Summary
דרכי הנשימה המחוברות לריר של חולי סיסטיק פיברוזיס (CF) הן סביבה אידיאלית לפטוגנים חיידקים לשגשג. כתב היד מתאר שיטה חדשה לחקר מיקרוביום הריאות CF בסביבה שבה מחקה את המחלה, וכיצד שינויים בתנאים כימיים יכולים להניע דינמיקה מיקרוביאלית.
Abstract
מחלות כרוניות רבות בדרכי הנשימה גורמות לחיבור רירי של דרכי הנשימה. הריאות של אדם עם סיסטיק פיברוזיס הם דוגמה למופת שבו bronchioles שלהם ריר מחוברות ליצור בית גידול נוחים עבור קולוניזציה חיידקים. פתוגנים שונים לשגשג בסביבה זו אינטראקציה זה עם זה נהיגה רבים של סימפטומים הקשורים למחלת CF. כמו כל קהילה מיקרוביאלית, התנאים הכימיים של בית הגידול שלהם משפיעים באופן משמעותי על מבנה הקהילה ועל הדינמיקה. לדוגמה, מיקרואורגניזמים שונים לשגשג ברמות שונות של חמצן או ריכוזי מומס אחרים. זה נכון גם ריאות CF, שבו ריכוזי החמצן הם האמינו לנהוג פיזיולוגיה הקהילה ומבנה. השיטות המתוארות כאן נועדו לחקות את סביבת הריאות ולגדל פתוגנים באופן דומה יותר לזה שממנו הם גורמים למחלה. מניפולציה של הסביבה הכימית של חיידקים אלה משמשת כדי ללמוד כיצד chemistry של דלקות ריאות מסדיר אקולוגיה מיקרוביאלית שלה. השיטה, המכונה מערכת WinCF, מבוסס על מדיום כיח מלאכותי וצינורות נימי צר נועדו לספק שיפוע חמצן דומה לזה קיים bronchioles פקוק ריר. מניפולצית תנאים כימיים, כגון pH התקשורת של לחץ כיח או אנטיביוטיקה, מאפשר ויזואליזציה של הבדלי מיקרוביולוגית בדגימות אלה באמצעות מחוונים בצבע, צופים לייצור גז או ביופילם, או לחילוץ וסדר תכול חומצות הגרעין של כל דגימה.
Introduction
השיטה המתוארת בכתב היד הזה נקראת מערכת WinCF 1. המטרה הכללית של WinCF היא לספק סביבת ניסוי מסוגל לדמות את הסביבה של bronchiole ריאות מלאות ריר. זה יאפשר למערכת צייתנית ללמוד פתוגנים חיידקים של מחלות ריאה עם פנוטיפ ריר הפרשה המוגבר כולל סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אסטמה ועוד. ההליך תוכנן במיוחד עבור המחקר של CF, אשר מאופיין על ידי מוטציות הגורמות פרשות ריאה להיות עבות וקשה לנקות, בסופו של דבר מילוי bronchioles ומעברים קטנים אחרים עם ריר 2. חסימות כאלה ריאות לעכב חילוף הגזים בגלל באוויר שאנו נושמים הוא כבר לא מסוגל להגיע alveoli רבות גם לספק בית גידול קולוניזציה חיידקית 3, 4. חוסר היכולת למנוע התפתחותם של חיידקים בתוךריר ריאות מוגזם בסופו של דבר מוביל לפיתוח של זיהומים כרוניים מורכבים של דרכי הנשימה. קהילות אלה מכילות מגוון של אורגניזמים, כולל וירוסים, פטריות וחיידקים כמו Pseudomonas aeruginosa , כל אינטראקציה זה עם זה 5 , 6 , 7 , 8 . הפעילות של מיקרוביום ריאה CF הוא האמין להיות מעורב בהתלקחויות של סימפטומים הנקראים החמרות ריאתי 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF מאפשר ללמוד את ההתנהגות של הקהילה המיקרוביאלית סביב החמרות אלה, ועכשיו הוא מורחב כדי לשמש מערכת ניסיונית בסיס ללמוד אקולוגיה הריאות של הריאות. באופן מסורתי, החריפות נחקרו באמצעות ניתוח ישיר של דגימות נלקח מן הריאה. גורמים רבים מבלבלים לעשות ניתוח ישיר של מיקרוביאלית בehavior בריאותיו מאתגרות, עם מערכת WinCF, רבי הגורמים הללו יוסרו ואת ההתנהגות של Microbiome הריאות ניתן ללמוד באופן ישיר יותר, המאפשרת ניתוח מדויק יותר של פעילות חיידקים בתוך bronchiole לחשמל-ריר.
מערכת WinCF מספקת שיטה לגדל ולנתח חיידקים באופן אשר מחק באופן יעיל את סביבת הריאות. שיטות מסורתיות חיידקי ריאות גדלים קרובות דגימות culturing מעורבות על צלחות אגרו מסורתיות. שיטות אלה לעזוב את הדגימות פתוחות חמצן אטמוספרי, מזניחות לתת דין וחשבון על היפוקסי ולעתים קרובות בתנאי anoxic למצוא bronchioles ריאות פקוקים עם ריר 12, 13. Culturing על אגרת בתנאים אירוביים דבר כמו הסביבה של ריאות CF והוא יכול להטעות קלינאים וחוקרים בנוגע להתנהגות של פתוגנים כי הם מנסים לטפל. בנוסף, החומרים המזינים לרשות חיידקים על צלחות אגראינם דומים לאלה זמינים כיח בפועל, אשר היוו בשנת WinCF ידי ניצול תקשורת כיח מלאכותית (ASM). כפי שניתן לראות על ידי תרבויות Pseudomonas ב Sriramulu ואח. 14, ASM כולל קבוצה מסוימת של רכיבים המחקה את המשאבים העומדים לרשות חיידקי ליחה גם משכפלת את העקביות הפיסית של ליחה. מכיוון ריאה חולה יש Microbiome ספציפי, המחקר של מיקרואורגניזמים כאלה רצוי מתקיימים התנאים הספציפיים של הריאות גם כן.
המערכת מאפשרת WinCF ניתוח מהיר מניפולציה קלה של תנאי הניסוי לבחון שינויים מיקרוביאליים בדומה לאופן בו הם יתרחשו באופן bronchiole ריאות בפועל. טכניקה זו מאפשרת לחיסון של מספר עצום של סוגי מדגם הקשורים כוללים ליחה, רוק, הפרשות גוף אחרות ותרבויות חיידקים טהורות או מעורבות. האופי של הגדרת הניסוי מאפשר פרשנות חזותית ברורה שלהתנהגות הקהילה מיקרוביאלית נועד לאפשר יישום במורד הזרם קל של מספר רב של הליכים מיקרוביולוגיים ואומיקים. מחקרים כאלה חשובים משום שהרכב הקהילה הבקטריאלית משתנה בהתאם לתנאים הפיזיו-כימיים של סביבתם. עם WinCF התנאים הכימיים של התקשורת יכול להיות מניפולציה כדי לנתח את ההשפעות על פעילות חיידקית. לדוגמה, חומציות של התקשורת ניתן לשנות לפני חיסון עם מדגם. לאחר הדגירה, ניתן להשוות את הפעילות החיידקית בכל אחד מהמצבים הללו באופן ישיר, ומסקנות ניתן להסיק כיצד חיידקים באותם דגימות כיחיים מתנהגים בתגובה ל- pH משתנה. כאן, אנו מתווים את הנהלים ליישום מערכת WinCF ודוגמאות כיצד ניתן להשפיע על הכימיה התקשורתית כדי לחקור את ההשפעות על המיקרוביום הריאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת המניות עבור מדיה המלאכותית כיח
- צור פתרון mucin 5%. להוסיף 1.0 גרם של בטן חזיר מיובשת mucin כדי 20 מיליליטר של מים ללא יונים. חיטוי הפתרון שהתקבל.
הערה: עיקור mucin יהרוס מבנה הטבוע בו; שיטות אחרות כדי לעקר את mucin בצורתה היבשה כוללים עיקור UV ו קרינה. שיטות אלו לא נעשה שימוש נרחב עבור מערכת WinCF זאת. - להוסיף 2.2 גרם של KCl כדי 50 מ"ל של מים ללא יונים ולאפשר פירוק. להוסיף 5.0 גרם של NaCl כדי 50 מ"ל של מים ללא יונים ולאפשר פירוק. החיטוי שני הפתרונות הללו.
- הוספת 100 מ"ג של ה- DNA סלמון זרע 10 מ"ל מים סטריליים deionized. מחממים את הפתרון הזה לכ 85 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך כמה שעות כדי להבטיח פירוק.
- להוסיף 5.0 מ"ג של פריטין כדי 5.0 מ"ל מים סטריליים deionized.
2. הכנה המלאכותית כיח הבינוני
- לְשַׁלֵבאת המרכיבים הבאים: 16 מ"ל של פתרון מלאי mucin, 2.0 מ"ל של פתרון מלאי KCl, 2.0 מ"ל של פתרון המניות NaCl, 200 μL של תחליב חלמון ביצה, 5.6 מ"ל של פתרון מלאי דנ"א, 120 μL של פתרון מלאי פריטין, 5.78 מ"ל של חיוני תמיסת חומצות אמינו, 5.78 מ"ל של תמיסת חומצות אמיניות לא חיוניות, ו -2.44 מ"ל מים סטריליים.
- אם מופיעים כמויות קטנות של משקעים, נער בעדינות כדי לערבב.
- Pipet 5.0 מ"ל של התקשורת לתוך שמונה צינורות סטרילי 15 מ"ל סטרילי.
הערה: התנאים הכימיים של כל צינור יכול להיות מניפולציה לפי הצורך. לדוגמה, פתרונות חיץ ואינדיקטורים pH ניתן להוסיף לכל צינור כדי להשוות התנהגות מיקרוביאלית ברמות pH שונים. הדגמה של זה מוצג בסעיף תוצאות נציג עם 8 רמות pH שונים, מ 5.0 ל 8.5 ב 0.5 pH במרווחים.
- לאחר התנאים הכימיים של התקשורת הם מניפולציה בהצלחה, להקפיא לשימוש מאוחר יותר. התקשורת תישאר יציבה הלוך ושובזן ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים. וורטקס בהפשרה.
3. הכנה של הפעלה מלאה של צינורות נימי
- ב biohood סטרילי, למלא שמונה צינורות microcentrifuge סטרילית עם 250 μL של התקשורת כל.
- לרכוש שמונה צינורות סטרילי יותר 15 מ"ל סטרילי, כל צינור המתאים צינור microcentrifuge המוזכרים בשלב 3.1.
- לעקר מגבת נייר עם פתרון אתנול 70% ולאפשר להתייבש. לאחר יבש, לקרוע את המגבת לחתיכות על ארבעה סנטימטרים רבועים כל אחד, לקמט כל פיסת בתחתית צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לקבלת צינורות נוספים, רסס ויבש מגבות נייר נוספות לפי הצורך.
- עם גוש אחד של נייר בחלק התחתון של כל צנטריפוגה צינור, מעט להפיג כל גוש נייר עם כ 1.0 מ"ל של מים סטריליים כדי ליצור סביבה לחה.
- השג שלוש צינורות נימי זכוכית עבור כל צינור microcentrifuge מוכן בשלב 3.1 בלוק של צינור צינור נימי sealaNt.
- עבור כל צינור microcentrifuge, למלא שלוש צינורות נימי עם התקשורת על 5 מ"מ הרחק סמן כחול ליד החלק העליון של הצינור.
- ממלאים על ידי החזקת קצה אחד של הצינור בצינור microcentrifuge ו הטיה לכיוון כיוון אופקי, המאפשר פעולה נימית להנחות את המדיום לתוך הצינור (ראה איור 1 ).
- עצור את מילוי ידי בעדינות הנחת אצבע כפפה מעל הקצה הפתוח של הצינור, ולאחר מכן לאטום את הקצה השני של הצינור על ידי לחיצה על זה לתוך בלוק איטום.
איור 1: דוגמה pH מדרון, מילוי צינור נימי עם בינוני כיח מלאכותי. המדיום מתווסף על ידי החדרת קצה אחד של הצינור לתוך הנוזל והטיה כדי להקל על פעולה נימית. הצבע הבינוני בדוגמה זו נובע ממחוון pH שנוסף כדי לעזור לשדלשרטט שינויים פוטנציאליים בחומציות לאחר הדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- מניחים כל קבוצה של שלוש צינורות נימי לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל מלא מגבות נייר רטוב לחלוטין עם מים סטריליים, בצד אטום מרק למטה. מכסה את הצינור ואת התווית. אלה שלוש צינורות נימי הם עבור שכפול של כל מצב שליטה.
- כאשר כל 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל מלאים צינורות נימי המיועדים שלהם, במקום צינורות במעמד מחזיק. מניחים את המדף כך צינורות יהיה מודגרת אופקית (לתפוס בועות גז) (ראה איור 2 ). דגירה צינורות נימי בתוך צינורות צנטריפוגה (המכיל את גושי נייר לחים) על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
איור 2: דוגמה pH מדרון, צינורות נימי מוכן הדגירה. לאחר שלוש צינורות נימי כבר מלא וחתום, הם ממוקמים צינור צנטריפוגות עם מגבת נייר לחה בתחתית. צינור זה הוא כתרים מכן והכניסו לתוך מתלה. המדף חייב להיות בכיוון הצידה במהלך הדגירה, כפי שתואר כאן, כך ייצור גז ניתן לראות לאחר הדגירה הושלם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
4. הדמיה של צינורות נימי השליטה לאחר הדגירה
- הסר את המדף של צינורות צנטריפוגה מן האינקובטור, הקפד לשמור על צינורות אופקי. בזהירות להחליק את צינורות נימי מתוך צינורות צנטריפוגה, שמירה על כל קבוצה של שלושה נפרדים מכל קבוצות אחרות.
- מסדרים את צינורות נימי ליד אחד על תיבת אור, כל בשורה בשורה כך התוכן של הצינורות הוא מוארIble ו מואר. השאירו פער כל שלוש צינורות להפריד בין תנאים כימיים שונים.
- כשהצינורית מתואמת והאור הנפתח דולק, צולם ישירות מעל. (ראה איור 3 )
איור 3: דוגמה pH מדרון, בקרת הפעלה, טרום הדגירה, לא הוסיף כיח. בינוני כיח מלאכותי לאחר שנוספו צינורות נימי בסטים של שלושה, הגדלת ה- pH משמאל לימין. השילוב של אינדיקטורים שנוספו לתוצאה הבינונית מופיעים צינורות חומציים יותר המופיעים בצהוב יותר, בעוד צינורות חומציים פחות הופכים סגולים יותר. הצינורות מסודרים בצורה אופקית ומוארים מלמטה, מצולמים מלמעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- להשליךחומרי בקרה בפסולת ביולוגית מסוכנת.
5. מחסן את צינורות נימי WinCF עם מדגם כיח
- ב biohood סטרילי, למלא שמונה צינורות microcentrifuge סטרילית עם 225 μL של התקשורת כל.
- Homogenize המדגם כיח ידי נסיגה ו פולט את כיח שוב ושוב עם מזרק 3 מ"ל (מזרק פלסטיק ללא מחט). האם זה עד כיח היא עקביות חלקה.
- הוסף 25 μL של כיח הומוגניזציה לכל צינור microcentrifuge (דילול 1/10 במדיה ASM) מוכן בשלב 5.1. ואז מערבולת צינורות במשך 30 s לערבב מספיק.
- הוסף את התקשורת צינורות נימי בעקבות הליך זהה צעדים 3.2 עד 3.5.
6. הדמיה של צינורות נימי מדגם לאחר הדגירה
- לאחר זמן הדגירה 48 שעות, להסיר את התמונה צינורות נימי בעקבות הליך זהה צעדים 4.1 עד 4.3.
- אם בועות קיימות בצינורות, לעשותאין ספק שהתצלומים שצולמו מתארים בבירור את התיחום שבין הבועות לבין אמצעי התקשורת בצינורות. אם biofilm קיים, לוודא את התמונות יכול בבירור לתאר את נוכחותו גם כן.
7. הסרת מדיה עבור יישומים downstream
- כדי להקל על ניתוח downstream, להסיר את התקשורת מן צינורות נימי לאחר ההדמיה. יישומים פוטנציאליים כוללים culturing ו- DNA / RNA רצף פרופיל metabolomic.
זהירות: צינורות זכוכית נימי מלאים פתוגנים הם biohazard משמעותי, ולכן, צעדים אלה חייבים להיעשות בזהירות רבה עם ציוד ספציפי. אם צינורות נימי לשבור, להיפטר במיכל חדים ראוי biohazard. - השתמש בוטה הסתיים מחטים של 25 מד ו 0.5 אינץ 'אורך כדי להסיר את התקשורת. הכנס את המחט הסתיימה קהה לתוך הקצה המחובר של הצינור כדי לשבור את החותם.
- לאחר שבירת החותם, להפוך את צינור נימי הפוך את התקשורת יהיה לטפטף מתוך החלק העליון. אניF התקשורת לא לטפטף בקלות, להשתמש פיפטה עם קצה 200 μL ולגרש את התקשורת מתוך הצינור על ידי לחיצה על הבוכנה פיפטה כאשר מוכנס לתוך קצה צינור נימי. איסוף התקשורת צינור המגורש במיכל המתאים (1.5 צנטריפוגה צינור מ"ל).
הערה: עבור ניתוח transcriptomic או RNA אחרים, התקשורת ניתן לגרש ישירות לתוך RNA מייצב מאגרים.
8. מערכת FLC WinCF
הערה: מערכת השירות WinDF Fluid Loading Utility (FLUD) היא חבילת אופציונלית של מכשירים משלימים המיועדים לייעל את התפוקה של מערכת WinCF. מערכת ה- FLC של WinCF מורכבת בעיקר מחומרים להדפסה תלת-ממדית. 3D מודפס ייצור מאפשר החלפת מהירה וקלה של חומרים כדי להבטיח זמן השבתה מינימלי לחוקרים, כמו גם דרישות ייצור מינימלי. עיצובים, קבצי stl, הוראות הדפסה 3D ו המדריך WinCF FLUD זמינים suppleme באינטרנטNT.
- תקשורת כנה לקראת העמסת צינור נימים
- In a biohood סטרילי, למלא שמונה 2 סטרילי צינורות microcentrifuge מ"ל עם 900 μL של מדיום אחד.
- Homogenize כל דגימות כיח ידי משיכת ולהוציא ליחה שוב ושוב עם מזרק מ"ל 3 (מזרק פלסטיק ללא מחט). האם זה עד הרוק של עקביות חלקה.
- הוספת 100 μL של כיח הומוגני לכל צינור microcentrifuge (1/10 דילול במדיום) מוכן בשלב 8.1.1. ואז מערבולת הצינורות עבור 30 s לערבב מספיק.
- ומשחיל את צינורות microcentrifuge מלאים ופתוחים לתוך מחזיק צינור מסובבי אוריינטציה כך צינורות אנכיים.
- המיקום של צינורות נימי
- תחזור שלושה צינורות נימים עבור כל צינור microcentrifuge בשלב 8.1.
- שלושה חריץ צינורות לתוך תושבת הגומי כך שהם מיושרים עם צינורות microcentrifuge בקצה השני של המנגנון.ודא הקצוות המסומנים של צינורות הפנים הרחק צינורות microcentrifuge. התקינו את שלושת החורים בתחתית העריסה כראוי מעל שלושת החוטים על מעמד העריסה.
- עם צינורות הנימי הניח נח בערוצי המדריך שלהם על המנגנון, מניחים את הגומי גומי מעל midtsections שלהם בבטחה כדי למנוע זז. (ראה איור 4 )
איור 4: מערכת FLUD טעון לחלוטין עם צינורות נימי מאובטח על ידי כבש גומי מעל הבצעים שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- טעינת חומרי הדפסה לתוך צינורות נימי
- בזהירות להשתמש ביד אחת לתפוס את קצה המנגנון שבו צינורות נימי הםAded, ולהשתמש ביד השנייה להחזיק את מתלה מסובב שבו צינורות microcentrifuge נטענים.
- בעדינות לסובב את המדף microcentrifuge כך צינורות microcentrifuge כמעט אופקית ולהמשיך לאט לדחוף את המדף לכיוון צינורות נימי. (ראה איור 5 )
- כאשר הקצוות של צינורות נימי ליצור קשר עם התקשורת צינורות microcentrifuge, להבטיח פעולה נימית מיד מתחיל למלא את צינורות נימי. כדי להתאים את קצב המילוי ואת רמת המילוי, סובב בעדינות את המנגנון כמכלול. בעת ביצוע פעולה זו, היזהר לא לשפוך מדיה מתוך צינורות microcentrifuge. (ראה איור 6 )
- כאשר צינורות נימי מלאים לרמות הרצויות, במקום את רמת המנגנון על משטח בזהירות בזהירות עדיין למשוך את המדף של צינורות microcentrifuge את הקצוות של צינורות נימי להפסיק מילוי. צינורות microcentrifuge יכול עכשיו להיות נסוג כל הדרך חזרה למצב אנכי ונסגר.
- חותם את הקצוות המזדקרים של צינורות נימים ידי לחיצת בלוק איטום על כל סט בשלושת עותקים, איטום קבוצה אחת בכל פעם, עד שכל הסטים חתומים. כדי להפחית את הסיכון של זיהום, ללחוץ על חלק אחר של גוש חומר איטום על כל סט בשלושה עותקים (ראה איור 7).
איור 5: מערכת FLUD עם בינוני צינורות להתפרס אוריינטציה אופקית, מוכן ליצור קשר עם צינורות נימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: מערכת FLUD עם נימי צינורות טעינה עם מדיה באמצעות כוח הנימיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: אטימה מילוי צינורות נימי על מערכת FLUD אחד להגדיר טריפליקט בכל פעם באמצעות בלוק איטום. בלוק איטום זה היה פלסטיק לאורך הקצוות שנחתך כדי למנוע מגע עם ערכות בשלושה עותקים שכנים במהלך האיטום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- דְגִירָה
- הסר את הגומי גומי מעל צינורות צינור ולהרים את עריסת הגומי את המנגנון הראשי. זה צריך לקחת את כל צינורות נימי עם זה. עכשיו להגדיר את העריסה ואת צינורות מוחזקים על המדף הדמיה. Raיש ck שלושה תלושים שמתאימים לתוך התושבת, כמו גם ערוצי מדריך קטנים כדי להגדיר את הצינורות לתוך.
- הגדר את מתלת ההדמיה בכללותו לתוך תיבת דגירת פלסטיק השקופה. משרים כמויות קטנות של מגבות נייר סטרילי במים סטריליים ולמקם יחד שני הניצבים של התיבה כדי לספק לחות במהלך הדגירה. (ראה איור 8)
- סגור את התיבה לחלוטין ולהגדיר בתוך 37 ° C חממה, והקפד לשמור על הצינורות אופקיים. דגירה של 48 h.
איור 8: צינורות נימים ב גומי ערש הועברו FLUD מערכה אל הדמית Rack, אשר הושמה בתוך קופסא דגירה נקה לצד לח נייר מגבות כדי לספק לחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של ההוא דמות.
- הדמיה והפקת
- הסר את המדף הדמיה מחזיק את הצינורות מן תיבת הדגירה ולהגדיר אותו על lightbox, מואר מלמטה. עם צינורות כבר במעמד הדמיה, קובע בשלושה עותקים יהיה מרווח כראוי ומוכן התמונה מיד.
- פוקוס את המצלמה על צינורות כגון כל גלויים בתחום התצוגה ואת האור מתוך תיבת האור מספק מספיק ניגודיות הדמיה של צבע בצינורות הצינור. תצלום מלמעלה.
- כדי לחלץ את תכולת הצינורות, להסיר את צינורות נימי מן עריסה גומי אחד סט של שלושה עותקים בכל פעם. בעדינות להרים את הצינורות למעלה או החוצה של העריסה או להחליק אותם החוצה.
- עבור כל קבוצה של triplicates, בצע את הליך החילוץ מפורט בשלבים 7.1 עד 7.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גידול מיקרוביולוגי על פני התנאים הכימיים השונים המושרה בתוך הדגימות השתנה באופן דרמטי במקרים מסוימים ועוד בעדינות באחרים. שינויים רבים בפעילות היו חזותיים בטבע, להיות ברור מיד עם סיום תקופת הדגירה. בדוגמה של מניפולציה pH, דגימות פני ספקטרום ה- pH השתנו מאוד כפי שמוצג על ידי גורמים מרובים שהתגלו לאחר הדגירה. כאשר לא נוספו דגימות כיח לתקשורת, השינוי היחיד המוצג על פני הספקטרום pH לאחר 48 שעות של הדגירה היה ירידה קלה נפח בינוני הנובע אידוי קטין ( איור 9 ). צינורות נימי מחוסן הציג שינויים נפח, את המראה של בועות גז, שינוי צבע, ואת המראה של הפקדות אטום ( איור 10 ).
איור 9: Gradient pH דוגמה, בקרת הפעלה, פוסט-הדגירה, אין כיח נוסף. אותם צינורות הנימים שמוצגים באיור 1 לאחר וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. הצבעוניות נשארת ללא שינוי, במידה רבה, המציין אין משמרות משמעותיות pH. כמויות מופחתות במעט של המדיום להישאר עקב אידוי קטין מחוץ הקצוות הפתוחים של הצינורות במהלך דגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 10: תוצאות Gradient pH דוגמה, הודעה דגירה, כיח נוסף, ייצור גז לכאורה. צינורות נימים המכילים בינוני כיח מלאכותית לאחר מעורבב עם כיח מחולת CF. הצינורות מסודרים לפי סדר עולה אותושל pH כמו לשלוט לרוץ. הבדלים בולטים מהריצת הבקרה המוצגת באיור 2 כוללים שינויים משמעותיים בצבע, עם צינורות pH נמוך או באמצע טווח הופכים צבעוניים מאוד, המציין טיפות גדולות ב- pH. צינורות ה- pH הגבוהים שינו את הצבע באופן דרסטי פחות, דבר המצביע על שינוי קטן יותר ב- pH. בועות נמצאות בצינורות של pH נמוך ובינוני, דבר המעיד על פעילות אנאירובית תוססת. סעיפים אטומים נמצאים גם בכל צינורות, עם כמות גבוהה יותר של אלה של pH נמוך, המציין פעילות מיקרוביאלית נוספת של מיני שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוצאות אלו מראות כי חיידקים וחיידקים אחרים הכלולים בתוך כיח נוסף יכולים לגדול ולשנות בתוך המדיום המלאכותי. ההבדלים בין התנאים הכימיים המדומים היוסטאר בקלות להשוות, מפגין ייצור biofilm, ייצור גז, ושינויי צבע שונים המבוססים על כל אינדיקטורים הוסיף. במקרה של ניסוי ה- pH, השינוי המשמעותי ביותר היה ייצור הגז, שהיה הרבה יותר נפוץ בצינורות של pH נמוך יותר, עם pH של 6.0 ו -6.5 בדרך כלל יש את רוב הבועות. חומר אטום אחר נצפתה ברוב צינורות, המעידים על פעילות מיקרוביאלית נוספת המתרחשת בתקשורת, אם כי צינורות pH גבוה נימי יש פחות. רוב הצינורות הניחו צליל צהוב יותר מאשר קודם לכן, מה שמראה כי pH הכולל של התקשורת ירד. מדיה של pH גבוה בדרך כלל נשאר דומה צבעוני הראשוני שלהם, המעיד על שינוי קטן ב- pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האיפור המיקרוביולוגי של ריאה עם CF מכיל מגוון רחב של אורגניזמים, אבל התנאים בתוך הריאה סביר להניח השפעה משמעותית על מה סוגים של חיידקים יכולים לשרוד ולשגשג 13 , 15 . מנגנונים ספציפיים שדרכם משתנים התנאים הללו והאפקטים המדויקים שיש להם על המיקרוביום הריאות אינם ברורים כיום. בשיטה זו ניסיוני, אנו מציגים ניתוח של שינויים מיקרוביולוגיים המבוססים על תנאים כימיים מניפולציה בברונכיאה ריאה מדומה.
ישנם כמה צעדים קריטיים של הפרוטוקול. שמירה על ביצה מלאכותית כימית בינוני לפני תוספת של דגימות כיח חשוב כאשר בוחנים את microbiome של הסביבה להיות מנותח. חיידקים זרים יכולים לשנות את התנאים ולשבש את הדיוק של הסימולציה של הסימפונות. החיידקים יכולים גם outcompete היעד pathogens ב sדגימות putum בשימוש, להתפשר בשום ניתוח של שינויים-דגירה פוסט. זה קריטי כדי דגירת צינורות הנימים אופקיות. זה חשוב כי זה מאפשר תצפית של הפקת הגז. האם הצינורות וטופחו אנכיים, הגז המופק עשויים לקום מתוך המדיום, שייתן מראה של שום ייצור גז בכלל. פקיקה בשני הקצוות יכולים להקל ייצור גז גדול ללא הפסד של גז. עם זאת, שיפוע החמצן ההכרחי ייפגע.
הפרוטוקול פתוח במשך כמה שינויים, החל את ההרכב הכימי של תקשורת סוגי דגימות המחוסנות. תרופות ספציפיות ניתן להוסיף בקלות בשלבי ההכנה, ותנאי דגירה שונים יכולים לדמות הגדרות שונות בן החיידקים הם מיועדות. ניסוי זה גם במפורש השתמש בדגימות כיח המכילות פתוגנים CF, אך דגימות ממחלות ריאה אחרות לא יוכל להחליף כדי לעקוב אחר מגמות בקרב אלו בפרטפתוגנים.
אחת המגבלות החשובות של טכניקה זו היא כי התוכן של צינורות נימי הם homogenized במהותו עם החילוץ מן הצינורות, ויתור על נתונים רבים על פעילות מיקרוביאלית בשכבות שונות בתוך העמודה של המדיום. לדוגמה, בינוני קרוב לאוויר עשוי להכיל יותר אורגניזמים אירוביים, עם בינוני למטה למטה המכיל אורגניזמים אנאירוביים יותר 12 . אלה שתי קבוצות נפרדות של חיידקים יהיה מעורבב יחד אם הצינורות היו מרוקנים לתוך קיבול עבור רצף או עיבוד. מחקרים עתידיים עם WinCF שואפים לפתח שיטות לחלק ולדמיין את הקהילה חיידקים לאורך אורך הצינור.
גישה זו לניתוח כיח הריאות מספק הגדרה מדויקת יותר לצמיחה של חיידקים הריאות מאשר שיטה מסורתית אגר צלחת, שבו תרבויות לגדול על בינוני מוצק פתוח לאוויר. דוגמאות שמקורן בברונצ'יוליםאו הגדרות דומות הם מתורבתים יותר כראוי שבהסדר צינור נימים בשל דמיון משותף עם bronchiole ריאות בפועל. הסדר ניסיוני זה מסביר את המרחב הפיזי, כימית ליחה, הלחות, העקביות בינונית, והדרגות חמצן כי תהיינה נוכח בבית ריאות CF בפועל 12, 13.
טכניקה זו יכולה לשמש כדי לתפעל מצבים רבים רלוונטיים מחלה הכרוכה Microbiome הריאות. התנאים הכימיים של מדיום כיח המלאכותי ניתן להשפיע בקלות לפני הוספת דגימות החיידקים הרצויות, מתן שיטה נוחה לצפות את ההשפעות של טיפולים או שינויים אפשריים. לדוגמה, תוספת של סוגים מסוימים של אנטיביוטיקה למדיום לפני הוספת דגימות כיח ריאות יספק נתונים לגבי כיצד תרופות כאלה ישפיעו על הקהילה מיקרוביאלי של bronchiole ריאות. מערכת WinCF היא כלי חדש כדי לחקור אתMicrobiome ריאות עם יישומים קליניים ישירים. שיטות מסורתיות של לימוד Microbiome הריאות לערב דגימות ריר רצף ישירות, עם WinCF הקהילה ניתן לגדל באופן פעיל כדי להמחיש טוב יותר ולנתח את חילוף החומרים הקולקטיביים שלה. מחקרים קודמים הראו כי WinCF גם מתרבה Microbiome במדגם ליחה 1, ובכך, הוא מייצג כלי יעיל עבור ניסויים עם פתוגנים יחיד, שיתוף תרבויות וקהילות של אורגניזמים להדביק והריאות האנושי נזק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ורטקס תרופות ופרס חדשנות מחקר סיסטיק פיברוזיס למימון ר קווין ו- NIH / NIAID עבור 1 מענק מימון U01 AI124316-01, גישה ביולוגיה מערכתית לטיפול של פתוגנים עמידים רב-סמים. אנחנו גם רוצים להודות במחלקה מכונות להנדסת אווירונוטיקה וחלל כמובן עיצוב מכני הנדסי בכיר לתואר ראשון של UCSD עבור הקלת בשיתוף עם היבטים הנדסיים של העבודה הזאת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, Suppl 4. S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
