Summary
Elektrofysiologisk karakterisering av kardiomyocyter härledda från humana Pluripotenta stamceller (hPSC-CM) är avgörande för hjärt-sjukdomsmodellering och för bestämning av läkemedelsreaktioner. Detta protokoll tillhandahåller den nödvändiga informationen för att dissociera och plåta hPSC-CM på multi-elektrod-arrays, mäta deras fältpotential och en metod för att analysera QT- och RR-intervaller.
Abstract
Kardiomyocyter kan nu härledas med hög effektivitet från både humana embryonala och humana inducerade Pluripotenta stamceller (hPSC). HPSC-härledda kardiomyocyter (hPSC-CM) erkänns alltmer som stort värde för modellering av kardiovaskulära sjukdomar hos människor, särskilt arytmi-syndromer. De har också visat relevans som in vitro- system för att förutsäga läkemedelssvar, vilket gör dem potentiellt användbara för läkemedelssökning och upptäckt, säkerhetsfarmakologi och eventuellt slutligen för personlig medicin. Detta skulle underlättas genom att härleda hPSC-CM från patienter eller mottagliga individer som hiPSCs. För alla tillämpningar är emellertid precision mätning och analys av hPSC-CM elektriska egenskaper avgörande för att identifiera förändringar på grund av hjärt-jonkanalmutationer och / eller läkemedel som riktar sig mot jonkanaler och kan orsaka plötslig hjärtdöd. Jämfört med manuell patch-clamp, multi-electrode array (MEA) enheter erbjuda fördelen avVilket möjliggör inspelningar av medium till hög genomströmning. Detta protokoll beskriver hur man dissocierar 2D-cellkulturer av hPSC-CM till små aggregat och enskilda celler och plåter dem på MEA för att registrera sin spontana elektriska aktivitet som fältpotential. Metoder för att analysera den registrerade data för att extrahera specifika parametrar, såsom QT och RR-intervallen, beskrivs också här. Förändringar i dessa parametrar skulle förväntas i hPSC-CM som bär mutationer som är ansvariga för hjärtarytmi och efter tillsats av specifika läkemedel, vilket möjliggör detektion av de som bär en kardiotoxisk risk.
Introduction
Human Pluripotent Stamceller (hPSCs) har kapacitet att självförnya och generera praktiskt taget vilken cell som helst av människokroppen genom differentiering 1 , 2 . Detaljerade protokoll om hur man riktar differentieringen av hPSC till flera hjärtklinor (ventrikulära, atriella, pacemakerliknande kardiomyocyter) har beskrivits 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Kardiomyocyter är elektriskt aktiva celler och detaljerad kunskap om deras elektrofysiologiska aktivitet kan vara mycket informativ för att förstå hjärtutveckling och sjukdom 8 . Patientspecifika hiPSC-härledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) har framgångsrikt använts för att modellera och studera cellulära, molekylära och elektriska egenskaper hos flera hjärtarytmier, inklusive långt QT-syndrom(LQTS) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , Brugadas syndrom 14 och katekolaminerg polymorf ventrikulär takykardi 15 , 16 . Vidare har flera läkemedel tillsatts till sjuka hiPSC-CM för att rekapitulera terapeutisk ingrepp och för att rädda de cellulära patologiska fenotyperna 10 , 15 , 20 , 21 , 22 . Mer nyligen har screeningsplattformar baserade på WT hiPSC-CMs utvecklats som svar på behovet av humana system till de tidiga faserna av läkemedelsupptäckt 23 , 24 , 25 eftersom gnagarekardiomyocyter skiljer sig djupt från huMans i jonkanaluttryck och biofysik 26 .
För detta ändamål utvecklas och implementeras tekniker som är lämpliga för medium till hög genomströmning. Dessa inkluderar optiska inspelningar av membranpotential, Ca 2+ transienter och belastning, impedansmätningar (som en indirekt mätning av cellkontraktilitet) och mätningar av extracellulär fältpotential (FP) (för granskning se referens 24 ). Multi-electrode Arrays (MEA) -anordningar möjliggör inspelning av de elektriska vågformsignalerna (eller FP) genererade och formade av monolager eller små klyftor av kardiomyocyter. FP-konturen korrelerar med hjärtaktivitetspotentialen och i viss utsträckning med elektrokardiograminspelningarna (ECG) 27 ; De visar typiskt en initial snabb uppsteg motsvarande Na + -inflödet och membrandepolarisationen (R / Q-topp), en långsam våg / platåfas som sannolikt motsvarar Ca2 + tillströmning och en repolarisationsfas som motsvarar en dominerande K + -utflöde (T-topp). Perturbation av FP-vågformen kan korreleras med förändringar i specifika handlingspotentialfaser 28 .
Även om patch-clamp-inspelningar av åtgärdspotentialer kan vara mer informativa, speciellt för parametrar som uppstegshastighet och vilande membranpotential, är manuella mätningar inte genomförbara för experiment i medelstor och hög genomströmningsskala, medan automatiserad patchklämma först nyligen har applicerats på hPSC -CMs 29 . Eftersom långvariga inspelningar på MEA tillåter både akut och kronisk exponering för föreningar som ska studeras är det emellertid nu möjligt att använda hPSC-CM-plattformar för läkemedelsscreening, upptäckt 24 , 30 och för säkerhetsfarmakologi 31 , 32 . Detta håller löftet om framtida precision eller persoNaliserad medicin 33 .
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla nödvändig information för att dissociera och plätera hPSC-CM på MEA-chips och mäta deras FP. I detta förfarande har varje steg optimerats, vilket garanterar optimal cellöverlevnad och återhämtning efter dissociation, optimal cellfästning till MEA-plattan och standardiserad analys och kvantifiering av parametrar. I synnerhet förklaras och exemplifieras förfarandet för extracellulär FP-registrering, analys av QT- och RR-intervaller och utvärdering av läkemedelseffekter.
Protocol
1. Framställning av lösningar och reagenser
- Förbered hPSC-CM-odlingsmedium med användning av låginsulin, bovint serumalbumin, polyvinylalkohol, essentiellt lipider (LI-BPEL) -medium 34 , 35 , 36 genom att kombinera de reagenser som beskrivs i tabell 1 . Filtrera mediet genom ett 0,22 μm porfilter och förvara vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
- Förbered human rekombinant fibronektin stamlösning genom att rekonstruera 1 mg humant rekombinant fibronektin i 5 ml sterilt destillerat vatten för att nå 200 μg / ml koncentration, alikvot och lagra vid -80 ° C.
- Förbered 1% (vikt / volym) enzym tvättmedel lösning (se tabell över material ), för att hjälpa till att avlägsna resterande celler från microarraychipet genom att lösa 1 g enzym tvättmedel i 100 ml varm (~ 40-45 ° C) avjoniserat vatten. Låt lösningen svalna och förvara vid 4 ° C fEller upp till ett år.
2. Sterilisering av MEA-chips (Figur 1A)
OBS! Flera olika konfigurationer av MEA är tillgängliga, med enkla eller flera brunnsformat. Protokollet som beskrivs här använder singelkammaren MEA som innehåller 60 inspelningselektroder i ett 8 x 8 rutnät arrangemang (se tabell över material ). Elektroddiametern är 30 μm och avståndet mellan elektroderna är 200 μm. En referenselektrod är också närvarande.
- Skölj spånet noggrant med avjoniserat vatten.
- Sätt MEA-chipsen inuti ett glas-petriskål som kan autoklaveras. Vik skålen i aluminiumfolie.
- Sterilisera flisen i en laboratorie tryckkokare i 6 min. Låt disken svalna innan den öppnas.
OBS: Alternativt kan chipsen steriliseras genom nedsänkning av dem i 1 ml 80% (volym / volym) etanol vid RT i 15-30 min. - Placera flisen i en cellkulturhuvud och exponeraYta till UV-ljus under ca 30 min.
3. Beläggning av MEA-chips (Figur IB och IC)
- Placera de rena chipsen i en vanlig 10 cm Ø plast steril petriskål.
- Tillsätt 8 ml sterilt destillerat vatten till petriskålen för att bilda en fuktad kammare, vilket kommer att förhindra att den lilla volymen odlingsmedium på kakan torkas när den placeras i inkubatorn.
- Använd specialtillverkade polytetrafluoroetylen (PTFE) ringar ( Figur 1B ) för att säkerställa plätering av kardiomyocyterna i mitten av chipet, där elektrodmatrisen är belägen. (PTFE-ringarna lagras tidigare i 80% etanol.) I kåpan avlägsnas ringarna från etanolen, placera dem i en steril petriskål utan lock och låt ringarna torka i huven.
- Placera en torrring i ett MEA-chip med flamsteriliserad pincett ( Figur 1C ).
OBS! Alternativt använd 80% etanol för att tvätta pincett och låt torka iN vävnadsodlingshuven innan du använder dem. - Tina en alikvot av humant rekombinant fibronektinlager (200 | ig / ml i destillerat vatten) och späd i PBS med Ca2 + och Mg2 + för att erhålla en arbetslösning av 40 | ig / ml. Belägg elektroderna genom att tillsätta 50 μl 40 μg / ml fibronektin inne i ringen.
OBS: Beläggning med humant rekombinant fibronektin säkerställer optimal hPSC-CM-bindning. Emellertid kan andra typer av beläggningsproteiner såsom blandningar av bovint fibronektin eller extracellulär matrisprotein användas. - Stäng locket på 10 cm Ø plast petriskålen och överför försiktigt skålen med MEA-chipet in i inkubatorn. Inkubera vid 37 ° C i minst 1 h, eller vid 4 ° C / N.
- Överför skålen som innehåller MEA-chipet till cellkulturhuven. Innan du använder MEA-chipet, aspirera 50 μL fibronektin med en P200-pipett eller ett vakuumsystem i huven, utan att förskjuta PTFE-ringen. Använd plaTips för detta steg. Se till att inga fasta föremål ( t.ex. pipettspetsar) rör på insidan av skålen eftersom det kan skada elektroderna.
OBS: Detta förlänger MEA-chipsens livslängd. - Lägg försiktigt 950 μL LI-BPEL-medium (se tabell 1 och tabell över material ), se till att det är jämnt fördelat och att ringen inte flyter. Återgå skålen till inkubatorn.
4. HPSC-CMs dissociation och plating (Figur 2)
OBS: Protokollet som beskrivs här använder sig av hPSC-CM som differentierades i en monolagskultur med användning av cytokiner 34 vid ~ 18 dagar efter att ha startat differentieringen. Det har dock visat sig vara lämpligt för alla 2D- och 3D-hPSC-CM-kulturer. Vid användning av differentierade kulturer vid tidigare eller senare tidpunkter kan justering av inkubationstiden för dissociationsenzymet (se tabell över material ) vara necessary. Följande volymer är avsedda för en enda brunn i ett 12-brunnsplattformat (3,8 cm 2 ).
- Aspirera mediet från hPSC-CMs odlingsbrunn.
- Under arbetet under en vävnadskulturhuvud, tillsätt 1-2 ml / brunn av PBS utan Ca 2+ / Mg 2+ för att tvätta kulturen. Aspirera PBS.
- Tillsätt 500 μl / brunn i dissociationsenzymet. Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 1 ml LI-BPEL / brunn för att späda enzymet. Lossa försiktigt monoskiktet av hPSC-CM genom försiktigt att skrapa med en P1000 pipett. Samla cellsuspensionen i ett 15 ml rör.
- Skölj brunnen med 1 ml LI-BPEL för att samla alla resterande celler och cellklumpar.
- Lägg till ytterligare 2-3 ml LI-BPEL för att nå en slutlig volym på 5-6 ml och pipett försiktigt upp och ner 3-5x med en 5 ml pipett för att dissociera cellklumpar.
OBS: Dissociation i enskilda celler vid denna punkt är inte nödvändig, eftersom det kommer att påverka cellöverlevnad. Närvaron av små kluster kommer attSäkerställa högre cellleabilitet. - Centrifugera cellerna vid RT under 3 minuter vid 300 x g.
- Ta bort supernatanten, försök att avlägsna det mesta av överskottsvätskan utan att lossa cellpelleten.
- Resuspendera cellpelleten i 250 μL LI-BPEL (med en P1000 och pipettering extremt försiktigt).
- Distribuera ~ 50 μl cellsuspension per MEA (upp till 5 MEA kan beredas från en brunn i en 12-brunnsplatta) genom att pipettera cellssuspensionen direkt i mitten av PTFE-ringen ovanpå elektrodmatrisen.
OBS! I detta skede är cellerna svåra att räkna på grund av närvaron av cellkluster och det totala antalet celler per MEA kan väsentligen variera beroende på den använda hPSC-CM-källan. Under plätering, se till att molnet av dissocierade celler täcker elektrodområdet. - Överför försiktigt MEA till inkubatorn vid 37 ° C och låt cellerna fästa O / N
5. Ringavlägsnande och medelåterställningFräschning (figur 3)
- Vid 1 dag efter plätering, ta försiktigt bort ringen i en steril miljö med sterila pincett ( Figur 3A-3B ).
- Skölj ringen i 80% (volym / volym) etanol och förvara den i ett 50 ml rör innehållande färsk 80% (volym / volym) etanol.
- Ta försiktigt bort 500 μl medium från MEA-chipet och tillsätt 500 μL färskt LI-BPEL.
- Överför MEA till inkubatorn vid 37 ° C.
OBS: Cellerna bör börja slå 1-7 dagar efter ringavlägsnande och medellång förändring ( Figur 3C ). - Mät elektrisk aktivitet av hPSC-CM på MEA 1-7 dagar efter ringavlägsnande.
6. Kontrollera signalkvaliteten (Figur 4)
- Slå på datorn och starta programvaran som är kopplad till MEA-inställningen: TCX-Control, MC_MEA Select och MC_Rack. Ställ in temperaturen till 37 ° C i TCX-Control för att registrera mätningar vid fysiologisk temperatur.
- Ta bort skålen med MEA chip fRom inkubatorn. Öppna locket, ta ut MEA-chipet och lägg det på en vävnad för att absorbera kvarvarande vatten.
- Torka försiktigt de yttre kontakterna på plattan med en vävnad och rengör dem med en bomullspinne fuktad med 100% (volym / volym) etanol för att avlägsna eventuellt kvarvarande vatten eller skräp vilket kan orsaka signalbrus.
- Överför MEA-plattan till det uppvärmda (37 ° C) inspelningshuvudet för att upptäcka den spontana aktiviteten ( t.ex. hårdvara: se Materiel , mjukvara: MC_Rack).
- Öppna MC_Rack: Klicka på "Redigera" → "Lägg till MC_Card" för att skapa ett nytt protokoll. Använd nedrullningsmenyn "Redigera" för att lägga till olika inspelningsfunktioner och visningsfönster i protokollet.
OBS! En samplingsfrekvens på minst 10 kHz rekommenderas. Protokollet vi använder innehåller ett långsiktigt displayverktyg, med en fullständig layout av hela MEA-chipet och en Spike Sorter, som är avgörande för att fånga drogseffekten iN realtid. Spike Cutout är inställd med en "Pre Trigger" på 20 ms, en "Post Trigger" på 800 ms och en "Dead Time" på 2 ms. Protokollet kan sparas som .rck-fil och laddas om innan experimenten startas.
- Öppna MC_Rack: Klicka på "Redigera" → "Lägg till MC_Card" för att skapa ett nytt protokoll. Använd nedrullningsmenyn "Redigera" för att lägga till olika inspelningsfunktioner och visningsfönster i protokollet.
- Starta protokollet i uppspelningsläge genom att klicka på "play" -knappen.
OBS! Vid denna tidpunkt är det möjligt att ladda om protokollet som sparats under steg 6.5. I MC_Rack, ladda protokollet (.rck filtillägg) genom att klicka på "Arkiv" → "Öppna". - Om signalerna uppvisar tydliga R-trupper och T-trupper, vänta 10-15 min för att avsluta anpassningsfasen. Exempel på bra och dåliga kvalitetsspår framgår av figur 4 .
OBS! Om ingen T-topp kan detekteras i någon av elektroderna, fortsätt inte med experimentet. Vanligtvis är detta resultatet av dålig elektrisk aktivitet hos hPSC-CM eller dålig fastsättning av cellerna till elektroderna.
7. Starta exPeriment och inspelning
- Klicka på "Spela in" och sedan "spela" och skaffa data i 10 minuter under baslinjevillkor för att bestämma det stadiga tillståndet. Anteckna de elektroder som har den bästa signalen så att de lätt kan identifieras och exporteras senare för analysen.
- För bedömning av läkemedelsreaktioner, tillsätt ökande koncentrationer av läkemedel varje 10 min. Till exempel, lägg till hERG-blockeraren E4031 vid en slutlig koncentration av 1 μM. För detta avlägsna 100 μl medium och tillsätt samma volym 10 μM E4031 upplöst i mediet.
OBS! Som tidigare visats av Cavero och kollegor 31 är ett klokt val av volymen i vilken drogerna är upplösta viktigt, eftersom det djupt kan förändra läkemedelsresponsskurvan. - Upprepa steg 7.2 för alla andra läkemedelskoncentrationer av intresse.
- Klicka på "Stop" för att avsluta inspelningarna i slutet av protokollet.
8.MEA Rengöring för återanvändning
- När försökets inspelning är klart, ta försiktigt mediet bort med en P1000 pipett. Rör inte på insidan av skålen eftersom det kan skada elektroderna. Kassera enligt lokala säkerhetsregler.
- Skölj MEA-chipsen med avjoniserat vatten med en tvättflaska och upprepa tvättsteget 3-4x.
OBS! Vid denna tidpunkt är det inte nödvändigt att cellerna är helt avskilda från chipet. - Tillsätt 1 ml enzymdetergentlösning 1% (volym / volym) i varje brunn och inkubera O / N vid 4 ° C för att tillåta cellavlägsnande och cellavlägsnande.
- En dag senare sköljer MEA-chipsen noggrant med avjoniserat vatten för att avlägsna enzymlösningsmedel och resterande celler och tillsätt 1 ml avjoniserat vatten. Ren MEA-chips kan förvaras nedsänkt i avjoniserat vatten vid 4 ° C.
9. Data Export
- Öppna MC_Data Tool-programvaran kopplad till MEA-inställningen.
- Klicka på "Arkiv" → "Öppna MCD'.
- Klicka på "Verktyg" → "Konvertera MCD till ABF" .
- Välj elektroderna med de bästa inspelningssignalerna som ska exporteras för analysen. Välj katalogen där du vill spara de exporterade filerna och klicka på "Spara". Exportproceduren kan ta flera minuter beroende på antalet elektroder som exporteras och den totala storleken på inspelningsfilerna.
10. Dataanalys
- Ladda ner och installera ett elektrofysiologiska datainsamlings- och analysprogram ( t.ex. pClamp). När du är klar, starta analysprogrammet ( t.ex. Clampfit).
- RR Intervallberäkning (Figur 5).
- Placera två vertikala markörer för att definiera regionen av intresse på spåret. Välj "Händelsedetektering" → "Tröskesökning". Den horisontella markören bör korsa alla händelser som måste kvantifieras, som visas i Figur 5A .
- Klick &# 39; OK 'och sedan' Acceptera hela kategorin '. Programvaran söker sedan igenom spåret för alla lämpliga händelser. Blåmärken kommer att placeras ovanför händelserna.
- Justera känsligheten för det automatiska valet genom att ställa in parametrarna i huvuddetektering av detektionsfönstret.
- När alla händelser har identifierats automatiskt, gå till resultatfönstret (Fönster → Resultat) och kopiera kolumnen med titeln "Intervent Interval", som innehåller frekvensdata ( Figur 5B ).
- QT Intervallberäkning (Figur 6-9):
- Placera en markör precis före och en efter en enda FP vid stillastående tillstånd. Välj "Event Detection" → "Create Template" ( Figur 6 ) .
- Kontrollera att FP-filen är korrekt identifierad och klicka på "Lägg till". Mallen flyttas till bottenpanelen.
- Spara mallen som en ".atf"fil. På så sätt har ett mallspår skapats som kommer att sökas av mjukvaran under hela inspelningen ( Figur 7 ). Skapa en mall för varje tillstånd, eftersom en läkemedelseffekt kan ändra formen på FP. Om nödvändigt, filtrera spåret något för att inkludera högst 10 000 poäng inom de två markörerna.
- När mallen har sparats med '.atf' förlängning, välj 'Event Detection' → 'Mall Search' och ladda mallen.
- Justera "Template match threshold" för att korrekt identifiera alla FP i det valda intervallet.
- När alla händelser har identifierats korrekt, spara dem i en ny ".abf" -fil.
- Öppna filen med analysprogram och beräkna automatiskt "Time of Peak" för både Q / R och T-topparna ( figurerna 8, 9 ). Om spår är mycket bullriga, använd ett filter. Beräkna QT-intervallet genom att subtraheraQ / R-värdet från T-värdet i en valfri kalkylarkredaktör.
Representative Results
En dag efter dissociation och plätering kommer skiktet av hPSC-CM att vara synliga som en tät och vit film som täcker mitten av MEA-kammaren ( Figur 3A ). Efter avlägsnande av ringen ( figur 3B ) Skiktet ska förbli på plats och inspektion på ett ljusmikroskop visar MEA-elektroderna som omfattas av hPSC-CM-skiktet ( Figur 3C ). På grund av fysisk och elektrisk koppling av cellerna kommer endast en elektrod (guldelektrod) att användas för analys.
Alternativt kan de, när de arbetar med 3D-strukturer, såsom embryoidkroppar eller mikrotisser, pläteras så att de är fysiskt och elektriskt avkopplade. Visuell inspektion vid mikroskopet kunde inte bekräfta någon fysisk koppling mellan kluster och osynkroniserade R-vågor vid MEA bekräftar ingen elektrisk koppling. I denna cAse kan flera oberoende elektroder analyseras.
Typiska inspelningar av FP-spår visas i figur 4 . I synnerhet kan ett bra kvalitetsspår definieras av närvaron av en klar topp som motsvarar Na + -inflödet och membrandepolarisationen (R / Q-topp), en tydlig repolarisationsfas som motsvarar K + efflux (T-topp) och en hög Signal-brusförhållande ( figur 4A , vänster: notera y-axelskala och figur 4B ). Spår av dålig kvalitet ( Figur 4A , mitten) kan vara resultatet av att hPSC-CM inte har kopplats till MEA-plattan eller av svag hPSC-CM-elektrisk aktivitet. Vänta 1-3 dagar för bättre anslutning kan förbättra signalen; Om ingen signalförbättring är synlig rekommenderas dock inte detta MEA från experiment. Bullriga spår ( Figur 4A , höger) kan analyseras efter filtrering.
Figur 5A, 5B ). Inom det tidsintervall som definieras av de vertikala markörerna bör blåmärken som motsvarar varje topp vara närvarande. Om programmet inte identifierar en eller flera toppar, försök flytta den horisontella markören och kör analysen igen eller justera detekteringsinställningarna. På samma sätt kan en framgångsrik analys av QT-intervall identifieras genom visuell inspektion av skärmen som visar FP-detektering ( Figur 7 ). Inom det tidsintervall som definieras av de vertikala markörerna bör blåmärken som motsvarar varje FP-detektion vara närvarande. Om programmet inte identifierar en eller flera FP, försök omdefiniera FP-mallen ( Figur 6 ) eller justera detekteringsinställningarna och kör analysen igen.
Extraherade individuella FP-spår eller deras genomsnittliga ( FigurE 8) kan användas för att erhålla QT-intervallvärden med specifika inställningar som i Figur 9 . Analys av QT-RR-förhållandet är tillrådligt och är meningsfullt i sjuka och WT hPSC-linjer ( Figur 10A ) och för att utvärdera behovet och / eller effekten av QT-intervallkorrigeringar ( Figur 10B-10D ). HPSC-CMs som bär LQTS-orsakande mutationer har förlängda QT-intervall jämfört med WT-kontroller ( Figur 11A ). Behandling av hPSC-CM med en hERG-blockerare resulterar i förlängning av QT-intervallet ( Figur 11B ); Omvänt resulterar behandling med en hERG-aktivator för att förkorta QT-intervallet ( Figur 11C ). Slutligen bör behandling med läkemedel som påverkar hPSC-CMs slagfrekvens vara synlig som en förändring av RR-intervallet ( Figur 11D , RR-intervallförkortning).
/>
Figur 1: Sterilisering och beläggning av MEA-chips. ( A ) Schema som representerar steriliseringsprocessen innefattande att placera MEA-chipet i ett autoklaverbart glas Petri-skål, inplastning i aluminiumfolie, ångkokning under 6 min och exponering för UV i 30 min. ( B ) Övre (vänster panel) och sida (mittpanel) visningar av anpassad PTFE-ring; Ringen har en yttre diameter på 1,2 cm, inklusive 4 flikar som tillåter sin positionering i mitten av MEA-chipet och den inre diametern är 0,4 cm (höger panel). ( C ) Schematisk representativ förberedelse av MEA-chipet inklusive att placera chipet i en vanlig plastisk petriskål, tillsätta 8 ml avjoniserat vatten utanför MEA-kammaren, placera PTFE-ringen i mitten av kammaren och belägga elektrodmatrisen med fibronektin . Efter inkubationstid avlägsnas fibronektin och ersätts med odlingsmedium.T = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Dissociation och Plating av hPSC-CMs. Schematiskt som representerar processerna för enzymatisk dissociation av hPSC-CMs, centrifugering, resuspendering och plätering i mitten av MEA-kammaren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: MEA-chips med hPSC-CM-skikt. ( A ) De bästa vyerna av MEA-chip som innehåller ringen och skiktet av hPSC-CM. ( B ) sidovy av MEA-chip efter ringavlägsnande. ( C ) Ljusfältbild av hPSC-CM-skiktet pläterat på mikro-Elektrodmatris; 4X förstoring. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: MEA-inspelning av hPSC-CM. ( A ) Representativa spår som registrerats med MEA visar ett bra kvalitetsspår med R / Q- och T-toppar tydligt synliga med högt signal / brusförhållande (vänster), ett dåligt kvalitetsspår utan tydligt synliga R / Q- och T-toppar (mitten) Och ett bullrigt spår med R / Q och T toppar klart synligt men med lågt signal / brus förhållande (höger). ( B ) Representativa exempel på FP-spår av god kvalitet med olika morfologier som kan registreras under MEA-experiment med användning av hPSC-CM. Det skuggade området representerar QT-intervallet mätt under analysen. Eftersom FP vid MEA liknar den första derivatenE av åtgärdspotentialen 28 , har vi beräknat integritet av FP-spåret, som visas som röd prickad linje, som teoretisk demonstration av ett T-vågval nära en fullständig åtgärdspolicy-repolarisation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: RR-intervallberäkning. ( A ) Exempel på RR-intervallanalys med automatisk toppdetektering (topp) och datautvinning (botten) med hjälp av analysprogrammet (se tabell över material). Vertikala markörer identifierar tidsintervallet av intresse och den horisontella markören kryssar alla händelser som detekteras och identifieras med blåmärken. ( B ) Den förstorade kolumnen visar den extraherade data som används för att beräkna RR-intervallet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Skapande av FP-mall. Exempel på mallval med vertikala markörer placerade före och efter en enda FP. Denna mall används för automatisk identifiering av FP. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Automatiskt identifiering av FP-mall. Exempel på mallsökning under ett intervall definierat av två vertikala markörer. Alla upptäckta händelser identifieras med blåmärken och är automaticallY överlagras i insatsen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Kvantificering av FP-parametrar. Analys av de sparade händelserna, med R-toppen identifierad manuellt inom de två första markörerna och T-toppen identifierad manuellt inom de två sista markörerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Analysfönster. Parametrar som används i fönstret Statistik för att upptäcka R-topp. För detektering av T-toppen, byt markörer och (om nödvändigt) pobundenhet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: QT-RR-förhållande. ( A ) Exempel på olika förhållanden mellan QT och RR-intervall mellan WT (LQT1 corr ) och Long QT syndrom typ 1 (LQT1 R190Q ) hPSC-CM. Skuggade områden visar att samma förskjutning i RR-intervallet genererar ett större skifte i QT-intervallet för LQT1-sjuka linjen, vilket sannolikt ökar arytmivänkan. ( B ) Förhållandet mellan okorrigerade QT- och RR-intervaller mätt vid MEA i CM från 7 olika hPSC-linjer. Effekten av QT-korrigering för Bazetts ( C ) eller Fridericias ( D ) formler visas och syns som förändring i QT-RRs lutning i Terval relation. Figurer anpassade från referens 30 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Sjukdoms- eller läkemedelsinducerad QT- och RR-intervallvariationer. ( A ) Exempel på QT-intervallförlängning i hPSC-CM härledd från en patient som bär en Long-QT-syndrom (LQTS) -mutation jämfört med dess isogena WT-kontroll. ( B ) Exempel på förlängning av QT-intervallet i hPSC-CM vid farmakologiskt hERG-block. ( C ) QT-intervallet förkortas vid behandling med ökande doser av hERG-aktivator. Pil indikerar förkortningens riktning. ( D ) Exempel på läkemedelsinducerad RR-intervallförkortning. Panel (C) var anpassad från referens> 30. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Låginsulin, BSA, polyvinylalkohol, essentiella lipider (LI-BPEL) Medium | |||
| Komponent | Mängd för 100 ml | ||
| IMDM | 43 ml | ||
| F12 | 43 ml | ||
| Askorbinsyra 2-fosfat (5 mg / ml i destillerat vatten) | 1 ml | ||
| Cellkulturtillskott (direkt ersättning för L-glutamin) | 1 ml | ||
| Penicillin / streptomycin | 0,5ml | ||
| Fenolröd | 1 mg | ||
| Proteinfritt hybridommedium-II (PFHMII) | 5 ml | ||
| BSA (10% vikt / volym i IMDM) | 2,5 ml | ||
| PVA (5% vikt / volym i destillerat vatten) | 2,5 ml | ||
| Kemiskt definierat lipidkoncentrat (CDLC) | 1 ml | ||
| Insulin-Transferrin-Selen-Etanolamin (ITS-X) 100X | 0,1 ml | ||
| A-monotioglycerol (13 | il i 1 ml IMDM) | 0,3 ml | ||
| Kombinera reagenserna, filtrera med ett 0,22 μm porfilter och förvara mediet vid 4 ° C i upp till 2 veckor. | |||
Tabell 1: Li-BPEL-mediumkomposition.
Discussion
Detta protokoll visar hur man dissocierar och förbereder hPSC-CM för att mäta deras FP med hjälp av MEA. HPSC-CM visar vanligtvis spontan elektrisk aktivitet, som kan mätas som FP och kan ge meningsfull data med avseende på slagfrekvens, QT-intervallvaraktighet och arytmiska händelser.
Dissociering av 2D-hjärtdifferentierade kulturer behövs för att återskapa ett slaglager på MEA och det representerar ett kritiskt steg. Mekanisk stress genom upprepade pipetterings- och / eller aggressiva dissociationenzymbehandlingar kan leda till hög celldödlighet, misslyckande att fästa på MEA-plattan och brist på spontan elektrisk aktivitet. Detta protokoll har optimerats för monolagskulturer. Emellertid kan ett liknande tillvägagångssätt användas för tredimensionella (3D) kulturer ( t.ex. embryoidkroppar eller EBs) med mindre modifieringar, såsom insamling av EB: erna följt av PBS-tvätt och längre inkubationstid med dissocierande enzymet. ImporteraAntly, i både 2D- och 3D-differentierade kulturer kan de äldre de differentierade cellerna, den längre inkubationstiden som krävs, vara att avlägsna cellerna på grund av ökad extracellulär matrisavsättning.
Protokollet som beskrivs här för att kvantifiera FP-parametrar kan användas för att generera dosresponsskurvor för kardioaktiva läkemedel. Såsom nyligen beskrivits av Cavero et al. 31 , kan startkoncentrationen av ett läkemedel på ett djupt sätt påverka resultatet av en MEA-mätning. För att förbättra noggrannheten och tillförlitligheten av resultaten, föreslår vi följande: 1) Om det gäller irreversibla aktivatorer / blockerare, använd relativt stora volymer av medium innehållande det läkemedel som ska testas. Mer detaljerat, ta bort 10-50% av medelvolymen från MEA-chipet och tillsätt en lika stor mängd medium där läkemedlet tidigare löstes vid lämplig koncentration. I detta fall är det avgörande för beräkningen av den slutliga läkemedelskoncentrationenÄr förändringen i koncentration efter mediumavlägsnande. 2) Vid reversibla aktivatorer / blockerare, tillsätt 10 μL av varje läkemedelsdos från en 100X stamlösning.
Majoriteten av hjärtdifferentieringsprotokollen resulterar i en variabel blandad population av nodalliknande, atriumliknande och ventrikulärliknande kardiomyocyter, varvid ventrikulärtypen är den mest representerade. Detta kan utgöra en begränsning vid modellering av hjärtsjukdomar som påverkar en specifik kardiomyocyt-subtyp eller läkemedel som verkar på hjärt-subtypsspecifika jonkanaler. Även om flera studier har optimerade förhållanden för att styra mer kontrollerad specifikation under hjärtdifferentiering 3 , 5 , 37 , 38 , är deras bredare tillämpbarhet fortfarande under utredning.
Vidare varierar effektiviteten av differentiering (i olika experiment och i diFferent hPSC-linjer) kan observeras 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Kardiomyocytberika strategier baserade på ytproteinuttryck 35 , 45 (genom florescensassisterad cellsortering eller genom magnetisk pärlselektion 46 , 47 ) och metaboliskt urval 44 , 48 kan representera giltiga strategier som kan tillämpas på alla (genetiskt modifierade eller Omodifierad) hPSC-linje före plating av hPSC-CM, för att förbättra den elektriska signalen.
Även om hPSC-CMs är notoriskt omogna jämfört med humana vuxna kardiomyocyter 4 , 49 , har de visat sig vara värdefulla i rEcapitulering och identifiering av specifika sjukdomsrelaterade förändringar ( t ex i kanalopatier) 19 , 20 , 50 och läkemedelsinducerade svar ( t ex hjärt-jonkanalblockerare) 4 , 51 . Vidare är omogna celler lättare att dissociera och återhämta sig bättre än vuxna kardiomyocyter efter dissociation och plätering 44, därför kan hPSC-CM omogenhet belönas som en fördel i detta avseende. Men för att kunna rekapitulera t.ex. Sena hjärtkärlsjukdomar och trogen reproducera läkemedelsreaktioner hos vuxna kardiomyocyter, en mer mogen mekanisk, metabolisk och elektrisk hPSC-CM-stat bör erhållas. Metoder för att mogna dessa celler innefattar förlängd tid i odling 52 , mekanisk stam 53 , elektrisk stimulering 54 , tillsats av småMolekyler 55 , 3D-kultur 56 , samkultur med andra celltyper 57 och även en kombination av dessa tillvägagångssätt 58 ; Hittills har ingen av dessa metoder lett till en vuxenliknande fenotyp.
Som en del av omättningsegenskaperna visar hPSC-CMs elektrisk automatiskitet. Här anges detaljer om hur man exakt kan kvantifiera QT- och RR-intervaller. En begränsning av mätning av spontan elektrisk aktivitet är att jämförelse av QT-intervaller kan vara svårt när hPSC-CM visar olika slagfrekvenser. I detta fall kan Bazett eller Fridericia formler användas för att korrigera QT-intervallet för frekvensen. Men som tidigare rapporterats 30 rekommenderar vi starkt att utföra Major-Axis regressionsanalys genom att plotta QT-intervallet mot RR-intervall för både rå och korrigerad data, för att utesluta eventuell förspänning på grund av själva korrigeringsmetoden.
Protokollet som presenteras här tillsammans med tidigare beskrivna metoder 59 , 60 hjälper standardiseringen av förfarandena och analysen av hPSC-CM-FP, förbättrar datareproducerbarhet och möjliggör en bättre jämförelse av resultaten mellan laboratorier.
Disclosures
CLM är medgrundare och rådgivare av Pluriomics bv. En del av publikationskostnaderna omfattas av Multi Channel Systems.
Acknowledgments
Det här arbetet stöddes av följande bidrag: CVON (HUSTCARE): Nederländskt kardiovaskulärt forskningsinitiativ (Holländska Hjärtfonden, Holländska federationen för universitetsmedicinska centra, Nederländska organisationen för hälsoforskning och utveckling och Kungliga Nederländernas vetenskapsakademi). Europeiska forskningsrådet (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Vi tackar E. Giacomelli (LUMC) för hjälp med hPSC-hjärtdifferentiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| MEA2100 in vitro recording system | Multi Channel Systems | ||
| CO2 cell-culture incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Leica stereomicroscope | Leica Microsystems | MS5 | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 μL), P-200 (200 μL), P-1000 (1,000 μL)) | Gilson International | ||
| Filter tips (10 μL, 200μL, 1,000μL) | Corning | 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL) | |
| Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) | Millipore | SCGVU02RE | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL) | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Autoclavable Petri dishes | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| MEA chip | Multi Channel Systems | MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040-091 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-169 | |
| Human recombinant fibronectin | Tebu-Bio | J64560 | |
| Custom-made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings | LUMC: department of Instrument Development | ||
| Dissociation enzyme - TrypLE Select 1x | Thermo Fisher Scientific | 12563-029 | |
| Tergazyme enzyme detergent | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230-089 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for LI-BPEL medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 21056-023 | |
| F12 nutrient mixture (Ham) | Thermo Fisher Scientific | 31765-027 | |
| Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Protein-free Hybridoma Medium-II (PFHMII) | Thermo Fisher Scientific | 12040-077 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Bovogen Biologicals Australia | BSAS05 | |
| Poly(Vinyl Alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Chemically-defined Lipid Concentrate (CDLC) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100x | Thermo Fisher Scientific | 51599-056 | |
| α-Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| MC_Rack | Multi Channel Systems | 4.6.2 | Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems) |
| TCX Control | Multi Channel Systems | 1.3.4 | |
| MEA Select | Multi Channel Systems | 1.3.0 | |
| MC_Data Tool | Multi Channel Systems | 2.6.15 | Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.) |
| Clampfit | Molecular Devices | 7.0.0 | Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code. |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Birket, M. J., et al. Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 970-979 (2015).
- Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1728-1748 (2016).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7 (4), 394-410 (2015).
- Lewandowski, J., Kolanowski, T. J., Kurpisz, M. Techniques for the induction of human pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. J Tissue Eng Regen Med. , (2016).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Davies, M. P., An, R. H., Doevendans, P., Kubalak, S., Chien, K. R., Kass, R. S. Developmental changes in ionic channel activity in the embryonic murine heart. Circ Res. 78 (1), 15-25 (1996).
- Bellin, M., et al. Isogenic human pluripotent stem cell pairs reveal the role of a KCNH2 mutation in long-QT syndrome. EMBO J. 32 (24), 3161-3175 (2013).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Ma, D., et al. Modeling type 3 long QT syndrome with cardiomyocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells. Int J Cardiol. 168 (6), 5277-5286 (2013).
- Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471 (7337), 230-U120 (2011).
- Limpitikul, W. B., et al. A Precision Medicine Approach to the Rescue of Function on Malignant Calmodulinopathic Long QT Syndrome. Circ Res. , (2016).
- Liang, P., et al. Patient-Specific and Genome-Edited Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Elucidate Single-Cell Phenotype of Brugada Syndrome. J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2086-2096 (2016).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Mol Med. 4 (3), 180-191 (2012).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. J Cell Mol Med. 16 (3), 468-482 (2012).
- Bellin, M., Mummery, C. L. Inherited heart disease - what can we expect from the second decade of human iPS cell research. FEBS Lett. 590 (15), 2482-2493 (2016).
- Sallam, K., Li, Y., Sager, P. T., Houser, S. R., Wu, J. C. Finding the rhythm of sudden cardiac death: new opportunities using induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 116 (12), 1989-2004 (2015).
- Sinnecker, D., Goedel, A., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: a versatile tool for arrhythmia research. Circ Res. 112 (6), 961-968 (2013).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacol Ther. 143 (2), 246-252 (2014).
- Terrenoire, C., et al. Induced pluripotent stem cells used to reveal drug actions in a long QT syndrome family with complex genetics. J Gen Physiol. 141 (1), 61-72 (2013).
- Abi-Gerges, N., et al. Assessment of extracellular field potential and Ca2+ transient signals for early QT/pro-arrhythmia detection using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Pharmacol Toxicol Methods. 83, 1-15 (2016).
- Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
- Blinova, K., et al. Comprehensive Translational Assessment of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes for Evaluating Drug-Induced Arrhythmias. Toxicol Sci. , (2016).
- Nerbonne, J. M. Studying cardiac arrhythmias in the mouse--a reasonable model for probing mechanisms? Trends Cardiovasc Med. 14 (3), 83-93 (2004).
- Halbach, M., Egert, U., Hescheler, J., Banach, K. Estimation of action potential changes from field potential recordings in multicellular mouse cardiac myocyte cultures. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 271-284 (2003).
- Tertoolen, L. G., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. , (2017).
- Rajamohan, D., et al. Automated Electrophysiological and Pharmacological Evaluation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25 (6), 439-452 (2016).
- Sala, L., et al. A new hERG allosteric modulator rescues genetic and drug-induced long-QT syndrome phenotypes in cardiomyocytes from isogenic pairs of patient induced pluripotent stem cells. EMBO Mol Med. 8 (9), 1065-1081 (2016).
- Cavero, I., Guillon, J. M., Ballet, V., Clements, M., Gerbeau, J. F., Holzgrefe, H. Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA): Pending issues for successful validation and implementation. J Pharmacol Toxicol Methods. , (2016).
- Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come? Br J Pharmacol. , (2016).
- Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: at the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
- Dambrot, C., et al. Strategies for rapidly mapping proviral integration sites and assessing cardiogenic potential of nascent human induced pluripotent stem cell clones. Exp Cell Res. 327 (2), 297-306 (2014).
- Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8 (12), 1037-1040 (2011).
- Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nat Protoc. 3 (5), 768-776 (2008).
- Karakikes, I., et al. Small molecule-mediated directed differentiation of human embryonic stem cells toward ventricular cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (1), 18-31 (2014).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21 (4), 579-587 (2011).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107 (21), 2733-2740 (2003).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Fuerstenau-Sharp, M., et al. Generation of highly purified human cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cell-derived induced pluripotent stem cells. PLoS One. 10 (5), e0126596 (2015).
- Schwach, V., Passier, R. Generation and purification of human stem cell-derived cardiomyocytes. Differentiation. 91 (4-5), 126-138 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Veerman, C. C., Kosmidis, G., Mummery, C. L., Casini, S., Verkerk, A. O., Bellin, M. Immaturity of human stem-cell-derived cardiomyocytes in culture: fatal flaw or soluble problem? Stem Cells Dev. 24 (9), 1035-1052 (2015).
- Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
- Otsuji, T. G., Minami, I., Kurose, Y., Yamauchi, K., Tada, M., Nakatsuji, N. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Res. 4 (3), 201-213 (2010).
- Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35 (9), 2798-2808 (2014).
- Lieu, D. K., et al. Mechanism-based facilitated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Arrhythm Electrophysiol. 6 (1), 191-201 (2013).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Mannhardt, I., et al. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. , (2016).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Curr Protoc Toxicol. 68 (22), 1-22 (2016).
- Harris, K. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte (hiPSC-CM) Multielectrode Array Assay for Preclinical Cardiac Electrophysiology Safety Screening. Curr Protoc Pharmacol. 71, 1-15 (2015).
