에서 약 85 ° C에이 솔루션을 가열.
- 멸균 증류수 5.0 mL의 페리틴 5.0 ㎎을 추가한다.
인공 객담 중간 2. 준비
- 콤바인다음의 성분 : 점액 원액 16 mL, KCl 원액 2.0 mL, NaCl 원액 2.0 mL, 달걀 노른자 유제 200 mL, DNA 원액 5.6 mL, 페리틴 원액 120 μL, 필수 5.78 mL 아미노산 용액, 5.78 mL의 비 필수 아미노산 용액 및 2.44 mL의 멸균 수를 첨가 하였다.
- 소량의 침전물이 나타나면 부드럽게 흔들어 혼합하십시오.
- 8 개의 멸균 15 mL 원심 튜브에 미디어 5.0 ML을 피펫.
참고 : 각 튜브의 화학적 조건은 원하는대로 조작 할 수 있습니다. 예를 들어, 뚜렷한 pH 수준에서 미생물의 거동을 비교하기 위해 완충 용액과 pH 지시약을 각 튜브에 첨가 할 수 있습니다. 이것에 대한 시연은 대표적인 결과 섹션에서 0.5 pH 증분으로 5.0에서 8.5까지 8 개의 다른 pH 레벨로 표시됩니다.
- 일단 매체의 화학적 조건이 성공적으로 조작되면 나중에 사용하기 위해 동결하십시오. 미디어는이 세상에서 안정적으로 유지 될 것입니다.몇 달 동안 -20 ° C에서 선종. 해동시 소용돌이 치기.
3. 모세관 튜브의 제어 실행 준비
- 살균 된 생체 내에서 각각 250 μL의 배지가 들어있는 8 개의 멸균 미세 원심 분리 튜브를 채 웁니다.
- 8 개의 더 멸균 15 ML 원심 분리기 튜브를 취득, 각 튜브는 단계 3.1에서 언급 한 microcentrifuge 튜브에 해당합니다.
- 70 % 에탄올 용액으로 종이 타월을 소독하고 건조시킵니다. 건조되면 수건을 약 4 제곱 인치의 조각으로 찢고 15 mL 원심 분리 튜브의 바닥에 각 조각을 구겨냅니다. 추가 튜브의 경우 필요에 따라 추가로 종이 타월을 분무하고 건조시킵니다.
- 각 원심 튜브의 바닥에 종이 한 덩어리로 습기가 많은 환경을 만들기 위해 약 1.0mL의 멸균 수로 각 종이 덩어리를 약간 꺾으십시오.
- 3.1 단계에서 준비한 모든 미세 원심 분리 튜브와 모세관 튜브 퍼티 씰라 블록에 대해 세 개의 유리 모세관 튜브를 얻습니다nt.
- 각 microcentrifuge 튜브 들어, 튜브의 상단 근처에 파란색 마커에서 약 5mm 거리에 미디어와 세 모세관을 작성하십시오.
- 튜브의 한쪽 끝을 마이크로 원심 분리 관에 넣고 수평 방향으로 기울이면 모세관 작용으로 매체를 튜브 안으로 유도 할 수 있습니다 ( 그림 1 참조).
- 튜브의 열린 끝 부분에 장갑을 낀 손가락을 가볍게 대고 채우기를 멈추고 튜브의 다른 쪽 끝 부분을 밀봉재 블록으로 눌러 밀봉하십시오.
그림 1 : 인공 Sputum 매체와 모세관 관을 채우는 예제 산도 그라데이션. 튜브는 액체의 한쪽 끝을 삽입하고 모세관 작용을 촉진하기 위해 기울임으로써 추가됩니다. 이 예제의 중간 착색은 악마를 돕기 위해 첨가 된 pH 표시기 때문입니다.부화 후 산성도의 잠재적 변화를 측정한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 세 모세관 튜브의 각 세트 15 ML 원심 분리기 튜브 완전히 멸균 물, 퍼티 - 밀봉 측면 아래로 moistened 종이 수건으로 가득 넣어. 튜브와 라벨을 덮으십시오. 이 세 개의 모세관은 각 제어 조건의 복제 용입니다.
- 모든 15 mL 원심 분리 튜브가 지정된 모세관으로 채워지면 튜브를 고정 랙에 넣으십시오. 튜브가 수평으로 배양되도록 랙을 놓으십시오 (가스 버블을 잡으십시오) ( 그림 2 참조). 37 ° C에서 48 시간 동안 원심 분리 튜브 (모이게 한 종이 덩어리가 들어있는) 안에 모세관 튜브를 품는다.
>도 2 : 실시 예 산도 그라디언트, 인큐베이션 모세관 준비. 세 모세관 튜브 충전 밀봉 한 후에, 이들은 아래에서 젖은 종이 타월로 원심 분리 튜브에 배치된다. 이 튜브는 뚜껑을 닫고 랙에 배치됩니다. 여기에 그림과 같이 배양이 완료되면 그 가스 생산 관찰 할 수 있도록 랙, 배양하는 동안 옆으로 지향해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
배양 후 제어 모세관 튜브 4. 영상
- 수평 튜브를 유지해야하고, 인큐베이터에서 원심 분리기 튜브 랙을 제거합니다. 조심스럽게 다른 세트는 별개의 세 개의 각각의 세트를 유지하는 원심 분리 튜브로부터 모세관 튜브 슬라이드.
- 라이트 박스에 서로 모든 줄 옆에있는 모세관 튜브를 배열 때문에 튜브의 내용이 있음을 마주ible 및 조명. 다른 화학적 조건을 분리 간격마다 세 개의 튜브를 남겨주세요.
- 튜브 정렬 및 라이트 박스 위에서 직접, 사진 켜진. (그림 3 참조)
그림 3 : 예 산도 그라데이션, 제어, 실행을 사전 배양, 아니 객담 추가. 후 인공 타액 중 왼쪽에서 오른쪽으로 pH를 증가 세 세트 모세관 튜브에 첨가된다. 보다 더 노란 나타나는 튜브 산성 매질에 첨가 결과 지표의 조합, 덜 산성 튜브보다 보라색되어있다. 튜브는 수평으로 배치되고, 상기 촬영에서, 아래에 조명된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 의 폐기생물학적 유해 폐기물의 물질 관리.
5. WinCF 모세관 튜브에 Sputum 샘플 접종
- 살균 된 생체 내에서 각각 225 μL의 매체가있는 8 개의 멸균 미세 원심 분리 튜브를 채 웁니다.
- 3 ML 주사기 (바늘없이 플라스틱 주사기)로 가래를 철수하고 반복적으로 배출하여 가래 샘플을 균질화하십시오. 가래가 매끄럽고 일관성있게 될 때까지하십시오.
- 단계 5.1에서 준비한 각 microcentrifuge 튜브 (ASM 미디어의 1/10 희석)에 균질화 된 객담 25 μL를 추가합니다. 그런 다음 30 초 동안 튜브를 충분히 혼합합니다.
- 3.2 ~ 3.5 단계와 동일한 절차에 따라 모세관 튜브에 용지를 추가합니다.
6. 인큐베이션 후 샘플 모세관 튜브 이미징
- 48 시간 배양 시간이 경과하면, 4.1 ~ 4.3 단계와 동일한 절차에 따라 모세관 튜브를 제거하고 이미지를 만듭니다.
- 튜브에 기포가 있으면명확하게 찍은 사진이 튜브의 거품과 매질 사이의 묘사를 명확하게 묘사하고 있는지 확인하십시오. 생물막이 존재하는 경우, 사진이 그 존재를 분명히 나타낼 수 있는지 확인하십시오.
7. 다운 스트림 응용 프로그램을위한 미디어 제거
- 다운 스트림 분석을 용이하게하려면 이미징 후 모 세관에서 미디어를 제거하십시오. 잠재적 인 응용에는 배양 및 DNA / RNA 시퀀싱 및 대사 체 프로파일 링이 포함됩니다.
주의 : 병원균으로 채워진 유리 모세관은 중요한 생물학적 위험이며, 따라서 이러한 단계는 특정 장비로 매우 조심스럽게 수행되어야합니다. 모 세관이 파손 된 경우 적절한 생물 학적 위험 폐기물 용기에 폐기하십시오. - 미디어를 제거하려면 25 게이지와 0.5 인치 길이의 끝이 뾰족한 바늘을 사용하십시오. 뭉툭한 끝이 달린 바늘을 튜브의 막힌 부분에 삽입하여 밀봉을 해제하십시오.
- 씰을 깨고 나서 모세관을 뒤집어 놓으면 용지가 윗부분에서 튀어 나옵니다. 나는매체가 쉽게 떨어지지 않는 경우 200μL 팁이있는 피펫을 사용하고 모세관 끝 부분에 삽입 할 때 피펫 플런저를 아래로 눌러 튜브에서 배지를 배출하십시오. 적절한 용기 (1.5 ML 원심 튜브)에서 추방 튜브 미디어를 수집합니다.
참고 : transcriptomic 또는 기타 RNA 분석의 경우, 배지를 RNA 안정화 완충액으로 직접 배출 할 수 있습니다.
8. WinCF FLUD 시스템
참고 : WinCF 유체로드 유틸리티 장치 (FLUD) 시스템은 WinCF 시스템의 처리량을 최적화하도록 설계된 보완 장치 옵션 제품군입니다. WinCF FLUD 시스템은 주로 3D 인쇄 가능한 재질로 구성됩니다. 3D 인쇄 된 제조는 최소한의 제조 요구 사항은 물론 연구자의 가동 중단 시간을 최소화하기 위해 재료를 빠르고 쉽게 교체 할 수 있습니다. 디자인, stl 파일, 3D 인쇄 지침 및 WinCF FLUD 매뉴얼은 온라인 suppleme에서 사용할 수 있습니다.nt.
- 모세관로드를위한 매체 준비
- 살균 biohood에서 매체의 900 μL 각 여덟 살균 2 ML의 microcentrifuge 튜브를 작성하십시오.
- 3 mL 주사기 (바늘이없는 플라스틱 주사기)를 사용하여 객담을 철수하고 반복적으로 꺼내어 모든 가래 샘플을 균질화하십시오. 가래가 매끄럽고 일관성있게 될 때까지하십시오.
- 단계 8.1.1에서 준비한 각 microcentrifuge 튜브 (매체의 1/10 희석)에 균질화 된 객담 100 μL를 추가합니다. 그런 다음 30 초 동안 튜브를 충분히 혼합합니다.
- 채워지고 열려있는 미세 원심 분리 튜브를 튜브가 수직이되도록 회 전자 튜브 홀더에 삽입하십시오.
- 모세관 배치
- 8.1 단계에서 모든 미세 원심 분리 관용 세 모세관을 꺼내십시오.
- 3 개의 튜브를 고무 받침대에 넣고 장치의 다른 쪽 끝에있는 미세 원심 분리 튜브와 정렬되도록하십시오.튜브의 표시 끝이 떨어져 마이크로 원심 튜브에서 직면해야합니다. 크래들 스탠드에있는 세 개의 스터드 받침대의 하단에있는 세 개의 구멍을 맞 춥니 다.
- 배치 된 모세관 튜브가 장치에 자신의 가이드 채널에 쉬고, 이동 방지 안전하게 고무가 중간 부 위에 배치 탐포. (그림 4 참조)
그림 4 : FLUD 시스템은 완벽하게 중간 부에 걸쳐 고무 탐포에 의해 보안 모세관 튜브와로드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 모세관에 용지 넣기
- 조심스럽게 모세관 튜브 LO있는 장치의 끝을 파악하는 한 손을 사용하여다른 한 손으로 마이크로 원심 분리기 튜브가 장착 된 로테이터 랙을 잡으십시오.
- 미세 원심 분리 관을 세밀하게 회전하여 미세 원심 분리 관이 거의 수평이되도록하고 천천히 랙을 모세관쪽으로 밀어냅니다. ( 그림 5 참조)
- 모세관 튜브의 끝이 미세 원심 분리 튜브의 매 체와 접촉하면 모세관 현상이 즉시 모세관을 채우기 시작하는지 확인하십시오. 채우기 속도와 채우기 레벨을 조정하려면 전체적으로 장치를 부드럽게 돌리십시오. 이 작업을 수행하는 동안 미세 원심 분리 튜브에서 미디어를 쏟지 않도록주의하십시오. ( 그림 6 참조)
- 모세관 튜브가 원하는 수준으로 채워지면 장치 표면을 표면에 놓고 미세하게 원심 분리기 튜브를 모세관 끝에서 조심스럽게 당겨 채우지 않게합니다. 미세 원심 분리 튜브는 이제 수직 위치로 되돌아 가서 닫을 수 있습니다..
- 모든 세트가 밀폐 될 때까지 한 번에 하나 개의 세트를 밀봉 중으로 각 세트에 실란트 블록을 눌러 모세관의 돌출 단부를 밀봉. 오염의 위험을 줄일 중으로 각 세트에 시일 블록의 다른 부분을 눌러 (도 7 참조).
그림 5 : FLUD 시스템 매체 수평 방향으로 배치 된 튜브, 준비와 함께 모세관 튜브와 접촉한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 모세관 튜브가 모세관 액션을 통해 미디어와 함께로드와 함께 FLUD 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : FLUD 시스템에 채워진 모세관 튜브 밀봉 씰 블록을 사용하여 한 번에 3 세트 씩 채 웁니다. 이 봉합 제 블록은 봉합 중에 인접한 세 개의 세트와의 접촉을 방지하기 위해 절단 된 모서리를 따라 플라스틱을 가지고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 잠복
- 튜브 중앙부의 고무 받침대를 제거하고 고무 받침대를 본체에서 들어 올리십시오. 이것은 모든 모세관 튜브를 가져 가야합니다. 이제 크래들과 튜브를 이미징 랙에 고정하십시오. 이 raCK는 튜브 내로 설정 세 크래들에 맞게 명세서뿐만 아니라 작은 가이드 채널을 갖는다.
- 투명 플라스틱 배양 상자에 전체 이미징 랙을 설정합니다. 멸균 멸균 종이 타월의 소량을 적시 배양 중에 습도를 제공하기 위해 상자의 두 짧은 측면을 따라 배치합니다. (그림 8 참조)
- 수평 튜브를 유지해야하고, 37 ° C 배양기 내에서 완전히 설정 상자를 닫습니다. 48 시간 동안 품어.
그림 8 : 습도를 제공하기 위해 젖은 종이 타월 외에도 명확한 부화 상자에 배치 된 이미징 랙에 FLUD 시스템에서 전송 된 고무 요람에서 모세관 튜브. 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.
- 이미징 및 추출
- 부화 상자에서 튜브를 잡고 이미징 랙을 제거하고 아래에서 조명 라이트 박스에 설정합니다. 촬상 랙 이미 튜브의 삼중 세트 적절히 이격되며 즉시 이미지 준비.
- 모든 빛 상자에서보기 광의 필드에 표시되도록 상기 튜브에 카메라 초점 튜브 염료의 색상의 충분한 콘트라스트 및 시각화를 제공한다. 바로 위의 사진.
- 튜브의 내용물을 추출하기 위해, 한 번에 삼중 고무 받침대의 한 세트의 모세관 튜브를 제거한다. 부드럽게하고 밖으로 크래들 튜브를 올리거나 그들을 밀어 넣습니다.
- 삼중의 각 세트의 경우, 7.3 단계 7.1에 설명 된 추출 절차를 따르십시오.
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Representative Results
샘플 내에서 유도 된 다양한 화학 조건에서 미생물의 성장이 극적으로 어떤 경우에는 더 미묘하게 다른 사람의 변화. 활동의 많은 변화는 즉시 잠복 기간이 종료로 쉽게 알 수있는, 자연에서 시각이었다. 배양 후 명백 해졌다 여러 요인에 의해 도시 된 바와 같이, pH가 조작의 예에서의 pH 영역에 걸쳐 샘플이 크게 변화. 더 객담 샘플을 배지에 첨가되지 않았다 때, 배양 48 시간 후 pH를 스펙트럼에 걸쳐 나타나는 유일한 변화는 증발 부 (도 9)에서 생성 된 매체 볼륨이 약간 감소 하였다. 접종 모세관 체적 변화, 기포, 변형의 착색 외관 불투명 침전물의 모양 (도 10)를 나타냈다.
그림 9 : 예 산도 그라데이션, 제어, 실행 후 배양, 아니 객담 추가. 후에도 1에 도시 된 바와 같은 모세관 튜브를 48 시간 동안 37 ℃에서 배양된다. 채색은 pH의 유의 한 변화를 표시하지 크게 변경되지 않습니다. 배지의 양을 약간 감소는 배양 중에 튜브의 개방 단부로부터 약간의 증발로 인해 유지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : 예 산도 그라데이션 결과, 포스트 배양, 객담 추가, 명백한 가스 생산. CF 환자에서 타액과 혼합 된 후에 인공 타액 매체를 포함하는 모세관. 튜브는 동일한 오름차순으로 배열pH를 조절한다. 그림 2 에 표시된 대조군과의 눈에 띄는 차이점은 채색의 주요 변화를 포함하며, 처음에는 저농도 또는 중거리 pH 튜브가 매우 가볍게 착색되어 pH가 크게 떨어짐을 나타냅니다. 가장 높은 pH 관은 착색을 덜 획기적으로 변화 시켰으며, pH의 변화가 더 적음을 나타냅니다. 기포는 발효 혐기성 활동을 나타내는 중저 범위 pH의 튜브에 존재합니다. 불투명 한 섹션은 또한 모든 튜브에 존재하며, 더 낮은 pH의 불순물 섹션에서 더 많은 양이 존재하며, 다양한 종류의 미생물 활성을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이러한 결과는 추가 된 객담 내에 함유 된 박테리아 및 기타 미생물이 인공 매질 내에서 성장하고 변화 할 수 있음을 보여준다. 시뮬레이션 된 화학적 조건 간의 차이점은바이오 필름 생산, 가스 생산 및 추가 된 지표에 근거한 다양한 색상 변화를 보여 주며 쉽게 비교할 수 있습니다. pH 실험의 경우, 가장 중요한 변화는 낮은 pH의 튜브에서 훨씬 더 많이 발생하는 가스 생성이었으며, pH 6.0 및 6.5는 일반적으로 거품이 가장 많았습니다. 대부분의 튜브에서 다른 불투명 한 물질이 관찰되었으며, 이는 더 높은 pH 모 세관이 덜 경향이 있었지만 배지에서 일어나는 미생물 활성을 나타냅니다. 대부분의 튜브는 이전보다 더 황색의 색조를 나타 냈습니다. 이는 미디어의 전반적인 pH가 떨어 졌음을 나타냅니다. 높은 pH의 배지는 일반적으로 초기 착색과 유사하여 pH의 변화가 거의 없음을 나타냅니다.
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Discussion
CF와 폐의 미생물 메이크업은 생물의 큰 다양성을 포함하고 있지만, 폐 내의 조건은 가능성이 미생물의 종류가 생존하고, 13 15 번성 할 수 있는지에 상당한 영향을 미친다. 특정 메커니즘을 통해 이러한 조건을 변경하고 그들이 폐 마이크로 바이에 미치는 정확한 영향은 현재 일반적으로 불분명하다. 이 실험에있어서, 우리는 시뮬레이션 된 폐 세기관지에서 조작 화학적 조건에 기초하여 미생물 학적 변화의 분석을 제시한다.
프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 환경의 마이크로 바이 분석되어 고려하면 객담의 첨가 전에 멸균 인공 타액 매체를 유지하는 것은 중요하다. 외국 미생물 가능성이 조건을 변경하고, 세기관지 시뮬레이션의 정확성을 방해 할 수 있습니다. 미생물은 또한 S에서 대상 병원균을 outcompete 수putum 샘플은 변경 사항 분석 후 배양을 손상, 사용. 이는 가로 모세관을 배양 중요하다. 이 가스 생산의 관찰 할 수 있기 때문에 중요하다. 튜브는 수직 전혀 가스 발생의 모양을주는 바깥쪽으로 유체의 상승 수도 생성 가스를 배양 하였다. 양쪽 끝을 연결하면 가스의 손실없이 더 큰 가스 생산을 촉진 할 수있다. 그러나 필요한 산소 그라데이션이 중단 될 것입니다.
접종 프로토콜은 샘플의 유형 매체의 화학 성분에 이르기까지 여러 가지 변형 열려있다. 특정 약물은 쉽게 준비 단계에서 추가 될 수 있으며, 다른 배양 조건은 미생물이있는 것입니다있는 다양한 설정을 시뮬레이션 할 수 있습니다. 이 실험은 또한 구체적으로는 CF 병원체를 함유하는 담 샘플을 사용하지만, 다른 폐 질환에서 샘플 중에서 그 특정 흐름을 추적하는 치환 될 수도병원균.
이 기술의 한 가지 중요한 한계는 모세관 튜브의 내용물이 튜브에서 추출 할 때 본질적으로 균질화되어있어 매체 칼럼 내의 여러 지층에서 미생물 활성에 관한 많은 데이터를 잃어 버리는 것입니다. 예를 들어, 대기에 가까운 매체는보다 많은 혐기성 유기체를 포함하는 더 많은 호기성 유기체를 포함 할 가능성이있다. 튜브가 시퀀싱 또는 처리 용 콘센트로 비워지면이 두 세트의 미생물 세트가 함께 혼합됩니다. WinCF의 미래 연구는 튜브 길이를 통해 미생물 군락을 구획화하고 시각화하는 방법을 개발하는 것을 목표로합니다.
폐 가래 분석에 대한이 접근법은 공기가 열린 고체 배지에서 배양이 성장하는 전통적인 한천 플레이트 방법보다 폐 세균의 성장에 대한보다 정확한 설정을 제공합니다. 세기관지 유래 샘플또는 유사한 설정으로 인해 실제 폐의 세기관지와 공유 유사성에 더 적절하게 모세관 튜브 배열에서 배양한다. 이 실험 장치는 물리적 공간 객담 화학, 습도, 중간 농도 및 실제 CF 폐 (12, 13)에 존재하는 것, 산소 구배를 차지한다.
이 기술은 폐 마이크로 바이 옴을 포함하는 질병에 관련된 많은 조건을 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 인공 타액 매체의 화학적 상태를 쉽게 처리 가능한 사전 또는 변경의 효과를 관찰하기위한 편리한 방법을 제공하고, 목적하는 미생물 샘플을 추가로 조작 될 수있다. 예를 들어, 약물이 폐의 세기관지의 미생물 군집에 영향을 미칠 것입니다 방법에 대한 데이터를 제공 할 것이다 폐 객담 샘플을 추가하기 전에 매체에 항생제의 특정 유형의 추가. WinCF 시스템은 공부를 할 수있는 새로운 도구입니다직접적인 임상 적용을 통한 폐 마이크로 바이모. 폐 Microbiome을 연구하는 전통적인 방법은 점액 시료를 직접 시퀀싱하는 것과 WinCF를 사용하여 공동체를 적극적으로 성장시켜 집단적인 신진 대사를 시각화하고 분석 할 수 있습니다. 이전의 연구에 따르면 WinCF는 가래 샘플 1 에서 미생물을 잘 재생하므로 단일 병원체, 공동 문화 및 인간의 폐를 감염시키고 손상시키는 생물 군집을 실험하기위한 효과적인 도구임을 나타냅니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 자금 보조금 1 U01 AI124316-01, 다제 내성 병원균의 치료에 시스템 생물학 접근 R 퀸과 NIH / NIAID 자금을 지원하기위한 버텍스 제약과 낭포 성 섬유증 연구 혁신 상을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한이 작품의 엔지니어링 측면과 협력을 촉진하기위한 UCSD의 학부 기계 공학 수석 설계 과정에서 기계 항공 공학부에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
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