Summary
बलगम खामियों को दूर सिस्टिक फाइब्रोसिस के वायुमार्ग (CF) रोगियों माइक्रोबियल रोगज़नक़ों पनपने के लिए एक आदर्श वातावरण है। पांडुलिपि कि नकल करता है, जहां वे रासायनिक परिस्थितियों के रोग और कैसे परिवर्तन का कारण माइक्रोबियल गतिशीलता ड्राइव कर सकते हैं वातावरण में सीएफ फेफड़ों Microbiome के अध्ययन के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन है।
Abstract
कई पुराने एयरवे रोगों वायुमार्ग की बलगम plugging में परिणाम। सिस्टिक फाइब्रोसिस के साथ एक व्यक्ति के फेफड़ों एक अनुकरणीय मामले में जहां उनके बलगम-खामियों को दूर ब्रांकिओल्स माइक्रोबियल उपनिवेशन के लिए एक अनुकूल वास बनाने हैं। विभिन्न रोगजनकों इस माहौल को एक दूसरे के साथ बातचीत और CF रोग के साथ जुड़े लक्षण के कई ड्राइविंग में कामयाब। किसी भी माइक्रोबियल समुदाय की तरह, उनके निवास स्थान की रासायनिक परिस्थितियों समुदाय संरचना और गतिशीलता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न सूक्ष्मजीवों ऑक्सीजन या अन्य घुला हुआ पदार्थ सांद्रता के भिन्न स्तरों में कामयाब। यह भी सीएफ फेफड़े, जहां ऑक्सीजन सांद्रता समुदाय शरीर विज्ञान और संरचना ड्राइव करने के लिए माना जाता है में सच है। यहाँ वर्णित तरीकों फेफड़ों पर्यावरण नकल करते हैं और अधिक है कि जहां से वे बीमारी का कारण समान तरीके से रोगजनकों विकसित करने के लिए डिजाइन किए हैं। इन रोगाणुओं का रासायनिक परिवेश में हेरफेर तो अध्ययन करने के लिए कैसे chemi प्रयोग किया जाता हैफेफड़ों के संक्रमण का स्टेरी अपने माइक्रोबियल पारिस्थितिकी को नियंत्रित करता है विधि, जिसे WinCF प्रणाली कहा जाता है, कृत्रिम थूक माध्यम और संकीर्ण केशिका ट्यूबों पर आधारित होती है जिसका मतलब आक्सीजन प्लग प्लग ब्रॉन्किलोल में मौजूद ऑक्सीजन ढाल प्रदान करने के लिए होता है। थूक या एंटीबायोटिक दबाव के मीडिया पीएच जैसे रासायनिक परिस्थितियों में हेर-फेर करना, उन नमूनों में सूक्ष्मजीवविज्ञानी अंतर को देखने के लिए अनुमति देता है जो रंग के संकेतकों का उपयोग करते हैं, गैस या बायोफिल्म उत्पादन के लिए देख रहे हैं, या प्रत्येक नमूने के न्यूक्लिक एसिड सामग्री को निकालने के लिए।
Introduction
विधि इस पांडुलिपि में वर्णित WinCF प्रणाली 1 कहा जाता है। WinCF के समग्र लक्ष्य एक प्रयोगात्मक सेटअप एक बलगम से भरे फेफड़ों bronchiole का वातावरण अनुकरण करने में सक्षम प्रदान करना है। यह एक विनयशील प्रणाली सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF), क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी), अस्थमा और अन्य सहित एक बलगम hypersecretion phenotype के साथ फेफड़ों के रोगों की माइक्रोबियल रोगज़नक़ों का अध्ययन करने के लिए अनुमति देगा। प्रक्रिया सीएफ के अध्ययन है, जो उत्परिवर्तन का कारण फेफड़ों के स्राव मोटी और हार्ड स्पष्ट करने के लिए बनने के लिए, अंत में बलगम 2 के साथ ब्रांकिओल्स और अन्य छोटे गलियारों भरने की विशेषता है के लिए विशेष रूप से डिजाइन किया गया था। फेफड़ों में इस तरह की रुकावटों गैस विनिमय रोकना क्योंकि साँस हवा नहीं रह गया है कई एल्वियोली तक पहुँचने और भी बैक्टीरियल उपनिवेशवाद 3, 4 के लिए एक निवास स्थान प्रदान करने में सक्षम है। असमर्थता में माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिएअत्यधिक फेफड़ों बलगम अंततः airway के जटिल दीर्घकालिक संक्रमण के विकास के लिए होता है। ये समुदाय, वायरस, कवक, और Pseudomonas aeruginosa की तरह बैक्टीरिया सहित जीवों की एक किस्म के होते हैं सब एक दूसरे के 5, 6, 7, 8 के साथ बातचीत। सीएफ फेफड़ों Microbiome की गतिविधि लक्षण फेफड़े तीव्रता 1, 9, 10, 11 कहा जाता है की फ्लेयर्स में शामिल होना माना जाता है। WinCF इन तीव्रता के आसपास माइक्रोबियल समुदाय व्यवहार के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है और अब फेफड़ों माइक्रोबियल पारिस्थितिकी अध्ययन करने के लिए एक आधार के प्रायोगिक प्रणाली के रूप में कार्य करने के लिए विस्तारित किया जा रहा है। परंपरागत रूप से, तीव्रता फेफड़ों से लिए गए नमूनों की प्रत्यक्ष विश्लेषण के माध्यम से अध्ययन किया गया है। कई कारकों माइक्रोबियल ख के प्रत्यक्ष विश्लेषण करनाWinCF प्रणाली के साथ चुनौती देने वाले फेफड़ों के व्यवहार में, इन कारकों में से कई को हटा दिया जाता है और फेफड़े की सूक्ष्मजीवों के व्यवहार को अधिक सीधे अध्ययन किया जा सकता है, जिससे बलगम-प्लग किए गए ब्रॉन्कियोले में बैक्टीरिया गतिविधि के बेहतर विश्लेषण की अनुमति मिलती है।
WinCF प्रणाली बैक्टीरिया को बढ़ने और विश्लेषण करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है जिससे कि फेफड़े के वातावरण को प्रभावी ढंग से मिमिक्स किया जाता है। बढ़ते फेफड़ों के जीवाणुओं के लिए पारंपरिक तरीके अक्सर पारंपरिक अगर प्लेटों पर संवर्धन नमूनों को शामिल करते थे। इन विधियों ने नमूनों को वायुमंडलीय ऑक्सीजन के लिए खुला छोड़ दिया, फेफड़ों के ब्रोंकोइल में पाए गए हाइपोक्सिक और अक्सर अनॉक्सिक स्थितियों के लिए खासतौर पर बलगम 12 , एरोबिक स्थितियों के तहत अगर पर संगृहीत सीफ फेफड़े के वातावरण की तरह कुछ नहीं है और वे चिकित्सकों और शोधकर्ताओं को उन रोगजनकों के व्यवहार से गुमराह कर सकते हैं जो वे इलाज करने की कोशिश कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, अगर प्लेटों पर बैक्टीरिया के लिए उपलब्ध पोषक तत्ववास्तविक थूक में उपलब्ध उन लोगों के लिए असमान हैं, जो कृत्रिम थूक मीडिया (एएसएम) का उपयोग करके WinCF में शामिल है। जैसा कि श्रीरामू एट अल में स्यूडोमोनस संस्कृतियों द्वारा दिखाया गया है 14 , एएसएम में ऐसे घटकों का एक विशिष्ट समूह शामिल है जो थकावट के रोगियों के लिए उपलब्ध संसाधनों की नकल करते हैं और स्टेमम की शारीरिक स्थिरता का भी प्रतिकृति करते हैं। क्योंकि एक रोगग्रस्त फेफड़े की एक विशिष्ट सूक्ष्मजीव होती है, ऐसे सूक्ष्मजीवों का अध्ययन आदर्श रूप से फेफड़ों की विशिष्ट स्थितियों में भी होना चाहिए।
WinCF प्रणाली तेजी से विश्लेषण और प्रयोगात्मक शर्तों का आसान हेरफेर करने के लिए माइक्रोबियल परिवर्तनों का पालन करने के लिए सक्षम बनाता है जैसा कि वे एक वास्तविक फेफड़ों की ब्रोन्कोइल में होते हैं। इस तकनीक में थूक, लार, अन्य शरीर स्राव और शुद्ध या मिश्रित बैक्टीरिया संस्कृतियों सहित संबंधित नमूना प्रकारों के असंख्य के टीका के लिए अनुमति मिलती है। प्रयोगात्मक सेटअप की प्रकृति के तत्काल दृश्य व्याख्या के लिए अनुमति देता हैमाइक्रोबियल सामुदायिक व्यवहार और सूक्ष्मजीवविज्ञानी और ओमिक्स प्रक्रियाओं की एक भीड़ के आसान डाउनस्ट्रीम आवेदन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। ऐसे अध्ययन महत्वपूर्ण हैं क्योंकि बैक्टीरिया समुदाय संरचना उनके पर्यावरण के भौतिक-संबंधी स्थितियों के आधार पर बदलती है। WinCF के साथ बैक्टीरिया गतिविधि पर प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए मीडिया के रासायनिक परिस्थितियों में हेरफेर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक नमूने के साथ टीका लगाने से पहले मीडिया की अम्लता को बदला जा सकता है। ऊष्मायन के बाद, इन स्थितियों में से प्रत्येक में बैक्टीरिया गतिविधि सीधे तुलना की जा सकती है, और निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि उन थूक नमूने में बैक्टीरिया कैसे भिन्न पीएच के जवाब में व्यवहार करते हैं। यहां, हम WinCF प्रणाली को लागू करने की प्रक्रियाओं को रेखांकित करते हैं और फेफड़े के माइक्रोबायम पर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मीडिया रसायन विज्ञान का उदाहरण कैसे दिखा सकते हैं।
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Protocol
कृत्रिम थूक मीडिया के लिए स्टॉक्स की 1. तैयारी
- एक 5% mucin समाधान बनाएँ। निर्जलित सुअर पेट की 1.0 ग्राम विआयनीकृत जल के 20 एमएल के लिए mucin जोड़ें। जिसके परिणामस्वरूप समाधान आटोक्लेव।
नोट: mucin नसबंदी अपने निहित संरचना को नष्ट कर देगा; अन्य तरीकों इसकी सूखी रूप में mucin नसबंदी यूवी बंध्याकरण और विकिरण शामिल हैं। इन विधियों बड़े पैमाने पर तथापि WinCF प्रणाली के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है। - KCl का 2.2 जी विआयनीकृत जल के 50 एमएल में जोड़े और विघटन के लिए अनुमति देते हैं। सोडियम क्लोराइड का 5.0 जी विआयनीकृत जल के 50 एमएल में जोड़े और विघटन के लिए अनुमति देते हैं। इन दो समाधान आटोक्लेव।
- सामन शुक्राणु डीएनए के 100 मिलीग्राम बाँझ विआयनीकृत जल के 10 एमएल में जोड़े। एक जल स्नान में के बारे में 85 डिग्री सेल्सियस के लिए इस समाधान गरम करें कुछ ही घंटों के विघटन को सुनिश्चित करने के लिए।
- ferritin की 5.0 मिलीग्राम बाँझ विआयनीकृत जल की 5.0 एमएल में जोड़े।
2. कृत्रिम थूक माध्यम की तैयारी
- जोड़नानिम्न घटक: mucin स्टॉक समाधान के 16 एमएल, 2.0 KCl शेयर समाधान के एमएल, 2.0 सोडियम क्लोराइड शेयर समाधान के एमएल, अंडे की जर्दी पायस के 200 μL, डीएनए स्टॉक समाधान के 5.6 एमएल, ferritin शेयर समाधान के 120 μL, आवश्यक के 5.78 एमएल एमिनो एसिड समाधान, गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान के 5.78 एमएल, और बाँझ पानी की 2.44 एमएल।
- यदि तलछट की थोड़ी मात्रा दिखाई देते हैं, मिश्रण धीरे हिला।
- Pipet 5.0 आठ बाँझ 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में मीडिया की एमएल।
नोट: के रूप में वांछित प्रत्येक ट्यूब के रासायनिक परिस्थितियों हेरफेर किया जा सकता। उदाहरण के लिए, बफर समाधान और पीएच संकेतक अलग पीएच स्तर पर माइक्रोबियल व्यवहार की तुलना के प्रयोजन के लिए प्रत्येक ट्यूब में जोड़ा जा सकता। इस का एक प्रदर्शन 5.0 से 0.5 8.5 में पीएच वेतन वृद्धि करने के लिए, 8 अलग पीएच स्तर के साथ प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया है।
- एक बार मीडिया के रासायनिक परिस्थितियों सफलतापूर्वक छेड़छाड़ कर रहे हैं, बाद में उपयोग के लिए फ्रीज। मीडिया इधर-उधर स्थिर रहेगाकई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ज़ेन विगलन पर भंवर
3. केशिका ट्यूब्स के कंट्रोल रन की तैयारी
- एक बाँझ बायोथड में, प्रत्येक 250 μL मीडिया के साथ आठ बाँझ microcentrifuge ट्यूबें भरें।
- आठ और बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब प्राप्त करें, चरण 1 में उल्लिखित एक सूक्ष्मदर्शी ट्यूब के अनुरूप प्रत्येक ट्यूब।
- 70% इथेनॉल समाधान के साथ एक कागज़ के तौलिया को निर्वहन करें और सूखे की अनुमति दें। सूखने के बाद, प्रत्येक चार चौकोर इंच के टुकड़े में तौलिया को फाड़ दें, और 15 मिलीलीटर के अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे प्रत्येक टुकड़े टुकड़े करना। अतिरिक्त ट्यूबों, स्प्रे और ड्राई पेपर तौलिये के लिए आवश्यक के रूप में
- प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब के निचले भाग में कागज़ के एक ढीले के साथ, थोड़ा नम्र पर्यावरण के लिए प्रत्येक पेपर दानेदार को लगभग 1.0 एमएल बाँझ पानी में मिलाया जाता है।
- 3.1 चरण में तैयार प्रत्येक सूक्ष्मदर्शी ट्यूब के लिए तीन गिलास केशिका ट्यूब प्राप्त करें और केशिका ट्यूब पोटीली सीला का एक खंडNT।
- प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब के लिए, ट्यूब के शीर्ष के निकट नीले मार्कर से दूर के बारे में 5 मिमी के लिए मीडिया के साथ तीन केशिका ट्यूब भरें।
- Microcentrifuge ट्यूब में ट्यूब के एक छोर पकड़े और क्षैतिज अभिविन्यास की ओर झुकाव, केशिका क्रिया ट्यूब में मध्यम मार्गदर्शन करने की अनुमति देकर भरें (चित्रा 1 देखें)।
- धीरे ट्यूब के खुले अंत में एक दस्ताने उंगली रखकर भरने बंद करो, और फिर इसे नीचे दबाने सीलेंट ब्लॉक में से ट्यूब के दूसरे छोर सील।
चित्र 1: उदाहरण पीएच ढाल, कृत्रिम थूक माध्यम वाला भरने केशिका ट्यूब। मध्यम तरल में ट्यूब के एक सिरे डालने और केशिका क्रिया की सुविधा के लिए झुकाकर जोड़ा जाता है। इस उदाहरण में मध्यम रंगाई pH इंडिकेटर की वजह से है दानव मदद करने के लिए जोड़ाऊष्मायन के बाद अम्लता में संभावित परिवर्तन करना इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- तीन केशिका ट्यूबों के प्रत्येक सेट को कागज के तौलिये से भरा 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में रखें, पूरी तरह से बाँझ पानी, पोटीन-सीलबंद साइड से सिक्त हो गया। कैप ट्यूब और लेबल ये तीन केशिका ट्यूब प्रत्येक नियंत्रण स्थिति की प्रतिकृति के लिए हैं।
- जब सभी 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब उनके नामित केशिका ट्यूबों से भरे हुए हैं, तो ट्यूबों को एक होल्डिंग रैक में रखें। रैक रखें जैसे कि ट्यूबों को क्षैतिज रूप से (गैस बुलबुले को पकड़ने के लिए) लगाया जाएगा ( चित्र 2 देखें)। 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेंटीफ्यूज ट्यूबों (कोमल पेपर clumps) युक्त केशिका ट्यूबों सेते हैं।
चित्रा 2: उदाहरण पीएच ढाल, केशिका ट्यूब ऊष्मायन के लिए तैयार हैं। एक बार तीन केशिका ट्यूब भरे हुए हैं और सील कर दिए गए हैं, वे नीचे एक नमक पेपर तौलिया के साथ एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखा गया है। इस ट्यूब को तो कैप्चर किया जाता है और रैक में डाल दिया जाता है। रैक ऊष्मायन के दौरान बग़ल में उन्मुख होना चाहिए, जैसा कि यहां चित्रित किया गया है, ताकि ऊष्मायन पूरा होने पर गैस का उत्पादन देखा जा सके। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
4. ऊष्मायन के बाद नियंत्रण केशिका ट्यूबों की इमेजिंग
- इनक्यूबेटर से अपकेंद्रित्र ट्यूबों के रैक निकालें, सुनिश्चित करें कि ट्यूब क्षैतिज रखने के लिए। केशिका ट्यूबों को अपकेंद्रित्र ट्यूबों से सावधानी से स्लाइड करें, प्रत्येक सेट के दूसरे सेट से अलग करें।
- एक लाइटबॉक्स पर एक दूसरे के बगल में केशिका ट्यूबों को व्यवस्थित करें, सभी ऊपर खड़े होते हैं ताकि ट्यूबों की सामग्री दिखाई दे।ible और प्रबुद्ध। एक अंतराल छोड़ दो हर तीन ट्यूबों विभिन्न रासायनिक परिस्थितियों को अलग करने के।
- ट्यूब गठबंधन और lightbox सीधे ऊपर से फोटोग्राफ चालू है, के साथ। (चित्रा 3 देखें)
चित्र 3: उदाहरण पीएच ढाल, नियंत्रण भागो, पूर्व ऊष्मायन, कोई थूक जोड़ा गया। के बाद कृत्रिम थूक मध्यम तीन के सेट में केशिका ट्यूब में जोड़ा जा रहा, पीएच में वृद्धि हो रही बाएं से दाएं। अधिक पीला दिखाई दे रहा और अधिक अम्लीय ट्यूब में मध्यम परिणाम को जोड़ा गया संकेतक के संयोजन है, जबकि कम अम्लीय ट्यूबों अधिक बैंगनी हो जाते हैं। ट्यूब क्षैतिज व्यवस्थित कर रहे हैं और नीचे से प्रबुद्ध कर रहे हैं ऊपर से तस्वीरें खींची। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- के निपटानबायोहेज़र्डस कचरे में नियंत्रण सामग्री
5. स्पूटम नमूने के साथ WinCF केशिका ट्यूबों को आवंटित करना
- बाँझ बायोथिएड में, 225 μL मीडिया के साथ आठ बाँझ माइक्रोसॉसिटर्यूज ट्यूबें भरें।
- 3 एमएल सिरिंज (सुई के बिना एक प्लास्टिक सिरिंज) के साथ बार-बार थूक से बाहर निकलने और बाहर निकलने से थूक नमूना बनें। जब तक स्टेम चिकनी निरंतरता का हो, तब तक ऐसा न करें।
- चरण 5.1 में तैयार किए गए प्रत्येक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब (एएसएम मीडिया में 1/10 कमजोर पड़ने) के लिए 25 μL होमोडेनाइड स्पूटम जोड़ें। फिर 30 एस के लिए ट्यूबों भंवर पर्याप्त मिश्रण करने के लिए।
- माध्यम 3.2 से 3.5 के चरणों के रूप में उसी प्रक्रिया के बाद केशिका ट्यूबों में जोड़ें।
ऊष्मायन के बाद नमूना केशिका ट्यूबों की इमेजिंग
- 48-एच ऊष्मायन समय के बाद, चरण 4.1 से 4.3 के रूप में उसी प्रक्रिया के बाद केशिका ट्यूबों को निकालें और चित्र दें।
- यदि बुलबुले ट्यूबों में मौजूद हैं, तो बनाओयकीन है कि तस्वीरों को स्पष्ट रूप से ट्यूबों में बुलबुले और मीडिया के बीच चित्रण दर्शाती है। यदि बायोफिल्म मौजूद है, तो सुनिश्चित करें कि तस्वीरें स्पष्ट रूप से इसकी उपस्थिति को स्पष्ट रूप से दर्शाती हैं।
7. डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशन के लिए मीडिया का हटाया जाना
- डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की सुविधा के लिए, इमेजिंग के बाद केशिका ट्यूबों से मीडिया को निकाल दें। संभावित अनुप्रयोगों में संवर्धन और डीएनए / आरएनए अनुक्रमण और मेटाबोलामिक प्रोफाइलिंग शामिल हैं।
सावधानी: रोगजनकों से भरा कांच केशिका ट्यूब एक महत्वपूर्ण बायोहाजर्ड हैं, इस प्रकार, इन उपायों को विशिष्ट उपकरणों से बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए। यदि केशिका ट्यूबों को तोड़ते हैं, तो सही बायोहार्जर्ड कंवर्टेर में निपटाना - मीडिया को हटाने के लिए 25 गेज और 0.5 इंच की लम्बी सुइयों का इस्तेमाल करें। सील को तोड़ने के लिए ट्यूब के प्लग किए गए अंत में खुली हुई सुई डालें।
- सील को तोड़ने के बाद, केशिका ट्यूब को उल्टा कर दें और मीडिया शीर्ष भाग से बाहर निकल जाएंगे। मैंच मीडिया आसानी से बाहर ड्रिप नहीं है, एक 200 μL टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग और पिपेट सवार पर नीचे दबाने जब केशिका ट्यूब के अंत में डाला द्वारा ट्यूब के बाहर मीडिया को निष्कासित। एक उपयुक्त कंटेनर (1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब) में निष्कासित कर दिया ट्यूब मीडिया इकट्ठा।
नोट: transcriptomic या अन्य आरएनए विश्लेषण के लिए, मीडिया सीधे शाही सेना को स्थिर बफ़र्स में निष्कासित कर दिया जा सकता है।
8. WinCF FLUD सिस्टम
नोट: WinCF द्रव लोड हो रहा है उपयोगिता डिवाइस (FLUD) सिस्टम पूरक WinCF प्रणाली के प्रवाह का अनुकूलन करने के लिए डिज़ाइन उपकरणों की एक वैकल्पिक सूट है। WinCF FLUD प्रणाली मुख्य रूप से 3 डी प्रिंट करने योग्य सामग्री के शामिल है। 3 डी मुद्रित निर्माण सामग्री के त्वरित और आसान प्रतिस्थापन शोधकर्ताओं के लिए कम से कम डाउनटाइम के साथ ही कम से कम निर्माण की आवश्यकताओं को सुनिश्चित करने के लिए अनुमति देता है। डिजाइन, एसटीएल फ़ाइलें, 3 डी मुद्रण निर्देश और WinCF FLUD पुस्तिका ऑनलाइन suppleme में उपलब्ध हैंNT।
- केशिका ट्यूब लोडिंग के लिए मीडिया की तैयारी
- बाँझ बायोथिएड में, आठ बाँझ 2 एमएल माइक्रोसॉसिटर्यूज ट्यूबों को 900 μL मध्यम प्रत्येक के साथ भरें।
- 3 एमएल सिरिंज (सुई के बिना एक प्लास्टिक सिरिंज) के साथ बार-बार थूक से बाहर निकलने और निकालने के द्वारा किसी भी थूक नमूने को होमोजीज करें। जब तक स्टेम चिकनी निरंतरता का हो, तब तक ऐसा न करें।
- चरण 8.1.1 में तैयार किए गए प्रत्येक माइक्रोसॉसिटिव्यू ट्यूब (1/10 कमजोर पड़ने वाले माध्यम) में 100 μL होमोनाइज्ड स्पूटम जोड़ें। फिर 30 एस के लिए ट्यूबों भंवर पर्याप्त मिश्रण करने के लिए।
- रोटेटर ट्यूब धारक में भरे हुए और खुले माइक्रोसेंटप्रूफ्यूज ट्यूबों को स्लॉट करें ताकि टिब्ब खड़ी हों।
- केशिका ट्यूबों का प्लेसमेंट
- चरण माइक्रोसॉफ्ट में प्रत्येक माइक्रोसॉसिटर्यूज ट्यूब के लिए तीन केशिका ट्यूब पुनर्प्राप्त करें।
- रबड़ के पालने में तीन ट्यूबों को स्लॉट दें ताकि वे तंत्र के दूसरे छोर पर माइक्रोसेंटप्रूफ्यूज ट्यूबों के साथ गठबंधन कर सकें।सुनिश्चित करें कि ट्यूबों का चिन्हित छोर माइक्रोसेंटप्रूफ्यूज ट्यूबों से दूर है। क्रैड स्टैंड पर तीन स्टडों पर ठीक से पालना के नीचे तीन छेद फ़िट करें।
- तंत्र पर अपने गाइड चैनलों में रखे हुए केशिका ट्यूबों के साथ, स्थानांतरण के लिए सुरक्षित रूप से अपने midsections पर रबर ढोना रखें। ( चित्रा 4 देखें)
चित्रा 4: फ्लड प्रणाली पूरी तरह से उनके मधुमेह ओवर रबड़ तम्प द्वारा सुरक्षित केशिका ट्यूबों के साथ भरी हुई इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- केशिका ट्यूबों में मीडिया को लोड करना
- उपकरण के अंत समझने के लिए सावधानी से एक हाथ का उपयोग करें जहां केशिका ट्यूब हैंaded, और रोटेटर रैक जिसमें microcentrifuge ट्यूब लोड किए गए हैं पकड़ करने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें।
- नाजुक microcentrifuge रैक बारी बारी से इतना है कि microcentrifuge ट्यूब लगभग क्षैतिज कर रहे हैं और धीरे-धीरे केशिका ट्यूब की ओर रैक पुश करने के लिए आगे बढ़ें। (चित्रा 5 देखें)
- केशिका ट्यूब के सिरों microcentrifuge ट्यूबों में मीडिया के साथ संपर्क कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करें कि केशिका क्रिया तुरंत केशिका ट्यूब भरने शुरू होता है। भरण दर समायोजित करने और स्तर भरने के लिए, धीरे एक पूरे के रूप तंत्र बारी बारी से। इस करते समय सावधान microcentrifuge ट्यूब से बाहर मीडिया गिर करने के लिए नहीं किया जा। (चित्रा 6 देखें)
- केशिका ट्यूब वांछित स्तर तक भर रहे हैं, एक सतह पर तंत्र स्तर जगह है और ध्यान से अभी तक जल्दी से केशिका ट्यूब भरने संघर्ष करने के सिरों बंद microcentrifuge ट्यूब की रैक खींच। microcentrifuge ट्यूब अब ऊर्ध्वाधर स्थिति में वापस सभी तरह मुकर जा सकता है और बंद कर दिया।
- प्रत्येक तीन प्रतियों सेट पर एक सीलेंट ब्लॉक दबाने, एक समय में एक सेट सील जब तक सभी सेट सील कर रहे हैं द्वारा केशिका ट्यूब का फैला हुआ समाप्त होता है सील। , संदूषण का जोखिम कम करने के लिए प्रत्येक तीन प्रतियों सेट पर सीलेंट ब्लॉक का एक अलग हिस्सा प्रेस (चित्रा 7 देखें)।
चित्र 5: FLUD सिस्टम मध्यम ट्यूब एक क्षैतिज अभिविन्यास के लिए तैनात किया, तैयार साथ केशिका ट्यूब के साथ संपर्क बनाने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 6: के साथ केशिका ट्यूब केशिका क्रिया के माध्यम से मीडिया के साथ लोड हो रहा है FLUD प्रणाली। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: FLUD सिस्टम पर सीलिंग केशिलरी ट्यूबों को सीलेंट ब्लॉक का इस्तेमाल करते हुए एक समय में तीन बार सेट करें। इस सीलेंट ब्लॉक में किनारों के साथ प्लास्टिक था, जो सीलिंग के दौरान पड़ोसी तीनों सेट के साथ संपर्क को रोकने के लिए कट गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
- ऊष्मायन
- ट्यूब midsections पर रबर नलिका निकालें और मुख्य उपकरण बंद रबड़ पालना उठा। इसे इसके साथ सभी केशिका ट्यूब लेना चाहिए। अब इग्निजिंग रैक पर पालना और ट्यूबों को रखा गया है। यह आरएसीके में तीन स्टेब होते हैं जो पालना में फिट होते हैं, साथ ही छोटे गाइड चैनल भी ट्यूबों को सेट करते हैं।
- स्पष्ट प्लास्टिक के ऊष्मायन बॉक्स में एक इमेजिंग रैक पूरी तरह से सेट करें ऊष्मायन के दौरान नमी प्रदान करने के लिए बाँझ पानी में बाँझ कागज़ के तौलिये की थोड़ी मात्रा में सूखना और बॉक्स के दो छोटे किनारों पर जगह लेना। ( चित्रा 8 देखें)
- बॉक्स को पूरी तरह से बंद करें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर सेट करें, सुनिश्चित करें कि ट्यूब क्षैतिज रखने के लिए। 48 घंटे के लिए सेते हैं
चित्रा 8: फ्लड प्रणाली से एक इमेजिंग रैक में रबड़ पालना में केशिका ट्यूब, जो नमी प्रदान करने के लिए नम पेपर तौलिये के साथ स्पष्ट ऊष्मायन बॉक्स में रखा गया है। वें का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करेंआंकड़ा है
- इमेजिंग और निष्कर्षण
- इमेजिंग रैक को ऊष्मायन बॉक्स से ट्यूबों को पकड़कर निकालें और इसे एक लाइटबॉक्स पर सेट करें, नीचे से प्रकाशित। पहले से ही इमेजिंग रैक में मौजूद ट्यूबों के साथ, तीन गुना सेट ठीक से स्थानांतरित हो जाएंगे और तुरंत छवि के लिए तैयार होंगे
- कैमरे को ट्यूबों पर फोकस करें, जैसे प्रकाश बॉक्स से दृश्य और प्रकाश के क्षेत्र में सभी दिखाई दे रहे हैं, ट्यूब रंजक में रंग के पर्याप्त अंतर और दृश्यता प्रदान करता है। सीधे ऊपर से फोटो
- ट्यूबों की सामग्री निकालने के लिए, एक समय में तीन प्रकार के ट्रिपलस के एक रबड़ पालने से केशिका ट्यूब हटा दें। धीरे से ट्यूबों को पालने से बाहर निकालें या उन्हें बाहर स्लाइड करें।
- ट्रिपलिटेट्स के प्रत्येक सेट के लिए, 7.1 से 7.3 के चरणों में विस्तृत निष्कर्षण प्रक्रिया का पालन करें।
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Representative Results
नमूनों के भीतर प्रेरित विभिन्न रासायनिक स्थितियों में सूक्ष्मजीवविज्ञानी वृद्धि कुछ मामलों में नाटकीय रूप से भिन्न होती है और दूसरों में अधिक आसानी से होती है। गतिविधि में बहुत बदलाव प्रकृति के दृश्य थे, जैसे ही ऊष्मायन अवधि समाप्त हो जाती है, जैसे ही आसानी से स्पष्ट हो। पीएच हेरफेर के उदाहरण में, पीएच स्पेक्ट्रम के नमूने बहुत भिन्न होते हैं, जैसा कि कई कारकों द्वारा दिखाया गया है जो ऊष्मायन के बाद स्पष्ट हो गए थे। जब मीडिया में कोई थूक नमूना नहीं जोड़ा गया था, 48 घंटे ऊष्मायन के बाद पीएच स्पेक्ट्रम में एकमात्र बदलाव दिखाया गया था जो कि मध्यम वाष्पीकरण ( चित्रा 9 ) से उत्पन्न मध्यम मात्रा में मामूली कमी थी। Inoculated केशिका ट्यूबों मात्रा में परिवर्तन, गैस बुलबुले की उपस्थिति, बदल रंग, और अपारदर्शी जमा ( चित्रा 10 ) की उपस्थिति प्रदर्शित।
9 चित्रा: उदाहरण पीएच ग्रेडियंट, नियंत्रण रन, पोस्ट-इन्सुबेशन, कोई स्पूटम जोड़ा गया। 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated होने के बाद चित्रा 1 में दिखाए गए एक समान केशिका ट्यूब। रंगाई बड़े पैमाने पर अपरिवर्तित बनी हुई है, पीएच में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं दर्शाता है। ऊष्मायन के दौरान ट्यूबों के खुले छोर से छोटी वाष्पीकरण के कारण मध्यम की मात्रा में कम मात्रा में रहना पड़ता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
10 चित्रा: उदाहरण पीएच ढाल परिणाम, पोस्ट ऊष्मायन, चपटा जोड़ा, गैस उत्पादन स्पष्ट सीएफ रोगी से थूक के साथ मिश्रित होने के बाद कृत्रिम थूक माध्यम युक्त केशिका ट्यूब। ट्यूबों को उसी आरोही क्रम में व्यवस्थित किया जाता हैनियंत्रण चलाने के रूप में पीएच की चित्रा 2 में दिखाए गए नियंत्रण चलाने से ध्यान देने योग्य मतभेदों में रंगाई में प्रमुख बदलाव शामिल हैं, शुरू में कम या मध्य-सीमा पीएच ट्यूब बहुत हल्के रंग के होते हुए, पीएच में बड़ी बूंदों का संकेत देते हैं। उच्चतम पीएच ट्यूबों ने रंगाई को काफी कम कर दिया, जिससे पीएच में एक छोटे बदलाव का संकेत मिलता है। बुलबुले कम और मध्य-सीमा पीएच के ट्यूबों में मौजूद होते हैं, जिससे किण्वन एनार्ब गतिविधि का संकेत मिलता है। अपारदर्शी अनुभाग सभी ट्यूबों में भी मौजूद होते हैं, जो निम्न पीएच की तुलना में अधिक मात्रा में होता है, जो विभिन्न प्रकार की सूक्ष्मजीव गतिविधि को दर्शाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
इन परिणामों से पता चलता है कि अतिरिक्त थकावट के भीतर जीवाणु और अन्य रोगाणुओं का विकास कृत्रिम माध्यम के भीतर बढ़ने और बदलने में सक्षम है। नकली सिम्युलेटेड परिस्थितियों में अंतरनिरा और आसानी से, की तुलना में biofilm उत्पादन, गैस के उत्पादन, और किसी भी जोड़ा संकेतक पर आधारित विभिन्न रंग में परिवर्तन का प्रदर्शन। पीएच प्रयोग के मामले में, सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तन गैस उत्पादन है, जो बहुत अधिक कम पीएच की नलियों में प्रचलित था, 6.0 और 6.5 आम तौर पर सबसे बुलबुले होने का एक पीएच के साथ किया गया था। अन्य अपारदर्शी सामग्री सबसे ट्यूबों, आगे माइक्रोबियल गतिविधि मीडिया में होने वाली का संकेत में मनाया गया, हालांकि उच्च pH केशिका ट्यूब कम करने के लिए जाती थी। अधिकांश ट्यूब से पहले की तुलना में अधिक पीले स्वर मान लिया था, यह दर्शाता है कि मीडिया के समग्र पीएच गिरा दिया। उच्च पीएच की मीडिया आम तौर पर अपने शुरुआती रंगाई के लिए इसी तरह बने रहे, पीएच में थोड़ा परिवर्तन का संकेत है।
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Discussion
सीएफ के साथ एक फेफड़ों के सूक्ष्मजीवविज्ञानी मेकअप जीवों की एक महान विविधता शामिल है, लेकिन फेफड़ों के भीतर की स्थिति की संभावना एक महत्वपूर्ण प्रभाव क्या पर रोगाणुओं के प्रकार के जीवित रहने और 13 पलते, 15 सकते हैं। विशिष्ट तंत्र है जिसके माध्यम से इन शर्तों को बदलने और सटीक प्रभाव वे फेफड़ों Microbiome पर आम तौर पर वर्तमान में स्पष्ट नहीं हैं। इस प्रयोगात्मक विधि में, हम एक नकली फेफड़ों bronchiole में चालाकी से रासायनिक परिस्थितियों पर आधारित सूक्ष्मजीवविज्ञानी परिवर्तन के एक विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं।
वहाँ प्रोटोकॉल के कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। थूक के नमूने के अलावा पहले बाँझ कृत्रिम थूक मध्यम रखते हुए महत्वपूर्ण है जब विचार कर पर्यावरण के Microbiome विश्लेषण किया जा रहा है। विदेशी रोगाणुओं संभवतः की स्थिति में परिवर्तन और bronchiole सिमुलेशन की सटीकता को बाधित कर सकता। रोगाणुओं भी रों में लक्ष्य रोगजनकों outcompete सकता हैPutum नमूनों का इस्तेमाल किया, बाद के ऊष्मायन में परिवर्तन के किसी भी विश्लेषण के साथ समझौता। क्षैतिज रूप से केशिका ट्यूबों को सेवन करने के लिए महत्वपूर्ण है यह महत्वपूर्ण है क्योंकि यह गैस उत्पादन के अवलोकन के लिए अनुमति देता है। क्या ट्यूब्स खड़ी से जुड़े हुए थे, गैस का उत्पादन बढ़ सकता है और मध्यम से बाहर, बिल्कुल नहीं गैस उत्पादन की उपस्थिति दे। दोनों छोरों को छूने से गैस के नुकसान के बिना अधिक गैस उत्पादन की सुविधा मिल सकती है। हालांकि, आवश्यक ऑक्सीजन ढाल बाधित होगा।
प्रोटोकॉल कई संशोधनों के लिए खुले हैं, जिसमें मीडिया के रासायनिक संरचना से इनोकेटेड नमूनों के प्रकार शामिल हैं। विशिष्ट दवाओं को आसानी से तैयारी चरणों में जोड़ा जा सकता है, और विभिन्न ऊष्मायन स्थितियों में विभिन्न सेटिंग्स अनुकरण कर सकते हैं जिसमें रोगाणुओं का निवास होगा। यह प्रयोग भी विशेष रूप से सीपी रोगजनकों युक्त थूक नमूने का उपयोग करता है, लेकिन उन विशेषताओं के बीच के रुझानों को ट्रैक करने के लिए अन्य फेफड़े के रोगों के नमूने प्रतिस्थापित किया जा सकता हैरोगजनकों।
इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि केशिका ट्यूब की सामग्री को अनिवार्य रूप से, ट्यूब से निकासी पर homogenized हैं माध्यम के स्तंभ के भीतर विभिन्न स्तरों पर माइक्रोबियल गतिविधि के बारे में अधिक डेटा जब्त है। उदाहरण के लिए, हवा के माध्यम पास संभवतः अधिक एरोबिक जीवधारी, मध्यम और नीचे अधिक अवायवीय जीवों 12 से युक्त होते हैं। रोगाणुओं के इन दो अलग-अलग सेट एक साथ मिश्रित किया जाएगा अगर ट्यूबों अनुक्रमण या प्रसंस्करण के लिए एक गोदाम में खाली कर दिया गया था। WinCF साथ भविष्य के अध्ययनों अनुभाग के लिए तरीके विकसित करना है और ट्यूब की लंबाई के माध्यम से माइक्रोबियल समुदाय कल्पना।
फेफड़ों थूक विश्लेषण करने के लिए इस दृष्टिकोण से फेफड़ों के रोगाणुओं के विकास के लिए एक और अधिक सटीक माहौल प्रदान करता है होगा एक पारंपरिक अगर प्लेट विधि, जिसमें संस्कृतियों हवा के लिए खुला एक ठोस माध्यम पर बढ़ता है। नमूने ब्रांकिओल्स से होने वालेया इसी तरह की सेटिंग्स वास्तविक फेफड़े ब्रोंकोइल के साथ साझा समानता के कारण केशिका ट्यूब व्यवस्था में उचित रूप से सुसंस्कृत हैं। यह प्रायोगिक व्यवस्था भौतिक अंतरिक्ष, थूक रसायन विज्ञान, आर्द्रता, मध्यम स्थिरता और ऑक्सीजन ग्रेडियेंट के लिए होती है जो कि वास्तव में सीएफ फेफड़े 12 , 13 में मौजूद होगी।
इस तकनीक का इस्तेमाल फेफड़े की सूक्ष्मजीवों से जुड़ी बीमारियों के लिए कई परिस्थितियों में हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है। संभवतया उपचार या परिवर्तन के प्रभावों का पालन करने के लिए सुविधाजनक विधि प्रदान करते हुए कृत्रिम थूक माध्यम के रासायनिक स्थितियों को आसानी से वांछित माइक्रोबियल नमूनों को जोड़ने से पहले हेरफेर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फेफड़े के थूक के नमूनों को जोड़ने से पहले विशिष्ट प्रकार के एंटीबायोटिक दवाओं के माध्यम से जोड़ने से पहले डेटा प्रदान होगा कि इस तरह की दवा फेफड़े ब्रोन्कोइल के माइक्रोबियल समुदाय को कैसे प्रभावित करेगी। WinCF प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक नया उपकरण हैप्रत्यक्ष नैदानिक अनुप्रयोगों के साथ फेफड़ों Microbiome। फेफड़ों Microbiome का अध्ययन कर के पारंपरिक तरीकों, सीधे अनुक्रमण बलगम के नमूने शामिल WinCF साथ समुदाय को सक्रिय रूप से बेहतर कल्पना और उसके सामूहिक चयापचय विश्लेषण करने के लिए विकसित किया जा सकता। पिछले अध्ययनों से पता चला है WinCF अच्छी तरह से एक थूक नमूना 1 में Microbiome reproduces कि, इस प्रकार, यह एक रोगजनकों, सह संस्कृतियों और जीवों को संक्रमित और नुकसान मानव फेफड़ों के समुदायों के साथ प्रयोग के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रतिनिधित्व करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों को अनुदान 1 U01 AI124316-01 के वित्तपोषण के लिए आर क्विन और एनआईएआईडी / एनआईएआईडी के वित्त पोषण के लिए वेर्टेक्स फार्मास्यूटिकल्स और सिस्टिक फाइब्रोसिस रिसर्च इनोवेशन अवॉर्ड को स्वीकार करना चाहते हैं, जो बहु-औषध प्रतिरोधी रोगजनकों के उपचार के लिए सिस्टम जीवविज्ञान दृष्टिकोण हैं। हम इस काम के इंजीनियरिंग पहलुओं के साथ सहयोग की सुविधा के लिए यूसीएसडी के अंडरग्रेजुएट मैकेनिकल इंजीनियरिंग वरिष्ठ डिजाइन पाठ्यक्रम में मैकेनिकल और एयरोस्पेस इंजीनियरिंग विभाग का भी शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15 mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
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