Summary
Slimet koblet luftrom på cystisk fibrose (CF) pasienter som et ideelt miljø for mikrobiologiske patogener for å trives. Artikkelen beskriver en ny fremgangsmåte for å studere CF-lunge mikrobiomer i et miljø som etterligner hvor de forårsaker sykdommen og hvordan endring av de kjemiske betingelser kan kjøre mikrobielle dynamikk.
Abstract
Mange kroniske luftveis sykdommer resulterer i slimplugg av luftveiene. Lunger av et individ med cystisk fibrose er et eksempel på hvor deres slimpluggede bronkioler skaper et gunstig habitat for mikrobiell kolonisering. Ulike patogener trives i dette miljøet interagerer med hverandre og kjører mange av symptomene forbundet med CF sykdom. Som alle mikrobielle samfunn, har de kjemiske forholdene i deres habitat en betydelig innvirkning på samfunnets struktur og dynamikk. For eksempel trives forskjellige mikroorganismer i forskjellige nivåer av oksygen eller andre oppløselige konsentrasjoner. Dette gjelder også i CF lung, hvor oksygenkonsentrasjoner antas å drive samfunnsfysiologi og struktur. Metodene beskrevet her er utformet for å etterligne lungemiljøet og vokse patogener på en måte som ligner det som de forårsaker sykdom. Manipulering av disse mikroberens kjemiske omgivelser blir da brukt til å studere hvordan kjemienstry av lungeinfeksjoner regulerer dens mikrobiell økologi. Fremgangsmåten, kalt WinCF system, er basert på kunstig spytt medium og smale kapillarrør ment å tilveiebringe et oksygen-gradient lik det som finnes i slim-plugget bronkioler. Manipulering av kjemiske betingelser, slik som media pH i sputum eller antibiotika trykk, gjør det mulig for visualisering av de mikrobiologiske forskjellene i disse eksempler ved å bruke fargede indikatorer, se for gass eller biofilmdannelse eller uttrekking og sekvensering av nukleinsyre-innholdet i hver prøve.
Introduction
Metoden beskrevet i dette manuskriptet kalles WinCF-systemet 1 . Det overordnede målet med WinCF er å gi et eksperimentelt oppsett som er i stand til å simulere miljøet av en slimfylt lungebronkiol. Dette vil muliggjøre et trekkbart system for å studere mikrobielle patogener av lungesykdommer med en slimhypersekresjonsfenotype, inkludert cystisk fibrose (CF), kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD), astma og andre. Prosedyren ble utformet spesielt for studiet av CF, som er preget av mutasjoner som forårsaker lungesekresjoner å bli tykke og vanskelig å klare, til slutt fylle bronkioler og andre små passasjer med slim 2 . Slike blokkeringer i lungehemmende gassutveksling fordi inhalert luft ikke lenger er i stand til å nå mange alveoler og også gi et habitat for bakteriell kolonisering 3 , 4 . Manglende evne til å forhindre mikrobiell vekst idreven lunge slim til slutt fører til utvikling av komplekse kroniske infeksjoner i luftveiene. Disse gruppene inneholder en rekke organismer, inkludert virus, sopp og bakterier som Pseudomonas aeruginosa, alt i samspill med hverandre 5, 6, 7, 8. Aktiviteten av CF-lunge mikrobiomer er antatt å være involvert i fakkel av symptomer som kalles pulmonale eksaserbasjoner 1, 9, 10, 11. WinCF muliggjør studium av den mikrobielle samfunnet oppførsel rundt disse eksaserbasjoner, og blir nå utvidet til å virke som en base eksperimentelt system for å studere lunge mikrobiell økologi. Tradisjonelt eksaserbasjoner har blitt studert ved direkte analyse av prøver tatt fra lungen. Mange forvirrende faktorer gjør direkte analyse av mikrobiell bOppførsel i lungene utfordrende, med WinCF-systemet, blir mange av disse faktorene fjernet og lungemikrobiets oppførsel kan studeres mer direkte, noe som muliggjør en finere analyse av bakteriell aktivitet i en mucusplugget bronkiole.
WinCF-systemet gir en metode for å vokse og analysere bakterier på en måte som effektivt etterligner lungemiljøet. Tradisjonelle metoder for dyrking av lungebakterier involverte ofte dyrkingsprøver på tradisjonelle agarplater. Disse metodene lar prøvene åpne for atmosfærisk oksygen, og forsømmer å ta hensyn til de hypoksiske og ofte anoksiske forholdene som finnes i lungebrystkarger plugget med slim 12 , 13 . Culturing på agar under aerobiske forhold er ingenting som CF-lungens miljø og kan villede klinikere og forskere angående oppførsel av patogener som de prøver å behandle. I tillegg er næringsstoffene tilgjengelige for bakterier på agarplaterEr ulik de som er tilgjengelige i selve sputum, som regnskapsføres i WinCF ved å benytte kunstig sputum media (ASM). Som vist av Pseudomonas kulturer i Sriramulu et al. 14 , ASM inneholder et bestemt sett av komponenter som etterligner ressursene som er tilgjengelige for sputummikrober, og også replikerer den fysiske konsistensen av sputum. Fordi en syk lunge har en bestemt mikrobiom, bør studien av slike mikroorganismer ideelt sett foregå i de spesifikke tilstandene til lungen også.
WinCF-systemet muliggjør rask analyse og enkel manipulering av eksperimentelle forhold for å observere mikrobielle endringer som ligner på hvordan de ville oppstå i en faktisk lungebronkiol. Denne teknikken tillater inokulering av et myriade av beslektede utvalgstyper, inkludert sputum, spytt, andre kroppssekretjoner og rene eller blandede bakteriekulturer. Naturen til eksperimentell oppsett muliggjør umiddelbar visuell tolkning avDen mikrobielle samfunnsadferd og er designet for å muliggjøre enkel nedstrøms anvendelse av en rekke mikrobiologiske og omiske prosedyrer. Slike studier er viktige fordi bakterielle samfunnssammensetninger endres basert på deres fysiokjemiske forhold. Med WinCF kan de kjemiske forholdene i media manipuleres for å analysere effektene på bakteriell aktivitet. For eksempel kan surheten av mediet endres før inokulering med en prøve. Etter inkubering kan den bakterielle aktiviteten i hver av disse forholdene sammenliknes direkte, og konklusjoner kan trekkes om hvordan bakterier i disse sputumprøver oppfører seg som respons på varierende pH. Her skisserer vi prosedyrene for å bruke WinCF-systemet og eksempler på hvordan mediekjemien kan manipuleres for å studere effektene på lungemikrobiomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av aksjer for kunstig sputummedia
- Lag en 5% mucin løsning. Tilsett 1,0 g dehydratisert gris mage mucin til 20 ml deionisert vann. Autoklaver den resulterende løsningen.
MERK: Mucinsteriliseringen vil ødelegge den innebygde strukturen; Andre metoder for å sterilisere mucinen i sin tørre form inkluderer UV-sterilisering og bestråling. Disse metodene har imidlertid ikke blitt mye brukt til WinCF-systemet. - Tilsett 2,2 g KCl til 50 ml deionisert vann og tillate oppløsning. Tilsett 5,0 g NaCl til 50 ml deionisert vann og tillate oppløsning. Autoklaver disse to løsningene.
- Tilsett 100 mg laksesperm DNA til 10 ml sterilt deionisert vann. Oppvar denne løsningen til ca. 85 ° C i et vannbad i noen timer for å sikre oppløsning.
- Tilsett 5,0 mg ferritin til 5,0 ml sterilt deionisert vann.
2. Fremstilling av det kunstige sputummedium
- Kombinerede følgende komponenter: 16 ml av mucin-forrådsoppløsning, 2,0 ml KCl forrådsoppløsning, 2,0 ml NaCl lageroppløsning ble 200 ul av eggeplomme emulsjon, 5,6 ml av DNA-forrådsløsning, 120 ul av ferritin stamløsning, 5,78 ml av essensiell aminosyre-løsning, 5,78 ml av ikke-essensiell aminosyre-løsning, og 2,44 ml sterilt vann.
- Hvis små mengder sedimenter vises, rist forsiktig å blande.
- Pipetter 5,0 ml av mediet inn i åtte sterilt 15 ml sentrifugerør.
MERK: kjemiske forhold i hvert rør kan manipuleres som ønsket. For eksempel, kan bufferløsninger og pH-indikatorer tilsettes til hvert rør for det formål å sammenligne mikrobiell oppførsel ved forskjellige pH-nivåer. En demonstrasjon av dette er vist i den representative resultater seksjon med 8 forskjellige pH-verdier, fra pH 5,0 til trinn 8,5 i 0,5.
- Når de kjemiske forholdene i media er vellykket manipulert, fryse til senere bruk. Mediene vil forbli stabil frozen ved -20 ° C i flere måneder. Vortex ved tining.
3. Fremstilling av et kontrollforsøk av kapillarrørene
- I et sterilt biohood, fylle åtte sterile mikrosentrifugerør med 250 ul medium i hver.
- Erverve åtte mer sterilt 15 ml sentrifuge-rør, hvert rør svarer til et mikrosentrifugerør som er nevnt i trinn 3.1.
- Steriliser et papirhåndkle med 70% etanol-oppløsning og la den tørke. Når det er tørt, rive den håndkle inn i stykker om fire firkantede inches hver, og krølle hver brikke i bunnen av et 15 ml sentrifugerør. For flere rør, spray og tørre ekstra papirhåndklær etter behov.
- Med en klump av papir ved bunnen av hvert sentrifugerør, Fukt hver papir klump med ca. 1,0 ml sterilt vann for å skape en fuktig miljø.
- Få tre glasskapillærrør for hver mikrosentrifugerør fremstilt i trinn 3.1 og en blokk av kapillarrør kitt sealant.
- For hvert mikrocentrifugerør fylles tre kapillærrør med medium til ca. 5 mm fra den blå markøren nær toppen av røret.
- Fyll ved å holde den ene enden av røret i mikrocentrifugerøret og vippe mot horisontal orientering, slik at kapillærvirkning kan lede mediet inn i røret (se figur 1 ).
- Stopp fyllingen ved forsiktig å plassere en hansket finger over den åpne enden av røret, og forsegl deretter den andre enden av røret ved å trykke den ned i tetningsblocket.
Figur 1: Eksempel pH gradient, fylling kapillærrør med kunstig Sputum Medium. Mediet tilsettes ved å sette den ene enden av røret inn i væsken og vippe for å lette kapillærvirkning. Den midtre fargen i dette eksemplet skyldes at pH-indikatoren er lagt til for å hjelpe demonenStrate potensielle endringer i surhet etter inkubering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Plasser hvert sett av tre kapillærrør i 15 ml sentrifugerør fylt med papirhåndklær fullstendig fuktet med sterilt vann, kitt-forseglet side ned. Kast på røret og etiketten. Disse tre kapillærrørene er for replikasjon av hver kontrolltilstand.
- Når alle 15 ml sentrifugerør er fylt med de utpekte kapillærrørene, plasser rørene i et holdehylle. Plasser stativet slik at rørene blir inkubert horisontalt (for å fange gassbobler) (Se figur 2 ). Inkubér kapillærrørene inne i sentrifugerørene (som inneholder de fuktede papirklumpene) ved 37 ° C i 48 timer.
Figur 2: Eksempel pH gradient, Kapillærrør Klar for Inkubasjon. Når tre kapillarrør er fylt og forseglet, blir de plassert i et sentrifugerør sammen med fuktig papirhåndkle nederst. Dette rør blir deretter lukket og satt i et rack. Stativet må innrettes sideveis under inkubasjonen, slik det er vist her, slik at gassproduksjonen kan observeres når inkuberingen er fullført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Bildedannelse av kontroll Kapillærrør etter Inkubering
- Fjern stativet av sentrifugerør fra inkubatoren, og pass for å holde rørene horisontalt. Skyv kapillarrørene ut av sentrifugerørene, holde hvert sett av tre atskilt fra andre sett.
- Ordne kapillarrør ved siden av hverandre på en lysboks, alle stilt opp slik at innholdet i rørene er visible og opplyst. Igjen en avstand hvert tredje rør for å separere forskjellige kjemiske forhold.
- Når rørene er på linje og lysboks slått på, fotografi direkte ovenfra. (Se figur 3)
Figur 3: Eksempel på pH-gradient, kontrollforsøk, Preinkubasjon, No Sputum lagt. Kunstig spytt medium etter å ha blitt lagt inn i kapillarrørene i sett på tre, og øker i pH fra venstre til høyre. Kombinasjonen av indikatorer tilsatt til mediet resultat i flere sure rør vises mer gul, mens mindre sure rør blir mer lilla. Rørene er anordnet horisontalt og er belyst nedenfra, fotografert ovenfra. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Kast denKontrollmateriale i biohazard avfall.
5. Inokulering av WinCF kapillærrørene med en sputumprøve
- I et sterilt biohood fyller åtte sterile mikrocentrifugerør med 225 μl media hver.
- Homogeniser sputumprøven ved å trekke sputumet gjentatte ganger ut med en 3 ml sprøyte (en plastsprøyte uten nålen). Gjør dette til sputumet har jevn konsistens.
- Tilsett 25 μl homogenisert sputum til hvert mikrocentrifugerør (1/10 fortynning i ASM-medium) fremstilt i trinn 5.1. Vortex rørene i 30 s for å blande tilstrekkelig.
- Legg media til kapillærrør etter samme fremgangsmåte som trinn 3.2 til 3.5.
6. Imaging av prøve kapillærrør etter inkubasjon
- Etter 48-h inkubasjonstid, fjern og bilde kapillærrørene etter samme fremgangsmåte som trinn 4.1 til 4.3.
- Hvis bobler er til stede i rørene, gjør duat fotografier tatt klart viser avgrensningen mellom boblene og mediet i rørene. Hvis biofilm er til stede, må bildene kan tydelig viser sin tilstedeværelse også.
7. Fjerning av media for nedstrømsapplikasjoner
- For å lette nedstrøms analyse, fjern mediet fra kapillarrørene etter avbildning. Potensielle anvendelser omfatter dyrking og DNA / RNA-sekvensering og metabolomic profilering.
Forsiktig: glasskapillarrør fylt med patogener er en signifikant biologisk fare således denne fremgangsmåten må gjøres meget omhyggelig med spesielt utstyr. Hvis kapillarrør i stykker, for senere deponering på riktig smittefarlig beholder for skarpe gjenstander. - Bruk buttendede nåler av 25 gauge og 0,5 tommer i lengde for å fjerne media. Sett butt nål inn i den tilkoplede ende av røret for å bryte forseglingen.
- Etter å bryte forseglingen, slår kapillarrøret opp ned og mediene skal dryppe ut fra den øvre delen. JegF media ikke drypper ut lett, bruk en pipette med en 200 μl spiss og utløs media ut av røret ved å trykke ned pipettens stempel når det settes inn i enden av kapillærrøret. Samle det utstøpte rørmediet i en passende beholder (1,5 ml sentrifugerør).
MERK: For transkriptomisk eller annen RNA-analyse kan mediene utvises direkte inn i RNA-stabiliserende buffere.
8. WinCF FLUD-systemet
MERK: WinCF Fluid Load Utility Device (FLUD) System er en valgfri pakke med komplementære enheter designet for å optimalisere gjennomføringen av WinCF System. WinCF FLUD-systemet består hovedsakelig av 3D-utskrivbare materialer. 3D-trykt produksjon muliggjør rask og enkel utskifting av materialer for å sikre minimal nedetid for forskere samt minimal produksjonskrav. Design, stl-filer, 3D-utskriftsanvisninger og WinCF FLUD-håndboken er tilgjengelige i online-tilleggetnt.
- Forbereder media for kapillærrør lasting
- I et sterilt biohood fyller åtte sterile 2 ml mikrocentrifugerør med 900 μL medium hver.
- Homogeniser eventuelle sputumprøver ved å trekke ut og skifte sputumet gjentatte ganger med en 3 ml sprøyte (en plastsprøyte uten nålen). Gjør dette til sputumet har jevn konsistens.
- Tilsett 100 μl homogenisert sputum til hvert mikrocentrifugerør (1/10 fortynning i medium) fremstilt i trinn 8.1.1. Vortex rørene i 30 s for å blande tilstrekkelig.
- Slå de fyldte og åpne mikrocentrifugerørene inn i rotorrørholderen orientert slik at rørene er vertikale.
- Plassering av kapillærrør
- Hent tre kapillærrør for hvert mikrocentrifugerør i trinn 8.1.
- Slå tre rør inn i gummistangen slik at de er justert med mikrocentrifugerørene i den andre enden av apparatet.Sørg for at de merkede endene av rørene vende bort fra mikrosentrifugerør. Monter de tre hullene på bunnen av holderen ordentlig over tre pigger på holderen stå.
- Med de monterte kapillarrørene hviler i sine føringskanaler i anordningen, plasserer gummi tamp over sine midsections sikkert mot forskyvninger. (Se figur 4)
Figur 4: FLUD System fullastet med Kapillærrør Sikret av Rubber tamp over sine midsections. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Last media inn i kapillarrørene
- bruke omhyggelig ene hånd for å gripe den ende av apparatet hvor kapillarrørene er loAded, og bruk den andre hånden til å holde rotorholderen der mikrocentrifugerørene er lastet.
- Vri roter mikrocentrifugestativet slik at mikrocentrifugerørene er nesten horisontale og fortsett å sakte skyve racket mot kapillærrørene. (Se figur 5 )
- Når endene av kapillærrørene kommer i kontakt med media i mikrocentrifugerørene, sørg for at kapillærvirksomheten umiddelbart begynner å fylle kapillærrørene. For å justere fyllhastighet og fyllingsnivå, roter forsiktig apparatet som helhet. Når du gjør dette, vær forsiktig så du ikke spilder media ut av mikrocentrifugerørene. (Se figur 6 )
- Når kapillærrørene er fylt til ønsket nivå, plasser apparatnivået på en overflate og trekk forsiktig, men raskt trekk rekken av mikrocentrifugerør av endene av kapillærrørene for å slutte å fylle. Mikrocentrifugerørene kan nå trekkes helt tilbake til vertikal stilling og lukket.
- Tetning de utstående endene av kapillærrørene ved å trykke en tetningsmasse blokk på hvert trippelt sett, forsegle ett sett om gangen til alle settene er forseglet. For å redusere risikoen for forurensning, trykk en annen del av tetningsmasseblokken på hvert trippelt sett (se figur 7 ).
Figur 5: FLUD-systemet med mellomstore rør utplassert til horisontal orientering, klar til å få kontakt med kapillarrør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: FLUD-systemet med kapillærrør laster med medier via kapillærvirkning. klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Forsegling fylt kapillærrør på FLUD-systemet Ett trippel sett til gang ved bruk av en forseglingsblokk. Denne tetningsmasseblokken hadde plast langs kantene som ble avskåret for å hindre kontakt med nærliggende trippelsett under forsegling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- inkubasjon
- Ta av gummikampen over røret mellom midseksjonene og løft gummiskuffen av hovedapparatet. Dette bør ta alle kapillærrørene med den. Sett nå vuggen og rørene holdes på bildebeholderen. Dette raCk har tre stubber som passer inn i vuggen, samt små guidekanaler for å sette rørene inn.
- Sett bildestativet som helhet inn i den klare plastinkubasjonsboksen. Soak små mengder sterile papirhåndklær i sterilt vann og plasser langs de to kortere sidene av esken for å gi fuktighet under inkubasjon. (Se figur 8 )
- Lukk boksen helt og sett inn i en 37 ° C inkubator, sørg for å holde rørene horisontale. Inkubér i 48 timer.
Figur 8: Kapillærrør i gummikuffen Overført fra FLUD-system til en imagingstativ, som er plassert i en klar inkubasjonsboks sammen med damppapirhåndklær for å gi fuktighet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av ther figur.
- Imaging og utvinning
- Fjern bilde stativet som holder rørene fra inkubasjonen esken og sette den på en lysboks, belyst nedenfra. Når rørene er allerede i billed stativet, vil triplikat settene er hensiktsmessig fordelt, og klar til å bilde umiddelbart.
- Fokusere kameraet på rørene slik at alle er synlig i synsfeltet, og lys fra den lyse boksen gir tilstrekkelig kontrast og visualisering av fargen i røret fargestoffer. Fotografi fra rett over.
- For å ekstrahere innholdet av rørene, fjerne kapillarrørene fra gummi vugge ett sett av triplikater om gangen. Løft forsiktig rørene opp og ut av holderen eller skyve dem ut.
- For hvert sett av tre paralleller, følger utvinning prosedyren beskrevet i trinn 7.1 gjennom 7.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrobiologisk vekst på tvers av de forskjellige kjemiske forholdene indusert i prøvene varierte dramatisk i noen tilfeller og mer subtilt hos andre. Mange endringer i aktiviteten var visuelle i naturen, og det var tydeligvis så snart inkuberingsperioden avsluttet. I eksemplet med pH-manipulasjon varierte prøvene over pH-spektrumet sterkt som vist ved flere faktorer som ble tydelige etter inkubering. Når ingen sputumprøver ble tilsatt til mediet, viste den eneste forandringen over pH-spektret etter 48 timers inkubasjon en liten reduksjon i mediumvolumet som følge av mindre fordampning ( figur 9 ). Inokulerte kapillærrør utstilte endringer i volum, utseendet av gassbobler, endret farging og utseendet av ugjennomsiktige avsetninger ( Figur 10 ).
Figur 9: Eksempel pH gradient, kontrollkjøring, postinkubering, ingen sputum tilsatt. De samme kapillærrørene vist i figur 1 etter at de ble inkubert ved 37 ° C i 48 timer. Fargingen forblir stort sett uendret, noe som ikke tyder på signifikante forskyvninger i pH. Litt reduserte mengder av mediet forblir på grunn av mindre fordampning ut av rørets åpne ender under inkubering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Eksempel pH Gradient Results, Post Inkubation, Sputum Lagt, Gass Produksjon Tilsynelatende. Kapillærrør inneholdende kunstig sputummedium etter blanding med sputum fra en CF-pasient. Rørene er arrangert i samme stigende rekkefølgeAv pH som kontrollløp. Bemerkelsesverdige forskjeller fra kontrollkjøringen vist i figur 2 inkluderer store skift i fargestoffer, med utgangspunkt i lave eller midtre pH-rør blir svært lettfarget, hvilket indikerer store dråper i pH. De høyeste pH-rørene endret fargene mindre drastisk, noe som indikerer en mindre endring i pH. Bobler er tilstede i rør med lavt og mellomtemperatur, hvilket indikerer fermentativ anaerobeaktivitet. Ugjennomsiktige seksjoner er også tilstede i alle rør, med høyere mengde i de med lavere pH, hvilket indikerer ytterligere mikrobiel aktivitet av forskjellige slag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Disse resultatene viser at bakterier og andre mikrober inneholdt i det tilsatte sputumet, er i stand til å vokse og forandre seg innenfor det kunstige mediet. Forskjeller mellom de kjemiske forholdene simulert varSterk og lett sammenlignet, viser biofilmproduksjon, gassproduksjon og ulike fargeendringer basert på eventuelle tilsatte indikatorer. I tilfelle av pH-eksperimentet var den viktigste endringen gassproduksjonen, som var mye mer utbredt i rør med lavere pH, med en pH på 6,0 og 6,5 som vanligvis hadde de fleste bobler. Annet ugjennomsiktig materiale ble observert i de fleste rør, hvilket indikerer ytterligere mikrobiel aktivitet som oppstår i media, selv om høyere pH-kapillærrør pleier å ha mindre. De fleste rør hadde antatt en mer gul tone enn før, noe som indikerte at den totale pH i media falt. Medier med høy pH forble vanligvis lik deres opprinnelige fargestoff, noe som indikerer liten forandring i pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mikrobiologiske sammensetningen av en lunge med CF inneholder et stort utvalg av organismer, men forholdene i lungene sannsynlig har en betydelig innflytelse på hva slags mikrober kan overleve og trives 13, 15. Spesifikke mekanismer via hvilke disse forholdene endrer seg, og den eksakte effekten de har på lungen mikrobiomer er vanligvis uklare i dag. I denne eksperimentelle fremgangsmåte presenterer vi en analyse av mikrobiologiske endringer basert på manipuleres kjemiske betingelser i et simulert lunge bronchiole.
Det er noen viktige skritt i protokollen. Å holde den kunstige sputum mediet sterilt før tilsetningen av spyttprøver er viktig når man vurderer mikrobiomer av miljøet som blir analysert. Utenlandske mikrober kunne endre betingelsene og forstyrre nøyaktigheten av bronchiole simulering. Mikrobene kan også outcompete målet patogener i sPutumprøver brukt, kompromittere enhver analyse av endringer etter inkubasjon. Det er kritisk å inkubere kapillærrørene horisontalt. Dette er viktig fordi det muliggjør observasjon av gassproduksjon. Hvis rørene inkuberes vertikalt, kan den produserte gassen stige opp og ut av mediet, noe som gir et utseende av ingen gassproduksjon i det hele tatt. Plugging begge ender kan lette større gassproduksjon uten tap av gass. Imidlertid vil den nødvendige oksygengradienten bli forstyrret.
Protokollen er åpen for flere modifikasjoner, alt fra den kjemiske sammensetningen til mediet til prøvetypene som er inokulert. Spesifikke medisiner kan enkelt legges i forberedelsesstadiene, og forskjellige inkubasjonsbetingelser kan simulere ulike innstillinger der mikroberene vil oppholde seg. Dette eksperimentet brukte også spesifikt sputumprøver inneholdende CF-patogener, men prøver fra andre lungesykdommer kunne erstattes for å spore trender blant de spesiellepatogener.
En viktig begrensning ved denne teknikk er at innholdet i kapillarrørene er i det vesentlige homogenisert ved ekstraksjon fra rørene, mister mye data angående mikrobiell aktivitet ved forskjellige lag i kolonnen medium. For eksempel, ville medium nær den luft potensielt inneholde mer aerobe organismer, med medium inneholdende lenger ned flere anaerobe organismer 12. Disse to separate sett av mikrober ville bli blandet sammen dersom rørene ble tømt inn i en beholder for sekvensering eller behandling. Fremtidige studier med WinCF tar sikte på å utvikle metoder til seksjon og visualisere mikrobielle fellesskap gjennom lengden av røret.
Denne tilnærmingen til lunge sputum analysen gir en mer nøyaktig innstilling for vekst av mikrober lunge enn som en tradisjonell agar-plate-metoden, i hvilken kulturer vokser på et fast medium åpen til luft. Prøver som stammer fra bronkioleneEller lignende innstillinger blir mer hensiktsmessig dyrket i kapillærrørarrangementet på grunn av likheter som deles med en faktisk lungebronkiol. Dette eksperimentelle arrangementet står for fysisk plass, sputumkjemi, fuktighet, middels konsistens og oksygengradienter som ville være til stede i en faktisk CF-lunge 12 , 13 .
Denne teknikken kan brukes til å manipulere mange forhold som er relevante for sykdom som involverer lungemikrobiomet. De kjemiske forholdene til det kunstige sputummediet kan lett manipuleres før tilsetning av de ønskede mikrobielle prøver, og gir en praktisk metode for å observere virkningene av mulige behandlinger eller forandringer. For eksempel vil tilsetning av spesifikke typer antibiotika til mediet før tilsetning av lungesputumprøver gi opplysninger om hvordan slik medisinering ville påvirke det mikrobielle samfunn av en lungebrystokiole. WinCF-systemet er et nytt verktøy for å studereLungemikrobiom med direkte kliniske anvendelser. Tradisjonelle metoder for å studere lungemikrobiomet involverer sekvensering av slimprøver direkte, med WinCF kan samfunnet vokse aktivt for å bedre visualisere og analysere sin kollektive metabolisme. Tidligere studier har vist at WinCF godt gjengir mikrobiomet i en sputumprøve 1 , og representerer dermed et effektivt verktøy for eksperimentering med enkeltpatogener, samkulturer og samfunn av organismer som smitter og skader menneskelige lunger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Vertex Pharmaceuticals og Cystisk fibrose Forskning Innovasjonsprisen for finansiering R. Quinn og NIH / NIAID om midler stipend en U01 AI124316-01, en systembiologi tilnærming til behandling av multi-resistente patogener. Vi vil også takke Institutt for mekanisk og Aerospace Engineering ved UCSD er lavere maskinteknikk senior design kurs for å lette samarbeid med ingeniør aspekter ved dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, Suppl 4. S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
