通过实时血液动力学监测在小鼠中通过肝脏浸润建立的不受控制的出血性休克

Summary

不可控的出血是创伤患者死亡的重要原因，可以使用鼠模型中的标准肝脏撕裂进行建模。该模型导致失血，存活的一致性，并允许测试止血剂。本文提供了执行此有价值模型的分步过程。

Abstract

不受控制的出血是创伤患者可预防死亡的重要原因。我们已经通过肝切除开发了一种不受控制的出血的鼠模型，导致持续的失血，血液动力学改变和存活。

小鼠进行肝左中叶的标准化切除。他们被允许出血而没有机械干预。根据研究者的兴趣，止血剂可以作为预处理或拯救治疗来施用。在出血期间，通过左股动脉线进行实时血流动力学监测。然后处死小鼠，量化血液损失，收集血液进行进一步分析，收集器官用于分析损伤。描述了实验设计，以允许同时测试多只动物。

肝出血作为不受控制的出血的模型存在我在文献中，主要在大鼠和猪模型中。这些模型中的一些使用血液动力学监测或量化失血，但缺乏一致性。本模型结合了在鼠模型中的失血定量，实时血液动力学监测，其提供使用转基因品系的优点和高通量机制来进一步研究不受控制的出血的病理生理机制。

Introduction

创伤是世界各地年轻人死亡和残疾的主要原因。 ¹严重受伤创伤患者死亡的主要原因是不受控制的出血。 ²出血性创伤患者的管理是双重的：手术出血的控制，血液的复苏和更换。

出血性休克的动物模型一直是创伤研究的基石，可用于评估创伤性/出血性休克的病理生理和治疗。 ^3，4动物模型的冲击可以通过两种方法实现：控制出血和不受控制的出血。 5，6通过去除固定体积的血液或通过除血实现一定血压（固定压力）进行控制性出血。当时se模型在出血性休克的机制和免疫变化的评估中是有用的，它们不适用于止血剂的测试，并且不模拟创伤后出血的临床情况。在这个程度上，我们试图开发一种不受控制的出血模型，这将允许我们在鼠模型中测试止血变化和促凝剂。肝脏是不受控制的出血的有吸引力的选择，部分原因是肝脏双重供血，而且是钝伤和穿透性创伤中最常见的腹内器官损伤之一。鉴于临床相关性很高，肝脏已被用作不受控制的出血模型，最常见于大鼠和猪模型，但最近也在灵长类动物中。 ^{7，8，9，10，11，12} 13，14

不受控制的肝出血的大鼠和猪模型虽然在复苏实践和血液动力学监测方面有价值，但是由于各种原因（例如成本，使用动物数量）和重要的是相对缺乏可用于分析的转基因品系的特异性细胞和分子信号。目前的鼠模型与现有的肝脏出血模型具有重要的相似之处，包括标准化肝脏撕裂，失血量化，血液动力学监测和进行生存分析的能力。许多现有的模型只包括这些方面的一些，而我们的模型被开发用于测量许多生理变异同时和在多个小鼠。同样，鼠模型的发展打开了复苏之外的调查之门，并在不受控制的出血中形成更大的病理生理机制，具有使用先进分子技术的成本效益高，高通量模型的潜力。

Protocol

根据匹兹堡大学（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）和美国国家卫生研究院（NIH; Bethesda，MD，美国）的动物护理指南，在特定无病原体条件下，12小时光暗循环并自由进入小鼠标准饲料和水。所有动物实验均按照匹兹堡大学动物研究和监督委员会制定的指导方针进行了批准和实施。

手术场和仪器设置

1. 在手术之前，将所有手术器械，缝合线，纱布，棉尖涂抹器，管道和管接头进行灭菌。
   1. 在高压灭菌器中灭菌手术器械，缝合线，纱布和棉尖涂抹器。用环氧乙烷灭菌管道和管道连接器。
2. 手术领域
   1. 打开水循环加热垫并设置在37°C。放手术在其顶部的cal蓝色垫，然后在手术蓝色衬垫顶部的无菌悬垂。
   2. 将所有灭菌的仪器打开到无菌悬垂物上。使用无菌手套，以避免在此步骤中破坏不育。
   3. 在不锈钢碗里装上70％乙醇，放在一边。这将用于清洁动物之间的工具。
   4. 打开微珠灭菌器，加热至150°C。这也将用于清洁动物之间的工具。如果对超过5只小鼠进行手术，请务必将仪器更换为新的无菌组。
3. 传感器设置
   1. 连接无菌传感器，PE-50管，两个23G针，以及男 - 雄路厄，以及三通旋塞。 ⁶
   2. 根据制造商的说明书校准并清零传感器。

肝脏浸润手术

1. 麻醉诱导和定位
2. 以70mg / kg的剂量腹膜内注射戊巴比妥钠。麻醉应在5-10分钟之间生效;用脚趾压缩评估麻醉深度。如果鼠标对脚趾有反应，需要额外的时间或麻醉。如果在手术中需要额外的麻醉，请补充戊巴比妥钠。不要给予大于0.05毫升的补充剂以防止过量。
3. 鼠标完全麻醉后，将鼠标仰卧在外科手术板上。用胶带将鼠标四肢固定在板上。
4. 用剃刀刮腹部和双侧腹股沟。
5. 用betadine浸泡无菌纱布，适用于腹部和双侧腹股沟手术。对于生存实验，用betadine制备腹部和腹股沟，然后用乙醇制备总共三个制备周期。
6. 插入直肠温度探头以监控整个过程中的核心温度。保持c矿温在35-37℃之间。

股动脉和静脉插管

1. 静脉导管装置：从IV袋中装入PE-10管，30 G针，以及带有乳酸林格氏溶液的三通旋塞。
2. 对于动脉导管装置：用肝素化盐水（1,000 U肝素1:10稀释液）填充PE-10管和30G针。需要肝素盐水以防止凝血。
3. 将鼠标放在解剖显微镜下。
4. 使用手术虹膜剪刀在腹股沟肌肉上进行4-5毫米纵向切口。使用Dumont镊子抓住连接到内收肌的脂肪组织，并横向拉伸以清洁暴露于股骨束。不要通过脂肪组织进行解剖，因为这将导致血管损伤。
5. 用Dumont镊子仔细地将神经从动脉和静脉解剖出来。有一个邻近神经的脂肪垫。用一个Dumont强制抓住这个d横向拉这将神经从动脉拉开，创造出​​一条解剖平面。与其他杜蒙镊子直接解剖神经和动脉之间的结缔组织。
   1. 在这部分解剖过程中不要抓住神经。
6. 循环三根6-0丝线缝合在动脉和静脉附近，股骨近端起飞。
   1. 将缝合线1放置在近端并放松。
   2. 将缝合线2放置在最远处，立即绑扎。
   3. 将缝合线3缝合在缝合线1和2之间，并松开。
7. 在血管的腹侧表面进行动脉切开术。建议使用微血管剪刀进行动脉切开术以避免血管切断。
8. 将三通导管插入动脉。紧接着缝合线1和2将导管固定到位。
9. 将三通导管连接到换能器并收集基线血压数据。
10. 在对面的腹股沟上重复步骤2.2.4 - 2.2.6。以与动脉相似的方式插入股静脉。在血管的腹侧表面进行静脉切开术，然后插入导管。该导管可用于流体或药物给药。

肝脏浸润

1. 预先称重含有0.5mL PBS，三个吸收三角形和每只小鼠一个称重船的管。
2. 做一个腹侧中线剖腹手术切口从剑突进程开始，尾部延伸，以使肝脏完全暴露。
3. 在腹部插入一个吸收三角形对右侧腹壁。在左侧重复。
   1. 确保吸收三角形离开肝脏，以避免肝脏被撕裂后的包装止血作用。
4. 小心抓住肝左中叶，用外科虹膜剪刀撕裂75％的瓣。放上撕裂d段在含有PBS的管中。
5. 用缝钉装置用缝合钉封闭腹壁。一起抓住皮肤和肌肉，然后点燃手指。在肝脏撕裂后尽快做到这一点，以避免腹部外失血。在生存实验中，腹部两层闭合。用于肌肉的可运行的可吸收缝线，随后为肌肤提供不可吸收缝合线的运行层，提供足够的闭合。
6. 对于长于30分钟的存活时间点的小鼠，应将股动脉导管取出，将动脉和静脉用缝合线3从步骤2.2.6中取出。然后如上一步骤所述，双侧腹股沟以两层封闭。
7. 按照规定的出血时间（30分钟至72小时），取出订书钉。取出吸收三角形并放入相应的称重称重船。使用额外的吸收三角形来吸收任何未吸收的血液。

术后护理

1. 将待处死的小鼠在手术板上30分钟，并在不断监测下，完全麻醉下直至处死。小心安乐死与心脏穿刺和吸入异氟烷过量组合。
2. 将处于更长生存时间点的小鼠放置在水循环加热垫顶部的回收笼中。在恢复期间不断监测小鼠，不要离开无人看管，直到他们重新获得维持胸骨躺卧的意识。一旦它从麻醉中恢复，只需将鼠标移到笼子空间。
3. 通过皮下注射，每次12小时后，直到呕吐，麻醉后，用0.1mg / kg丁苯替尼治疗术后镇痛。
4. 允许老鼠在返回家中后，自由获取食物和水术后正常笼。
5. 在牺牲生存小鼠时，用吸入的异氟烷进行麻醉。一旦在麻醉下，通过右心脏心脏穿刺收集血液，如上所述记录失血量，最后用过量的异氟烷保证安乐死。

Representative Results

肝脏撕裂模型导致小鼠可重复且一致的失血。 图1A示出了可以获得的撕裂肝脏的一致重量，其标准偏差仅为0.02g。撕裂肝脏重量的这种一致性允许在小鼠之间和不同的实验装置中再现模型的能力，例如不同的复苏方案。同样，撕裂肝脏的可重复重量的标准误差仅为0.01g，为动物模型中难以获得的不受控制的出血提供更标准的模型。

验证模型中不同治疗方案的出血效果如图1B所示 。小鼠用肝素预处理（66单位，作为失血的阳性对照）或抗纤维蛋白溶解性，氨甲环酸（TXA）（作为阴性对照），以及先前在鼠尾静脉出血测定中测试的经过验证的止血性纳米颗粒。这些结果证明了该模型用于评估出血设置中止血或抗凝血作用的能力。

不受控制的出血通常伴有监测重要的血液动力学紊乱。在图2中 ，肝切除后各个小鼠的平均动脉血压（MAP）表明，在切开后MAP中的陡峭和可重复的下降导致出血性休克状态。这是重要的，因为它允许不同的复苏或介入措施的血液动力学效应，并允许重要的洞察围绕各种实验条件的生理学。虽然肝脏撕裂后有显着的血液动力学效应，我们发现t该模型可用于评估存活效应，因为该模型已经被评估到72小时，在该时间点存活56％（ 图3 ）。

图1：肝脏浸润验证。 （ A ）横断肝的代表性重量。平均肝脏重量为0.26g，标准偏差为0.02g，平均值为0.01g。这些结果证明了通过我们的75％裂纹的视觉估计可以获得的一致性。 （ B ）用肝素，氨甲环酸和先前验证的止血纳米颗粒预处理后，以克为单位的血液损失平均失血量分别为1.6,0.60和0.65g。这些结果验证了该模型的用途来测试药物的止血或抗凝血作用。

图2：肝脏浸润后平均动脉血压。单个小鼠的图形追踪表示超过20分钟的动脉血迹，其经历了假手术或肝脏撕裂。 肝脏撕裂之后是在假手术小鼠中不存在的小鼠的平均动脉血压（MAP）的特征性和急剧下降。

图3：肝脏浸润后的Kaplan-Meier存活曲线。发现没有任何治疗肝脏撕裂的小鼠的72小时存活率为56％。

Discussion

这里描述的鼠肝切除模型提供了可靠，一致的不受控制的出血模型。这种模式是直接执行的，但是需要仔细考虑的重要步骤。模型中技术上最具挑战性的部分是用于血液动力学监测和流体/药物施用的股骨血管插管。在切除神经和动脉切开术/静脉切开术时必须小心。重要的是在解剖血管期间不要接触神经，以避免造成神经损伤和可能的麻痹，特别是对于生存模型。动脉切开术和静脉切开术需要精细处理血管。我们建议使用微血管剪刀来防止血管意外断断续续。

虽然肝脏撕裂在技术上较困难，但在模型部分中保持一致是重要的，以确保可重复性和一致的出血鼠标。我们的模型旨在在复苏中测试止血剂，因此重要的放置考虑包括确保吸收三角形远离撕裂部位，以避免包装或机械止血作用。避免不必要地操纵其他器官和其他肝叶，以防止在手术过程中无意识的损伤或出血。撕裂后腹部应迅速闭合，以避免腹部外失血。

在整个手术过程中，应仔细监测小鼠，但最重要的是， 如图2所示，给予其经历的显着血液动力学变化。我们对这些显着的血液动力学变化的经验是，如果MAP降低到10mmHg以下> 30秒，则鼠标不太可能存活，我们建议牺牲小鼠URS。如果要测试流体或药物的止血效果，我们建议在撕裂后立即进行治疗，因为小鼠会迅速凝固撕裂区域。如果有兴趣执行比这里描述的更长的观察时间点，则使用疼痛管理至关重要。此外，在股骨血管结扎后，应监测后肢的缺血迹象。由于这些外科手术的丰富经验，本实验室的并发症发生率低于所有测试动物的1％。 ^4，6

该模型具有许多重要的局限性，包括不受控制的出血的方面。虽然我们看到小鼠血液一致的出血，但是一些小鼠的反应不同，并且在撕裂后会迅速死亡。模型的另一个限制是肝脏撕裂的大小。虽然我们的数据显示了狭窄的标准错误r在切除肝脏的重量中，当由不同个体进行时，切除尺寸的变异性更大，因此出血肯定存在。此外，微血管解剖和插管的学习曲线在技术上可能具有挑战性，我们根据我们的经验估计了50只动物的学习曲线，估计了10只小鼠的学习曲线，描述了肝脏撕裂的再现性。从我们的经验可以预期在72小时56％的存活率。在执行生存分析模型时，密切关注麻醉恢复和适当的疼痛管理至关重要。在我们目前的模型中，我们没有对老鼠进行任何辅助液体或药物复苏，超过了他们在肝切除之前所获得的。重要的是要注意，在模型的生存部分应密切监测动物的窘迫迹象，并适当地治疗疼痛。戊巴比妥是我们的麻醉药对于我们感兴趣的时间点，您可以选择其他选择，但麻醉的其他选择也是可能的，可能会影响结果。疼痛控制对于监测是很重要的，以便小鼠能够自由饮食，如果不能控制，可导致出血和感兴趣的治疗之外的变异性。该模型还适用于其他模型，例如软组织损伤，假骨折或多发性骨折模型。同样，该模型可以容易地适应于研究局部止血剂与静脉注射相比的作用。该模型的多种替代修改是可能的，但仍然未经测试。虽然该模型中的动物与年龄和体重相匹配，但是可以使用不同重量的动物，并且基于体重选择肝脏撕裂的大小。对于可能根据兴趣终点可能不想伤害肝脏的研究者，脾切除术可能预期类似的结果。类似的不控制引导出血模型已经用于其他动物7,8,9,10,11,12，为本模型提供了潜在的替代修改。最后，可以增加撕裂的大小以最大限度地减少血液损失，但是我们已经发现，这大大增加了死亡率，并且扩展模型对主要肝静脉的损伤具有较高的变异程度。

肝脏已被用于以前的不受控制的模型;然而，大多数这些模型是在大鼠模型中进行的。我们在小鼠中发展不受控制的肝脏撕裂模型允许调查人员利用丰富的转基因品种。鼠模型的其他优点包括执行高通量测试，成本效益和易于处理的能力。我们的模型允许血液动力学监测，失血量化和死亡率评估，以前的研究通常只包括评估的这些方面之一。我们能够同时在多个小鼠上执行这个模型，不但允许模型中的高通量但是变化的降低。

总之，我们在这里介绍一种在鼠模型中利用标准肝切除的不受控制的出血的可重复模型。我们的模型是评估新出血或创伤止血药物的理想选择，可用于短期评估失血或进行评估生存效应。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8 mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4 x 4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30 G needle	can be purchased through any global vendor
23 G needle	can be purchased through any global vendor
10 cc syringe	can be purchased through any global vendor
50 cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1 cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3" x 8"	VWR	24008
sterilization pouch 5" x 10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7 mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1,000 7 mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4 oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2 cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1 µL; hep + 9.9 µL; NaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18 x 26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3