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Developmental Biology

मल्टी-इलेक्ट्रोड एरेज़ (एमईए) का उपयोग कर मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायॉसाइट्स (एचपीएससी-सीएमएस) का इलेक्ट्रोफिजिकल विश्लेषण

Published: May 12, 2017 doi: 10.3791/55587
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Applied Stem Cell Technologies, University of Twente

Summary

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी-सीएम) से प्राप्त कार्डियोमोसाइट्स के इलेक्ट्रोफिज़ियोलॉजिकल लक्षण वर्णन हृदय रोग मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है और ड्रग प्रतिक्रियाओं के निर्धारण के लिए। यह प्रोटोकॉल अलग-अलग इलेक्ट्रोड एरे पर अलग-थलग करने और प्लेट एचपीएससी-सीएम के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है, उनकी क्षेत्र की क्षमता को मापता है, और क्यूटी और आरआर अंतराल का विश्लेषण करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है।

Abstract

कार्डिओमोओसाइट्स अब मानव भ्रूण और मानव प्रेरित- प्लिरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) से उच्च दक्षता के साथ प्राप्त किया जा सकता है। एचपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायॉसाइट्स (एचपीएससी-सीएम) को मनुष्यों में हृदय संबंधी बीमारियों के मॉडलिंग के लिए बढ़िया मूल्य माना जाता है, खासकर अतालता सिंड्रोम। उन्होंने दवा की प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने के लिए इन विट्रो प्रणालियों में भी प्रासंगिकता का प्रदर्शन किया है , जिससे उन्हें नशीली दवाओं की जांच और खोज, सुरक्षा फार्माकोलॉजी और शायद अंततः वैयक्तिकृत दवा के लिए उपयोगी साबित हो सकता है। यह एचपीएससी- सीएम को रोगियों या अतिसंवेदनशील व्यक्तियों से उच्च पीएससी के रूप में प्राप्त करने में मददगार होगा। हालांकि, सभी अनुप्रयोगों के लिए, कार्डियक आयन चैनल म्यूटेशन और / या ड्रग्स के कारण परिवर्तन की पहचान करने के लिए एचपीएससी-सीएम बिजली के गुणों का सटीक माप और विश्लेषण आवश्यक है, जो आयन चैनलों को लक्षित करता है और अचानक कार्डियक डेडिकल हो सकता है। मैन्युअल पैच-क्लैम्प के मुकाबले, मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) डिवाइसों का लाभ मिलता हैमाध्यम से उच्च-थ्रूपुट रिकॉर्डिंग की अनुमति। इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि कैसे 2 डी सेल संस्कृतियों को एचपीएससी-सीएम के छोटे समुच्चय और एकल कोशिकाओं में विभाजित किया जाए और उन्हें क्षेत्रीय क्षमता के रूप में अपनी सहज विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए विदेश मंत्रालयों पर रख दिया गया। विशिष्ट मापदंडों जैसे कि क्यूटी और आरआर अंतराल को निकालने के लिए दर्ज आंकड़ों के विश्लेषण के तरीकों को भी यहां वर्णित किया गया है। इन मापदंडों में परिवर्तन एचपीएससी-सीएम में कार्डियक अतालता के लिए जिम्मेदार उत्परिवर्तनों को ले जाने और विशिष्ट दवाओं के अतिरिक्त शामिल होने की उम्मीद की जाती है, जिससे उन लोगों की पहचान की जा सकती है जो कार्डियॉॉक्सिक जोखिम लेते हैं।

Introduction

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) में आत्मनिर्भरता और भेदभाव 1 , 2 के द्वारा मानव शरीर के लगभग किसी भी प्रकार का सेल उत्पन्न करने की क्षमता है। एचपीएससी के कई कार्डियक वंशों (निलय, अत्रिअल, पेसमेकर जैसी कार्डियोयोमोओसाइट्स) में भेदभाव को निर्देशित करने के तरीके पर विस्तृत प्रोटोकॉल 3 , 4 , 5 , 6 , 7 को वर्णित किया गया है। कार्डियोमायसाइट्स विद्युत रूप से सक्रिय कोशिकाएं हैं और उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि का विस्तृत ज्ञान हृदय विकास और बीमारी 8 को समझने के लिए बेहद जानकारीपूर्ण हो सकता है। रोगी-विशिष्ट एचपीएससी-व्युत्पन्न कार्डिय्योमायसाइट्स (एचईपीएससी-सीएम) को सफलतापूर्वक कई कार्डियक अतालता के सेलुलर, आणविक, और विद्युत विशेषताओं के मॉडल और अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है, जिनमें लंबे समय तक क्यू टी सिंड्रोम(एलक्यूटीएस) 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , ब्रुआडा सिंड्रोम 14 , और कैथोलामिनर्जिक पॉलीमोर्फ़िक वेंट्रिकुलर टैक्कार्डिया 15 , 16 । इसके अलावा, चिकित्सीय हस्तक्षेप को पुनरावृत्ति करने और 10 , 15 , 20 , 21 , 22 के सेलुलर पैथोलॉजिकल फ़िनोटीप्स को बचाव करने के लिए रोगी हायपीएस-सीएम में कई दवाओं को जोड़ा गया है। हाल ही में, डब्ल्यूटी एचएचएससी-सीएम पर आधारित स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों को विकसित किया गया है, क्योंकि मानव तंत्र की जरूरतों के जवाब में 23 , 24 , 25 को ड्रग डिस्कवरी के शुरुआती चरणों में विकसित किया गया है क्योंकि कृंतक कार्डियोयोमोसाइट्स हू से गहराई से भिन्न हैआयन चैनल अभिव्यक्ति और बायोफिज़िक्स 26 में मनुष्य

इस प्रयोजन के लिए, माध्यम से उच्च-थ्रुपुट आवेदन के लिए उपयुक्त प्रौद्योगिकियां विकसित और क्रियान्वित की जा रही हैं। इनमें झिल्ली की क्षमता, सीए 2+ ट्रांसिएंट और तनाव, प्रतिबाधा माप (सेल कॉन्ट्रैक्टेंसी के अप्रत्यक्ष माप के रूप में), और बाह्य क्षेत्र की क्षमता (एफपी) माप की ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग (समीक्षा के लिए संदर्भ 24 देखें) शामिल हैं। मल्टी-इलेक्ट्रोड एरेज़ (एमईए) डिवाइस इलेक्ट्रोलाइव तरंग संकेतों (या एफपी) की रिकॉर्डिंग की अनुमति देते हैं जो मोनोलायर्स या कार्डिओमायोसाइट्स के छोटे समूहों द्वारा उत्पन्न और आकार देते हैं। एफपी समोच्च हृदय क्रिया क्षमता और कुछ हद तक, इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) रिकॉर्डिंग के साथ जुड़े हुए 27 ; वे आमतौर पर ना-इनफ्लक्स और झिल्ली विध्रुवण (आर / क्यू चोटी) से संबंधित एक प्रारंभिक तेजी से अपस्ट्रोक दिखाते हैं, एक धीमी गति लहर / पठार चरण जो कि सीए से संबंधित है2+ बाढ़, और एक प्रमुख पुनरावृत्ति चरण के साथ एक प्रमुख K + efflux (टी शिखर) एफपी वेवफॉर्म का प्रस्तुतीकरण विशिष्ट कार्रवाई संभावित चरणों में परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है 28

हालांकि ऐक्शन पोटेंशिअल के पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग अधिक जानकारीपूर्ण हो सकते हैं, विशेष रूप से ऊष्मायन वेग के रूप में मापदंडों और झिल्ली की क्षमता को आराम करने के लिए, मैन्युअल माप मध्यम और उच्च-थ्रुपुट पैमाने पर प्रयोगों के लिए संभव नहीं हैं, जबकि स्वचालित पैच क्लैंप को हाल ही में एचपीएससी पर लागू किया गया है -सीएमएस 2 9 हालांकि, क्योंकि विदेश मंत्रालय में लम्बे समय तक रिकॉर्डिंग का अध्ययन करने के लिए यौगिकों के दोनों तीव्र और पुराना संपर्क की अनुमति है, अब दवा जांच, खोज 24 , 30 और सुरक्षा फार्माकोलॉजी 31 , 32 के लिए एचपीएससी-सीएम प्लेटफार्मों का उपयोग करना संभव है। यह भविष्य की सटीक या पर्सो का वादा करता हैनालीकृत दवा 33

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य विदेश मंत्रालय की चिप्स पर एचपीएससी-सीएम को अलग करने और चढ़ाना और एफपी को मापने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करना है। इस प्रक्रिया में, प्रत्येक चरण का अनुकूलन किया गया है, उत्कृष्ट सेल अस्तित्व सुनिश्चित करने और विस्थापन के बाद वसूली, एमईए प्लेट में इष्टतम सेल लगाव और मानकीकृत विश्लेषण और मापदंडों की मात्रा का ठहराव सुनिश्चित किया गया है। विशेष रूप से, बाह्य एफपी रिकॉर्डिंग, क्यूटी और आरआर अंतराल के विश्लेषण, और दवा प्रभावों के मूल्यांकन के लिए प्रक्रिया को समझाया और उदाहरण दिया गया है।

Protocol

1. समाधान और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. तालिका 1 में वर्णित अभिकर्मकों के संयोजन से कम इंसुलिन, गोजातीय सीरम एल्बूमन, पॉलीविनाइलायल शराब, आवश्यक लिपिड्स (एलआई-बीपीईएल) मध्यम 34 , 35 , 36 का उपयोग करके एचपीएससी-सीएम संस्कृति माध्यम तैयार करें। 0.22 सुक्ष्ममापी छिद्र फिल्टर के माध्यम से माध्यम को फिल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस तक 2 सप्ताह तक फिल्टर करें।
  2. मानव पुनः संयोजक फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक समाधान तैयार करें, जिसमें 1 मिलीग्राम की मानव पुनः संयोजक फाइब्रोनेक्टिन 5 एमएल बाँझ डिस्टिल्ड वॉटर में 200 μg / mL एकाग्रता, विभाज्य, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर तक पहुंचने के लिए।
  3. 100 मिलीलीटर गर्म (~ 40-45 डिग्री सेल्सियस) में एंजाइम डिटर्जेंट पाउडर के 1 ग्राम को भंग करके माइक्रोएरे चिप से अवशिष्ट कोशिकाओं को हटाने में सहायता के लिए 1% (डब्ल्यू / वी) एंजाइम डिटर्जेंट समाधान (सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। विआयनीकृत पानी। समाधान को शांत करने और 4 डिग्री सेल्सियस एफ पर संग्रहीत करने की अनुमति देंया एक वर्ष तक।

2. विदेश मंत्रालय की चिप्स का स्थिरीकरण (चित्रा 1 ए)

नोट: विदेश मंत्रालयों के कई अलग-अलग विन्यास उपलब्ध हैं, एकल या बहु-प्रारूपों के साथ। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक 8 x 8 ग्रिड व्यवस्था (सामग्री की तालिका देखें) में 60 रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड युक्त एकल कक्ष एमईए का उपयोग करता है। इलेक्ट्रोड व्यास 30 माइक्रोन है और इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी 200 माइक्रोन है। एक संदर्भ इलेक्ट्रोड भी मौजूद है।

  1. विआयनीकृत पानी के साथ अच्छी तरह से चिप को कुल्ला।
  2. एक ग्लास पेट्री डिश के अंदर विदेश मंत्रालय के चिप्स को रखो जो आटोक्लेव किया जा सकता है। एल्यूमीनियम पन्नी में पकवान लपेटें
  3. 6 मिनट के लिए प्रयोगशाला के प्रेशर कुकर में चिप्स को जड़ें। बर्तन खोलने से पहले शांत हो जाओ
    नोट: वैकल्पिक रूप से, चिप्स को 15-30 मिनट के लिए आरटी पर 80% (वी / वी) इथेनॉल के 1 एमएल में डुबोकर निष्फल कर दिया जा सकता है।
  4. एक सेल संस्कृति हुड में चिप्स रखें और उजागर करेंलगभग 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश की सतह

3. विदेश मंत्रालय चिप्स की कोटिंग (चित्रा 1 बी और 1 सी)

  1. एक मानक 10 सेमी Ø प्लास्टिक बाँझ पेट्री डिश के अंदर साफ चिप्स रखें।
  2. पेट्री डिश में 8 मिलीलीटर बाँझ डिस्टिल्ड वाटर को एक आर्मिडिएड चैंबर बनाने के लिए जोड़ें, जो इनक्यूबेटर में रखा जाने पर चिप के छोटे-से-छोटे संस्कृति के क्षेत्र को सूखने में रोकेगा।
  3. चिप के केंद्र में कार्डियोयोमोसाइट्स के चढ़ाना सुनिश्चित करने के लिए कस्टम-निर्मित पॉलीट्राफ्लोरोइथिलीन (पीटीएफई) के छल्ले ( चित्रा 1 बी ) का प्रयोग करें, जहां इलेक्ट्रोड सरणी स्थित है। (पीटीएफ के छल्ले को पहले 80% इथेनॉल में संग्रहीत किया जाता है।) संस्कृति हुड में, इथेनॉल के छल्ले को हटा दें, उन्हें ढक्कन के बिना बाँझ पेट्री डिश में रखें और छल्ले को हुड में सूखने दें।
  4. ज्वाला-निष्फल तपेदिक ( चित्रा 1 सी ) का उपयोग कर एक विदेश मंत्रालय के चिप के अंदर एक सूखी अंगूठी रखें।
    नोट: चिमटी को धोने और सूखने की अनुमति देने के लिए वैकल्पिक रूप से 80% इथेनॉल का उपयोग करें Iउन्हें उपयोग करने से पहले ऊतक-संस्कृति हुड।
  5. मानव पुनः संयोजक फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक (आसुत जल में 200 ग्राम / एमएल) की एक विभाज्य वस्तु और सीओ 2 + और एमजी 2 + के साथ पीबीएस में पतला 40 मिलीग्राम / एमएल के कामकाज समाधान प्राप्त करने के लिए। रिंग के अंदर 50 μL 40 μg / ml फाइब्रोनेक्टिन जोड़कर इलेक्ट्रोड को कोट करें।
    नोट: मानव पुनः संयोजक fibronectin का उपयोग कर कोटिंग इष्टतम एचपीएससी -एमएम लगाव सुनिश्चित करता है। हालांकि, बोवाइन फाइब्रोनेक्टिन या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन मिश्रण जैसे अन्य प्रकार के कोटिंग प्रोटीन का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. 10 सेमी Ø प्लास्टिक पेट्री डिश के ढक्कन को बंद करें और इनक्यूबेटर में MEA चिप युक्त डिश में सावधानीपूर्वक स्थानांतरण करें। 37 डिग्री सेल्सियस से कम से कम 1 घंटे, या 4 डिग्री CO / N पर सेते हैं।
  7. सेल-संस्कृति हुड को MEA चिप युक्त डिश में स्थानांतरण करें। MEA चिप का उपयोग करने से पहले, PTFE अंगूठी को विस्थापित किए बिना, एक P200 विंदुक के प्रयोग से 50 μL फाइब्रोनेक्टिन या हुड में एक वैक्यूम प्रणाली का शुभारंभ करें। पीएलए का उपयोग करेंइस कदम के लिए स्टिक टिप्स सुनिश्चित करें कि कोई ठोस वस्तुएं ( जैसे, विंदुक युक्तियाँ) पकवान के अंदर छूएं क्योंकि इससे इलेक्ट्रोड को नुकसान हो सकता है
    नोट: यह विदेश मंत्रालय के चिप्स के जीवन का विस्तार करेगा।
  8. धीरे-धीरे 950 μL LI-BPEL माध्यम ( तालिका 1 और सामग्रियों की सामग्री देखें ) को सुनिश्चित करें , यह सुनिश्चित करें कि यह समान रूप से वितरित किया गया है और यह अंगूठी फ्लोट नहीं करता है। पकवान को इनक्यूबेटर पर लौटें

4. एचपीएससी-सीएम विघटन और चढ़ाना (चित्रा 2)

नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल में एचपीएससी-सीएम का उपयोग होता है जो अलग-अलग तरीके से शुरू होने के बाद साइटोकिन्स 34 से 18 दिनों के बाद एक मोनोलायर संस्कृति में विभेदित थे। हालांकि, यह किसी भी 2 डी और 3 डी एचपीएससी-सीएम संस्कृति के लिए उपयुक्त साबित हुआ है। पूर्व या बाद के समय के बिंदुओं पर विभेदित संस्कृतियों का उपयोग करते समय, पृथक्करण एंजाइम (सामग्री की तालिका देखें) के ऊष्मायन समय समायोजित किया जा सकता हैcessary। निम्नलिखित खंड 12-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप (3.8 सेमी 2 ) के एक एकल कुंड के लिए होते हैं।

  1. एचपीएससी-सीएम की संस्कृति से अच्छी तरह से माध्यम का महाप्राणण करें।
  2. टिशू कल्चर हुड के तहत काम करते समय, संस्कृति को धोने के लिए सीए 2+ / एमजी 2+ के बिना 1-2 एमएल / पीबीएस की अच्छी तरह से जोड़ें। पीबीएस की तरक्की करें
  3. हदबंदी एंजाइम के 500 μL / अच्छी तरह से जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं
  4. एंजाइम को पतला करने के लिए 1 एमएल ली-बीपीईएल / अच्छी तरह से जोड़ें धीरे से पी 1000 विंदुक का उपयोग करके खरोंच करके एचपीएससी-सीएम के मोनोलायर को अलग से अलग करें 15 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए
  5. सभी शेष कोशिकाओं और सेल क्लंप को इकट्ठा करने के लिए 1 एमएल LI-BPEL के साथ अच्छी तरह कुल्ला।
  6. 5-6 एमएल के अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए एलआई-बीपीईएल के एक और 2-3 एमएल जोड़ें और धीरे-धीरे सेल क्लंप अलग करने के लिए 5 एमएल विंदुक के साथ 3-5x के ऊपर और नीचे विंदुक करें।
    नोट: इस बिंदु पर एकल कोशिकाओं में पृथक्करण आवश्यक नहीं है, क्योंकि यह सेल अस्तित्व को प्रभावित करेगा। छोटे समूहों की उपस्थितिउच्च सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करें
  7. 300 मिनट में 3 मिनट के लिए आरटी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र
  8. सतह पर तैरनेवाला निकालें, अधिकतर अधिशेष द्रव को निकालने की कोशिश कर रहा है, लेकिन बिना सेल गोली हटाना।
  9. 250 μL LI-BPEL (एक P1000 का उपयोग करके और अत्यंत धीरे pipetting) में सेल गोली resuspend
  10. इलेक्ट्रोड सरणी के शीर्ष पर, सेल निलंबन को सीधे पीटीएफई अंगूठी के केंद्र में pipetting द्वारा विदेश मंत्रालय द्वारा प्रति सेल निलंबन के ~ 50 μL वितरित (अप करने के लिए 5 MEAs एक 12 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से तैयार किया जा सकता है)।
    नोट: एचपीएससी-सीएम स्रोत के इस्तेमाल के आधार पर, इस स्तर पर कोशिकाओं के सेल क्लस्टर की उपस्थिति के कारण गिनना मुश्किल है और विदेश मंत्रालय द्वारा प्रति कोशिकाओं की कुल संख्या काफी हद तक भिन्न हो सकती है। चढ़ाना करते समय, सुनिश्चित करें कि अलग-अलग कोशिकाओं के बादल इलेक्ट्रोड के क्षेत्र को शामिल करते हैं।
  11. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर के लिए विदेश मंत्रालय को स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को ओ / एन संलग्न करने दें

5. अंगूठी हटाने और मध्यम पुन:ताज़ा (चित्रा 3)

  1. चढ़ाना के 1 दिन बाद, बाँझ चिमटी ( चित्रा 3 ए -3 बी ) का उपयोग कर एक बाँझ पर्यावरण में ध्यान से रिंग को हटा दें।
  2. 80% (v / v) इथेनॉल में अंगूठी कुल्ला करें और इसे 50 एमएल ट्यूब में ताजा 80% (वी / वी) इथेनॉल युक्त रखें।
  3. धीरे से विदेश मंत्रालय के चिप से 500 μL मध्यम निकालें और ताजे लियू-बीपीईएल के 500 μL जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर के लिए विदेश मंत्रालय को स्थानांतरण
    नोट: अंगों को हटाने और मध्यम परिवर्तन ( चित्रा -3 सी ) के बाद कोशिकाओं को 1-7 दिनों से पीटा जाना चाहिए।
  5. एचपीएससी-सीएम की अंगूठी हटाने के 1-7 दिनों के बाद विदेश मंत्रालयों पर विद्युत गतिविधि का आकलन करें।

6. संकेत गुणवत्ता की जांच करें (चित्रा 4)

  1. कंप्यूटर पर स्विच करें और एमईए से जुड़े सॉफ्टवेयर सुइट लॉन्च करें: टीसीएक्स-कंट्रोल, एमसी_एमईए चयन और एमसी_आरकैक। टीसीएक्स-कंट्रोल के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें ताकि शारीरिक तापमान पर माप दर्ज कर सकें।
  2. डिब्बे को MEA चिप एफ युक्त करेंइनक्यूबेटर रोम ढक्कन को खोलें, विदेश मंत्रालय चिप लें और अवशिष्ट पानी को अवशोषित करने के लिए इसे ऊतक पर रखें।
  3. एक ऊतक के साथ प्लेट के बाहरी संपर्कों को सावधानी से मिटाएं और उन्हें कपास झाड़ू का उपयोग करके साफ करें ताकि किसी भी अवशिष्ट पानी या मलबे को हटाने के लिए 100% (v / v) इथेनॉल सिकुड़ सकें, जिससे संकेत शोर का कारण हो सकता है।
  4. उत्तराधिकारी गतिविधि का पता लगाने के लिए गरम (37 डिग्री सेल्सियस) रिकॉर्डिंग के लिए विदेश मंत्रालय की प्लेट को हस्तांतरित करें ( जैसे हार्डवेयर : सामग्री की तालिका देखें; सॉफ़्टवेयर: एमसी_रैक)।
    1. ओपन MC_Rack: एक नया प्रोटोकॉल बनाने के लिए 'संपादित करें' → 'एएमसीकार्ड जोड़ें' पर क्लिक करें। विभिन्न रिकॉर्डर और प्रदर्शन विंडो को प्रोटोकॉल में जोड़ने के लिए ड्रॉप डाउन मेनू 'संपादित करें' का उपयोग करें।
      नोट: कम से कम 10 kHz का एक नमूना आवृत्ति अनुशंसित है। प्रोटोकॉल हम उपयोग करते हैं जिसमें एक लांगटेरम डिस्प्ले टूल है, जिसमें पूरे MEA चिप का एक पूरा लेआउट और एक स्पाइक सॉर्टर है, जो कि दवा प्रभाव को पकड़ने के लिए आवश्यक है Iवास्तविक समय स्पाइक कटआउट 20 एमएस के 'प्री ट्रिगर', 800 एमएस के 'पोस्ट ट्रिगर' और 2 एमएस के 'डेड टाइम' के साथ ट्यून किया गया है। प्रोटोकॉल को '। Rck' फ़ाइल के रूप में सहेजा जा सकता है और प्रयोग शुरू करने से पहले पुनः लोड किया जा सकता है।
  5. 'प्ले' बटन पर क्लिक करके प्ले मोड में प्रोटोकॉल प्रारंभ करें
    नोट: इस बिंदु पर चरण 6.5 के तहत सुरक्षित प्रोटोकॉल को पुनः लोड करना संभव है। MC_Rack में, 'फ़ाइल' → 'ओपन' पर क्लिक करके प्रोटोकॉल (.आरएसी फ़ाइल एक्सटेंशन) लोड करें
  6. यदि संकेत स्पष्ट रूप से स्पष्ट दिखाई देने वाले आर चोटियों और टी चोटियों, अनुकूलन चरण को समाप्त करने के लिए 10-15 मिनट की प्रतीक्षा करें। अच्छे और बुरे गुणों के उदाहरण चित्रा 4 में दिखाए गए हैं।
    नोट: यदि इलेक्ट्रोड में से किसी भी टी-पीक का पता लगाया नहीं जा सकता, तो प्रयोग के साथ आगे बढ़ें न। आमतौर पर यह एचपीएससी-सीएमएस या इलेक्ट्रोड के लिए कोशिकाओं की खराब लगाव की खराब विद्युत गतिविधि का नतीजा है।

7. पूर्व प्रारंभ करेंपेंटिंग और रिकॉर्डिंग

  1. स्थिर राज्य को निर्धारित करने के लिए 'रिकॉर्ड' और फिर 'प्ले' पर क्लिक करें, और बेसलाइन स्थितियों के तहत 10 मिनट के लिए डेटा प्राप्त करें ऐसे इलेक्ट्रोड की व्याख्या करें जिनके पास सबसे अच्छा संकेत है ताकि वे आसानी से पहचान कर सकें और बाद में विश्लेषण के लिए निर्यात कर सकें।
  2. दवा-प्रतिक्रिया आकलन के लिए, हर 10 मिनट में दवा की बढ़ती सांद्रता बढ़ाएं एक उदाहरण के रूप में, 1 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता में हेर्ग ब्लॉकर E4031 जोड़ें। इसके लिए, मध्यम के 100 μL को हटाने और मध्यम में भंग 10 माइक्रोन E4031 के समान मात्रा जोड़ें।
    नोट: जैसा कि पहले कैवरो और सहयोगियों द्वारा दिखाया गया था 31 , मात्रा का एक बुद्धिमान विकल्प जिसमें दवाओं को भंग कर दिया जाता है, वह महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह दवा की प्रतिक्रिया वक्र में गहराई से बदल सकता है।
  3. ब्याज की अन्य सभी दवा सांद्रता के लिए कदम 7.2 दोहराएं।
  4. प्रोटोकॉल के अंत में रिकॉर्डिंग समाप्त करने के लिए 'स्टॉप' पर क्लिक करें।

8।पुन: उपयोग के लिए विदेश मंत्रालय की सफाई

  1. प्रयोग रिकॉर्डिंग समाप्त हो जाने के बाद, धीरे से एक P1000 विंदुक के साथ माध्यम को हटा दें। डिश के अंदर छूने न दें क्योंकि यह इलेक्ट्रोड को नुकसान पहुंचा सकता है। स्थानीय सुरक्षा नियमों के अनुसार त्यागें।
  2. धुलाई की बोतल का उपयोग करके विआयनीकृत पानी के साथ विदेश मंत्रालय के चिप्स को कुल्ला, और धोने के चरण 3-4x को दोहराएं।
    नोट: इस बिंदु पर यह आवश्यक नहीं है कि कोशिकाओं को चिप से पूरी तरह से अलग किया गया हो।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से एंजाइम डिटर्जेंट समाधान 1% (वी / वी) में 1 एमएल जोड़ें और ओ / एन को 4 डिग्री सेल्सियस से सेल डिटेचमेंट और सेल हटाने की अनुमति दें।
  4. एक दिन बाद, एंजाइम डिटर्जेंट समाधान और अवशिष्ट कोशिकाओं को निकालने के लिए वियोजित पानी के साथ विदेश मंत्रालय के चिप्स को कुल्ला और 1 एमएल विआयनीकृत पानी जोड़ें। स्वच्छ MEA चिप्स 4 डिग्री सेल्सियस पर विआयनीकृत पानी में डुबोया जा सकता है।

9. डेटा निर्यात

  1. विदेश मंत्रालय की स्थापना के साथ जुड़े MC_Data उपकरण सॉफ्टवेयर खोलें।
  2. 'फ़ाइल' → 'ओपन एम सी क्लिक करेंडी '।
  3. 'टूल्स' → 'एमसीडी टू एबीएफ कन्वर्ट' पर क्लिक करें
  4. विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा रिकॉर्डिंग संकेतों के साथ इलेक्ट्रोड का चयन करें। निर्यात की गई फ़ाइलों को सहेजने के लिए उस निर्देशिका को चुनें और 'सहेजें' पर क्लिक करें। निर्यात प्रक्रिया निर्यात की गई इलेक्ट्रोड की संख्या और रिकॉर्डिंग फ़ाइलों का कुल आकार के आधार पर कई मिनट लग सकती है।

10. डेटा विश्लेषण

  1. एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण कार्यक्रम ( जैसे, पीक्लाम्प) को डाउनलोड और स्थापित करें। एक बार पूरा होने पर, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें ( जैसे, क्लैम्पफिट)।
  2. आर आर अंतराल गणना (चित्रा 5)।
    1. ट्रेस पर रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए दो ऊर्ध्वाधर कर्सर रखें। 'इवेंट का पता लगाने' → 'थ्रेसहोल्ड खोज' का चयन करें चित्रा 5 ए में दिखाए गए अनुसार क्षैतिज कर्सर को उन सभी घटनाओं को पार करना चाहिए जिन्हें मात्रा निर्धारित करना चाहिए।
    2. क्लिक करें &# 39; ओके 'और फिर' संपूर्ण श्रेणी स्वीकार करें ' सॉफ्टवेयर तो सभी उपयुक्त घटनाओं के लिए ट्रेस के माध्यम से खोज करेगा। नीला अंक घटनाओं के ऊपर रखा जाएगा
    3. मुख्य घटना पहचान विंडो में पैरामीटर को ट्यूनिंग करके स्वचालित चयन की संवेदनशीलता को समायोजित करें।
    4. एक बार सभी घटनाओं को स्वचालित रूप से पहचान कर लिया गया है, परिणाम विंडो (विंडो → परिणाम) पर जाएं और "इंटरवेंट अंतराल" नामक कॉलम की प्रतिलिपि करें, जिसमें आवृत्ति डेटा ( चित्रा 5 बी) होता है।
  3. क्यूटी अंतराल गणना (आंकड़े 6-9):
    1. स्थिर स्थिति की स्थिति में एक कर्सर को पहले और एक ही एफपी के बाद रखें। 'इवेंट डिटेक्शन' → 'टेम्पलेट बनाएँ' का चयन करें ( चित्रा 6 ) ।
    2. जांचें कि एफपी सही ढंग से पहचान है और 'जोड़ें' पर क्लिक करें टेम्पलेट को नीचे के पैनल पर ले जाया जाएगा
    3. टेम्पलेट को '.atf' के रूप में सहेजेंफ़ाइल। इस तरह, एक टेम्पलेट ट्रेस बनाया गया है जो पूरे रिकॉर्डिंग ( चित्रा 7 ) में सॉफ्टवेयर द्वारा खोजा जाएगा। प्रत्येक स्थिति के लिए एक टेम्पलेट बनाएं, क्योंकि एक दवा प्रभाव एफपी के आकार को बदल सकता है। यदि आवश्यक हो, तो दो कर्सर के भीतर अधिकतम 10.000 अंकों को शामिल करने के लिए ट्रेस को थोड़ा-थोड़ा फ़िल्टर करें।
    4. टेम्पलेट '.एटीएफ' एक्सटेंशन के साथ सहेजा गया है, एक बार 'इवेंट डिटेक्शन' → 'टेम्पलेट खोज' का चयन करें और टेम्पलेट को लोड करें।
    5. चयनित अंतराल में सभी एफपी को सही ढंग से पहचानने के लिए "खाका मिलान थ्रेशोल्ड" समायोजित करें
    6. एक बार सभी घटनाओं को सही ढंग से पहचाना गया है, उन्हें एक नया '.abf' फ़ाइल में सहेजें।
  4. विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ फ़ाइल खोलें और क्यू / आर और टी चोटियों ( आंकड़े 8, 9 ) दोनों के लिए स्वचालित रूप से 'पीक का समय' की गणना करें। यदि निशान बहुत शोर हैं, तो एक फिल्टर लागू करें। घटाकर क्यूटी अंतराल की गणना करेंपसंद के स्प्रेडशीट संपादक में टी मान से क्यू / आर मान

Representative Results

पृथक्करण और चढ़ाना के एक दिन बाद, एचपीएससी-सीएमएस की परत एक घने और सफेद फिल्म के रूप में दिखाई देगी जो विदेश मंत्रालय के कक्ष ( चित्रा 3 ए ) के केंद्र को कवर करती है। अंगूठी को हटाने ( चित्रा 3 बी ) के बाद,   परत एक जगह में रहनी चाहिए और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर निरीक्षण करना (अनुबंध) एचपीएससी-सीएम परत ( चित्रा -3 सी ) द्वारा कवर किए गए विदेश मंत्रालय के इलेक्ट्रोड को दिखाएगा। कोशिकाओं के शारीरिक और बिजली के युग्मन के कारण विश्लेषण के लिए केवल एक इलेक्ट्रोड (सुनहरा इलेक्ट्रोड) का उपयोग किया जाएगा।

वैकल्पिक रूप से, जब 3 डी संरचनाओं, जैसे कि भ्रूण निकायों या माइक्रोोटिज्यूज के साथ काम करना, इन्हें प्लेटेड किया जा सकता है ताकि वे शारीरिक और विद्युत रूप से गैर-अनूठे हो। सूक्ष्मदर्शी पर दृश्य निरीक्षण समूहों के बीच कोई भौतिक कनेक्शन की पुष्टि नहीं कर सकता और MEAS में नॉनसिंक्रनाइज़ आर तरंगों की पुष्टि नहीं की गई कोई भी युग्मन नहीं। इस सी मेंएएसई, कई स्वतंत्र इलेक्ट्रोड का विश्लेषण किया जा सकता है।

एफपी निशान की विशिष्ट रिकॉर्डिंग चित्रा 4 में दिखाए गए हैं। विशेष रूप से, एक अच्छी गुणवत्ता वाले ट्रेस को ना + फ्लो और झिल्ली विध्रुवण (आर / क्यू शिखर) से संबंधित एक स्पष्ट शिखर की उपस्थिति से परिभाषित किया जा सकता है, जो K + efflux (टी शिखर) से संबंधित एक स्पष्ट पुनरावृत्ति चरण और एक उच्च शोर अनुपात ( चित्रा 4 ए , बाएं: नोट वाई-अक्ष स्केल और चित्रा 4 बी ) के लिए संकेत। खराब गुणवत्ता वाले निशान ( चित्रा 4 ए , मध्य) एचपीएससी-सीएमएस की विफलता का परिणाम MEA प्लेट या कमजोर एचपीएससी-सीएम विद्युत गतिविधि को संलग्न करने के लिए हो सकता है। बेहतर लगाव के लिए 1-3 दिन प्रतीक्षा करने से संकेत सुधार हो सकता है; हालांकि, अगर कोई संकेत सुधार दिखाई नहीं दे रहा है, तो प्रयोग से इस विदेश मंत्रालय को छोड़कर सिफारिश की जाती है। फ़िल्टरिंग के बाद शोर निशान ( चित्रा 4 ए , दाएं) का विश्लेषण किया जा सकता है।

चित्रा 5 ए, 5 बी)। ऊर्ध्वाधर कर्सर द्वारा परिभाषित समय अंतराल के भीतर, प्रत्येक शिखर के अनुरूप नीले निशान मौजूद होना चाहिए। यदि कार्यक्रम एक या अधिक चोटियों की पहचान नहीं करता है, तो क्षैतिज कर्सर को स्थानांतरित करने का प्रयास करें और विश्लेषण फिर से चलाएं या पहचान सेटिंग्स को समायोजित करें। इसी तरह, क्यूटी अंतराल के सफल विश्लेषण को स्क्रीन के दृश्य निरीक्षण द्वारा एफपी पहचान ( चित्रा 7 ) दिखाया जा सकता है । ऊर्ध्वाधर कर्सर द्वारा परिभाषित समय अंतराल के भीतर, प्रत्येक एफपी पहचान से संबंधित नीले निशान मौजूद होना चाहिए। यदि कार्यक्रम एक या अधिक एफपी की पहचान नहीं करता है, तो एफपी टेम्पलेट को पुनः परिभाषित करने की कोशिश करें ( चित्रा 6 ) या पहचान सेटिंग्स को समायोजित करें और फिर से विश्लेषण चलाएं।

निकाले गए व्यक्तिगत एफपी निशान या उनके औसत ( चित्राई 8) का उपयोग चित्रा 9 में विशिष्ट सेटिंग्स के साथ क्यूटी अंतराल मान प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। क्यूटी-आरआर रिश्ते का विश्लेषण उचित है और रोगग्रस्त और डब्ल्यू टी एचपीएससी लाइनों ( चित्रा 10 ए ) में सार्थक है और क्यूटी-अंतराल सुधारों की आवश्यकता और / या प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए ( चित्रा 10 बी -10 डी )। एचपीएससी- एलक्यूटीएस के कारण होने वाले उत्परिवर्तन के सीएम के पास डब्ल्यूटी नियंत्रण ( चित्रा 11 ए ) की तुलना में क्यूटी अंतरालों का लंबा समय है। एचपीएससी के उपचार- सीआरएम में एचईआरजी अवरोधक परिणाम के साथ क्यूटी अंतराल लम्बाई ( चित्रा 11 बी ); इसके विपरीत, क्यूटी अंतराल ( चित्रा 11 सी ) को छोटा करने में एक हेरग एक्टिवेटर परिणाम के साथ उपचार। अंत में, एचपीएससी-सीएम की पिटाई आवृत्ति को प्रभावित करने वाली दवाओं के साथ उपचार आरआर अंतराल में परिवर्तन ( चित्रा 11 डी , आरआर अंतराल छोटा) के रूप में दिखाई देना चाहिए।

आकृति 1 />
चित्रा 1: एमईए चिप्स की नसबंदी और कोटिंग ( ए ) स्टरलाइज़ेशन प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करने वाली योजना जिसमें ऑटोएक्लावेबल ग्लास पेट्री डिश में विदेश मंत्रालय के चिप को रखकर, एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर, 6 मिनट के लिए गश्त किया जाता है, और यूवी को 30 मिनट के लिए उजागर किया जाता है। ( बी ) शीर्ष (बाएं पैनल) और साइड (मध्यम पैनल) कस्टम पीटीएफआई अंगूठी के विचार; अंगूठी में 1.2 सेमी का बाहरी व्यास है, जिसमें 4 फ्लैप्स शामिल हैं जो MEA चिप के केंद्र में अपनी स्थिति की अनुमति देते हैं और आंतरिक व्यास 0.4 सेमी (दाएं पैनल) है। ( सी ) एमईए चिप की तैयारी का प्रतिनिधित्व करते हुए एक मानक प्लास्टिक पेट्री डिश में चिप रखने सहित, एमईए कक्ष के बाहर डीओनेज्ड पानी के 8 एमएल को जोड़ने, चेंबर के बीच में पीटीएफआई अंगूठी रखकर और फाइब्रोनेक्टिन के साथ इलेक्ट्रोड सरणी को कोटिंग । ऊष्मायन समय के बाद, फाइब्रोनेक्टिन को हटा दिया जाता है और इसे संस्कृति माध्यम से बदल दिया जाता है।T = "_ blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: एचपीएससी-सीएम के पृथक्करण और चढ़ाना एचपीएससी-सीएम की एंजाइमिक पृथक्करण, सेंटीफ्यूगेशन, रिसासपेंशन, और विदेश मंत्रालय के केंद्र के केंद्र पर चढ़ाना की प्रक्रियाओं का आदान-प्रदान। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: एचपीएससी-सीएम लेयर के साथ विदेश मंत्रालय के चिप्स ( ए ) एमईए चिप की रिंग और एचपीएससी-सीएम की परत वाले शीर्ष दृश्य। ( बी ) अंगूठी हटाने के बाद विदेश मंत्रालय के पक्ष के पक्ष देखें ( सी ) एचपीएससी-सीएमएस परत की उज्ज्वल क्षेत्र की छवि को माइक्रो-इलेक्ट्रोड सरणी; 4X बढ़ाई इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: एचएएससी-सीएम के विदेश मंत्रालय द्वारा रिकॉर्डिंग। ( ए ) विदेश मंत्रालय द्वारा शोर अनुपात (बाएं) के उच्च संकेत के साथ स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले आर / क्यू और टी चोटियों के साथ एक अच्छी गुणवत्ता वाले ट्रेस दिखाए जाने वाले प्रतिनिधि निशान, स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले आर / क्यू और टी चोटियों (मध्य) के बिना एक खराब गुणवत्ता वाले ट्रेस, और आर / क्यू और टी चोटियों के साथ एक शोर ट्रेस स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं लेकिन शोर अनुपात (दाएं) के कम संकेत के साथ। ( बी ) एचपीसीसी-सीएमएस का उपयोग करते हुए विदेश मंत्रालय के प्रयोगों के दौरान दर्ज किए जा सकने वाले विभिन्न रूपों के साथ अच्छी गुणवत्ता वाले एफपी निशान के प्रतिनिधि उदाहरण। छायांकित क्षेत्र विश्लेषण के दौरान मापा गया क्यूटी अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है। चूंकि विदेश मंत्रालय में एफपी पहले डेरिवेटिव जैसा दिखता हैए 28 संभावित ऐक्शन की, हमने एफपी ट्रेस के अभिन्न अंग की गणना की है, जिसे लाल बिंदीदार रेखा के रूप में दिखाया गया है, जैसा कि एक टी तरंग पसंद के सैद्धांतिक प्रदर्शन को पूरी क्रिया संभावित रिप्ररराइजेशन के करीब है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: आर आर अंतराल गणना। ( ए ) विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्वत: चरम पहचान (शीर्ष) और डेटा निष्कर्षण (नीचे) के साथ आरआर अंतराल विश्लेषण का उदाहरण (सामग्री की तालिका देखें)। कार्यक्षेत्र कर्सर रुचि के समय अंतराल की पहचान करते हैं और क्षैतिज कर्सर सभी घटनाओं को पार कर रहा है जो नीले रंग के निशान से पहचाने जाते हैं और पहचाने जाते हैं। ( बी ) आवर्धित स्तंभ आरआर अंतराल की गणना करने के लिए उपयोग किए गए निकाले गए डेटा को दिखाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: एफपी टेम्पलेट का निर्माण। एक एकल एफपी के पहले और बाद में लंबवत कर्सर का उपयोग करके टेम्पलेट चयन का उदाहरण यह टेम्पलेट एफपी स्वचालित पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 7
चित्रा 7: एफपी टेम्पलेट स्वचालित पहचान दो लंबवत कर्सर द्वारा निर्धारित अंतराल के दौरान टेम्पलेट खोज का उदाहरण। सभी पहचाने गए घटनाओं को नीले निशान से पहचाना जाता है और स्वचालित रूप सेटी इनसेट में आरोपित इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

आंकड़ा 8
8 चित्रा: एफपी पैरामीटर की मात्रा सहेजे गए घटनाओं का विश्लेषण, पहले दो कर्सर के अंदर पहचाने गए आर पीक और पिछले दो कर्सर के भीतर मैन्युअल रूप से पहचाने गए टी शिखर के साथ। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

9 चित्र
9 चित्र: विश्लेषण विंडो। आर चोटी का पता लगाने के लिए सांख्यिकी विंडो में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर टी शिखर का पता लगाने के लिए, कर्सर बदलें और (यदि आवश्यक हो) पोlarity। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 10
10 चित्रा: QT- आरआर रिश्ते ( ए ) डब्ल्यूटी (एलक्यूटी 1 कोर) और लंबी क्यू टी सिंड्रोम प्रकार 1 (एलक्यूटी 1 आर 1 9 0 क्यू ) एचपीएससी -सीएम के बीच क्यूटी और आरआर अंतराल के बीच अलग- अलग रिश्तों का उदाहरण छायांकित क्षेत्रों से पता चलता है कि आरआर अंतराल में एक ही बदलाव एलक्यूटी 1 रोगग्रस्त रेखा के क्यूटी अंतराल में एक बड़ा बदलाव उत्पन्न करता है, इस प्रकार संभवतया अतालता संवेदनशीलता बढ़ जाती है। ( बी ) सात अलग-अलग एचपीएससी लाइनों से मुख्यमंत्रियों में विदेश मंत्रालय द्वारा मापा गया क्यूटी और आरआर अंतराल के बीच संबंध। बज़ेट ( सी ) या फ्रिडरिया के ( डी ) फ़ार्मुलों के लिए क्यूटी सुधार का प्रभाव दिखाया गया है और QT-RR के ढलान में परिवर्तन के रूप में दिखाई देता है तुवाल रिश्ते संदर्भ 30 से अनुकूलित आंकड़े इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 11
चित्रा 11: रोग- या ड्रग-प्रेरित क्यूटी और आरआर अंतराल भिन्नताएं ( ए ) एचपीएससी-सीएम में क्यूटी अंतराल के लंबे समय तक चलने का उदाहरण, एक लँग-क्यू टी सिंड्रोम (एलक्यूए) ( बी ) एचपीएससी-सीएम में औषधीय एचईआरजी ब्लॉक पर क्यूटी अंतराल का विस्तार। ( सी ) एचईआरजी एक्टिवेटर की बढ़ती खुराक के साथ इलाज पर क्यूटी अंतराल छोटा। तीर शॉर्टनिंग की दिशा इंगित करता है। ( डी ) दवा प्रेरित आरआर अंतराल छोटा का उदाहरण। पैनल (सी) संदर्भ से अनुकूलित किया गया था> 30 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

कम-इंसुलिन, बीएसए, पॉलीविनैलालस्क, आवश्यक लिपिड (एलआई-बीपीईएल) मध्यम
अंग 100 एमएल के लिए मात्रा
IMDM 43 एमएल
F12 43 एमएल
एस्कोर्बिक एसिड 2-फॉस्फेट (आसुत पानी में 5 मिलीग्राम / एमएल) 1 एमएल
सेल संस्कृति पूरक (एल-ग्लूटामाइन के लिए प्रत्यक्ष विकल्प) 1 एमएल
पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 0.5एमएल
फेनोल लाल 1 मिलीग्राम
प्रोटीन नि: शुल्क हाइब्रिडोमा माडियम -2 (पीएफएचएमआईआई) 5 एमएल
बीएसए (आईएमडीएम में 10% वाल्ट / वॉल्यूम) 2.5 एमएल
पीवीए (डिस्टिल्ड वॉटर में 5% वाल्ट / वॉल) 2.5 एमएल
रासायनिक परिभाषित लिपिड ध्यान केंद्रित (सीडीएलसी) 1 एमएल
इंसुलिन-ट्रांसफिरिन-सेलेनियम-एथनोलैमिने (आईटीएस-एक्स) 100 एक्स 0.1 एमएल
Α-monothioglycerol (1 एमएल आईएमडीएम में 13 μL) 0.3 एमएल
अभिकर्मकों को मिलाएं, 0.22 सुक्ष्ममापी छिद्र फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें और मध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस तक 2 सप्ताह तक स्टोर करें।

तालिका 1: ली-बीपीईएल मध्यम रचना

Discussion

यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे एचएससीसी-सीएम को विदेश मंत्रालय द्वारा अपने एफपी को मापने के लिए अलग करना और तैयार करना है। एचपीएससी-सीएम आमतौर पर सहज विद्युत गतिविधि प्रदर्शित करते हैं, जिसे एफपी के रूप में मापा जा सकता है और बार-बार पिटाई, क्यूटी अंतराल की अवधि, और अतालिक घटनाओं के संदर्भ में सार्थक डेटा प्रदान कर सकता है।

विदेश मंत्रालय पर पिटाई की परत बनाने के लिए 2 डी कार्डियक विभेदित संस्कृतियों के विघटन की आवश्यकता है और यह एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करती है। दोहराया pipetting और / या आक्रामक पृथक्करण एंजाइम उपचार से यांत्रिक तनाव उच्च सेल मृत्यु दर, विदेश मंत्रालय की प्लेट को संलग्न करने में विफलता, और सहज विद्युत गतिविधि की कमी के परिणामस्वरूप हो सकता है। यह प्रोटोकॉल मोनोलायर संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, एक समान दृष्टिकोण तीन आयामी (3 डी) संस्कृतियों ( उदाहरण के लिए, भ्रूण निकायों या ईबी) में मामूली संशोधन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि ईबीएस का संग्रह, पीबीएस धोने और लंबे समय तक ऊष्मायन समय अलग-अलग एंजाइम के साथ। आयातईमानदारी से, 2 डी और 3 डी विभेदित दोनों संस्कृतियों में, पुराने विभेदित कोशिकाओं में, लंबे समय तक ऊष्मायन समय आवश्यक कोशिकाओं को अलग करने के कारण हो सकता है क्योंकि बढ़ी हुई मैट्रिक्स बयान

एफपी मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग हृदय-क्रियाशील दवाओं के लिए खुराक-प्रतिक्रिया घटता उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। जैसा हाल ही में Cavero एट अल द्वारा वर्णित 31 , एक दवा की शुरूआत एकाग्रता विदेश मंत्रालय के माप के परिणाम पर गहराई से प्रभावित हो सकती है। इसलिए, परिणामों की सटीकता और विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए, हम निम्नलिखित सुझाव देते हैं: 1) अपरिवर्तनीय सक्रियणकर्ता / ब्लॉकर्स के मामले में, अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में मध्यम से युक्त दवा का परीक्षण किया जाना चाहिए। अधिक विस्तार से, विदेश मंत्रालय के चिप से 10-50% मध्यम मात्रा को हटा दें और एक समान मात्रा का माध्यम जोड़ें जिसमें दवा को उपयुक्त एकाग्रता में भंग किया गया था। इस मामले में, अंतिम दवा एकाग्रता की गणना के लिए, यह विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैमध्यम हटाने के बाद एकाग्रता में बदलाव। 2) प्रतिवर्ती सक्रियकर्ता / ब्लॉकर्स के मामले में, 100 एक्स स्टॉक समाधान से प्रत्येक दवा की खुराक के 10 μL जोड़ें।

कार्डियक भेदभाव प्रोटोकॉल के बहुमत नोडल जैसी, एड़ील-जैसी और वेंट्रिकुलर-जैसे कार्डियोयोमायसाइट्स की वेरिएबल मिश्रित आबादी के परिणामस्वरूप, वेंट्रिकुलर प्रकार का सबसे अधिक प्रतिनिधित्व होता है। यह एक सीमा का गठन कर सकता है जब कार्डियक रोगों से संबंधित एक विशिष्ट कार्डियोमायोसिट उपप्रकार या कार्डियक उपप्रकार-विशिष्ट आयन चैनलों पर अभिनय करने वाली दवाओं को प्रभावित करते हैं। हालांकि कई अध्ययनों ने कार्डियक भेदभाव 3 , 5 , 37 , 38 के दौरान अधिक नियंत्रित विनिर्देशों को निर्देशित करने के लिए परिस्थितियों का अनुकूलन किया है, हालांकि उनके विस्तृत प्रयोज्यता अभी भी जांच के तहत है।

इसके अलावा, भेदभाव की चर दक्षता (विभिन्न प्रयोगों और डि मेंFferent एचपीएससी लाइनों) 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 मनाया जा सकता है। सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति 35 , 45 (फ्लोरेंस सहायता सेल वर्गीकरण द्वारा या चुंबकीय-बीड चयन 46 , 47 ), और मेटाबोलिक चयन 44 , 48 के आधार पर कार्डिय्योमायसाइट-समृद्ध रणनीतियां किसी ऐसे वैध रणनीति का प्रतिनिधित्व कर सकती हैं जो किसी भी (आनुवंशिक रूप से संशोधित या विद्युत सिग्नल सुधारने के लिए एचपीएससी-सीएम के पूर्व चढ़ाना एचपीएससी लाइन।

यद्यपि एचपीएससी-सीएम मानव वयस्क कार्डियोयोमायॉइसाइट्स 4 , 4 9 की तुलना में कुख्यात अपरिपक्व हैं, लेकिन उन्होंने आर के मूल्यवान साबित कर दिया है1 9 , 20 , 50 और ड्रग-प्रेरित प्रतिक्रियाओं ( जैसे, कार्डियक आयन चैनल ब्लॉकर्स) 4 , 51 विशिष्ट रोग-संबंधित परिवर्तनों ( जैसे , चैनलोपाथीज़ में) से बचने और पहचानने। इसके अलावा, अपवित्र कोशिकाओं को अलग करना आसान है, और विस्थापन और चढ़ाना के बाद वयस्क कार्डियोयोमोओसाइट्स से बेहतर हो सकता है, इसलिए एचपीएससी-सीएम अपरिपक्वता को इस संबंध में लाभ के रूप में पुरस्कृत किया जा सकता है। हालांकि, उदाहरण के लिए पुनर्कथन करने में सक्षम होना दिल की बीमारियों में देर से शुरू होने और वयस्क कार्डियोमोसाइट्स के दवा के प्रति जवाबदेह पुन: पेश करते हैं, एक अधिक परिपक्व यांत्रिक, चयापचय, और विद्युत एचपीएससी-सीएम राज्य प्राप्त किया जाना चाहिए। इन कोशिकाओं को परिपक्व करने के तरीके संस्कृति 52 में लंबे समय तक शामिल हैं, यांत्रिक तनाव 53 , इलेक्ट्रिक पेसिंग 54 , छोटे के अलावाअणुओं 55 , 3 डी-संस्कृति 56 , अन्य सेल प्रकार 57 के साथ सह संस्कृति, और इन तरीकों का एक संयोजन भी 58 ; तिथि करने के लिए, इन तरीकों में से कोई भी एक वयस्क की तरह phenotype करने के लिए प्रेरित किया है

अपरिपक्वता सुविधाओं के हिस्से के रूप में, एचपीएससी-सीएम विद्युत स्वचालितता दिखाते हैं। यहां, विवरण क्यूटी और आरआर अंतराल सटीक रूप से मापने के तरीके पर उपलब्ध कराए जाते हैं। सहज विद्युत गतिविधि को मापने की एक सीमा यह है कि क्यूटी अंतरालों की तुलना मुश्किल हो सकती है जब एचपीएससी-सीएम अलग-अलग पिटाई आवृत्तियों का प्रदर्शन करते हैं। इस मामले में, आवृत्ति के लिए क्यूटी अंतराल को ठीक करने के लिए बज़ेट या फ्रिडरिया के सूत्रों का इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, जैसा कि पहले 30 की रिपोर्ट किया गया था, हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि सुधार विधि के कारण किसी भी संभावित पूर्वाग्रह को बाहर करने के लिए, कच्चे और सही दोनों डेटा के लिए आरआर अंतराल बनाम क्यूटी अंतराल की साजिश रचने के द्वारा मेजर-एक्सिस रिग्रेसन विश्लेषण का प्रदर्शन करना।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल, पहले वर्णित विधियों 59 , 60 के साथ, प्रक्रियाओं के मानकीकरण और एचपीएससी-सीएम एफपी के विश्लेषण में मदद करता है, डेटा प्रजनन क्षमता में सुधार और इंटर-प्रयोगशाला परिणामों की बेहतर तुलना की अनुमति देता है।

Disclosures

सीएलएम, प्लिओमिक्स बीवी का सह-संस्थापक और सलाहकार है। प्रकाशन लागत का हिस्सा मल्टी चैनल सिस्टम द्वारा कवर किया गया था।

Acknowledgments

यह काम निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित था: सीवोन (हस्टकार): नीदरलैंड कार्डियोवास्कुलर रिसर्च इनिशिएटिव (डच हार्ट फाउंडेशन, डच फेडरेशन ऑफ़ यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर, नीदरलैंड ऑरगेंगेशन फॉर हेल्थ रिसर्च एंड डेवलपमेंट एंड द रॉयल नीदरलैंड एकेडमी ऑफ साइंसेज); यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसीएडजी 323182 STEMCARDIOVASC) एचपीएससी कार्डियक भेदभाव के साथ मदद के लिए हम ई। गिकोमेलि (एलयूएमसी) का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet/laminar flow-hood Cleanair
MEA2100 in vitro recording system Multi Channel Systems
CO2 cell-culture incubator Sanyo MCO-15A
Centrifuge Hitachi himac-CT6EL
Leica stereomicroscope Leica Microsystems MS5
Handheld pipetman (P-10 (10 μL), P-200 (200 μL), P-1000 (1,000 μL)) Gilson International
Filter tips (10 μL, 200μL, 1,000μL) Corning 4807 (10 μL), 4810 (200μL), 4809 (1000μL)
Disposable bottle top filter (0.22 μm pore size) Millipore SCGVU02RE
Sterile plastic pipette Greiner Bio-One 606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)
Tweezers Dumont
Autoclavable Petri dishes VWR/ Duran Group 391-0860
MEA chip Multi Channel Systems MEA200/30iR-Ti-gr
Phosphate-buffered Saline (PBS) calcium, magnesium Thermo Fisher Scientific 14040-091
Phosphate-Buffered Saline (PBS) no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190-169
Human recombinant fibronectin Tebu-Bio J64560
Custom-made polytetrafluoroethylene (PTFE) MEA rings LUMC: department of Instrument Development
Dissociation enzyme - TrypLE Select 1x Thermo Fisher Scientific 12563-029
Tergazyme enzyme detergent Sigma-Aldrich Z273287-1EA
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230-089
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for LI-BPEL medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 21056-023
F12 nutrient mixture (Ham) Thermo Fisher Scientific 31765-027
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-038
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070-063
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Protein-free Hybridoma Medium-II (PFHMII) Thermo Fisher Scientific 12040-077
Bovine Serum Albumin (BSA) Bovogen Biologicals Australia BSAS05
Poly(Vinyl Alcohol) (PVA) Sigma-Aldrich P8136
Chemically-defined Lipid Concentrate (CDLC) Thermo Fisher Scientific 11905-031
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X) 100x Thermo Fisher Scientific 51599-056
α-Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
Name Company Software version Comments
MC_Rack Multi Channel Systems 4.6.2 Alternatively, data can be recorded using Cardio2D or MC_Experimenter (MultiChannel Systems)
TCX Control Multi Channel Systems 1.3.4
MEA Select Multi Channel Systems 1.3.0
MC_Data Tool Multi Channel Systems 2.6.15 Alternatively, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) can be used when custom data export is required (HDF5, EDF, etc.)
Clampfit Molecular Devices 7.0.0 Used in step 10.1 for analyzing, graphing, and formatting of all of data. To use Clampfit, download and install the electrophysiology data acquisition and pClam (latest version, 10.7.0), available on the Molecular Devices Website. Once complete, launch the software Clampfit. Alternatively, data can be analysed using Cardio2D (MultiChannel Systems) or MatLab custom code.

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References

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  7. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
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Sala, L., Ward-van Oostwaard, D., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L., Bellin, M. Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs). J. Vis. Exp. (123), e55587, doi:10.3791/55587 (2017).

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