Summary
Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, um in Drosophila melanogaster eine geschlossene traumatische Hirnverletzung zuzufügen. Unsere Methode hat den Vorteil, direkt wiederkehrende Stöße mit einstellbarer Kraft auf den Kopf allein zu liefern. Eine weitere Erforschung des wirbellosen Systems wird dazu beitragen, die Pathogenese der chronischen traumatischen Enzephalopathie zu erhellen.
Abstract
Chronische traumatische Enzephalopathie (CTE) ist eine etablierte neurodegenerative Erkrankung, die eng mit der Exposition gegenüber repetitiver milder Traumatischer Hirnverletzung (mTBI) assoziiert ist. Die Mechanismen, die für ihre komplexen pathologischen Veränderungen verantwortlich sind, bleiben trotz eines kürzlichen Konsenses, um die neuropathologischen Kriterien zu definieren, weitgehend schwer. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, um ein Modell des CTE in Drosophila melanogaster ( Drosophila ) zu entwickeln, um die Schlüsselgene und Wege zu identifizieren, die zu der charakteristischen hyperphosphorylierten Tauakkumulation und dem neuronalen Tod im Gehirn führen. Einstellbare Festigkeitsstöße, um eine leichte, verletzte Verletzung zuzufügen, werden direkt an den Fliegenkopf abgegeben, wobei der Kopf einer schnellen Beschleunigung und Verzögerung ausgesetzt wird. Unsere Methode eliminiert die potenziellen Probleme, die mit anderen Drosophila- MTBI-Modellen verbunden sind ( zB kann der Todesfall durch Schäden verursacht werdenAndere Körperteile oder innere Organe). Die weniger arbeits- und kostenintensive Tierpflege, die kurze Lebensdauer und umfangreiche genetische Werkzeuge machen die Fruchtfliegen ideal, um die CTE-Pathogenese zu untersuchen und es möglich zu machen, großflächige, genomweit vorwärts genetische und pharmakologische Bildschirme durchzuführen. Wir gehen davon aus, dass die laufende Charakterisierung des Modells wichtige mechanistische Erkenntnisse über Krankheitsverhütung und therapeutische Ansätze generieren wird.
Introduction
Chronische Traumatische Enzephalopathie (CTE) wurde vor kurzem als eine deutliche neurodegenerative Erkrankung, getrennt von anderen Tauopathien wie Alzheimer-Krankheit 1 erkannt. Im Gegensatz zu Alzheimer-Krankheit und anderen üblichen Tauopathien, deren wichtigste Risikofaktoren das Alter und eine Familiengeschichte der Demenz vorantreiben, bedeutet CTE, wie durch seinen Namen angedeutet, eine enge Verbindung mit einer Geschichte des Hirntraumas, die höchstwahrscheinlich bei Sportsportlern, Wie Boxer und Fußballspieler, sowie in Militärveteranen 2 , 3 , 4 , 5 . Es wird angenommen, dass sie durch wiederholte, konkurrierende und unerschütterliche Schläge zum Kopf initiiert wird. Patienten können Symptome und Anzeichen wie kognitive Defizite, Stimmungs- und Verhaltensänderungen und Bewegungsdysfunktion darstellen, die sich mit der Alzheimer-Krankheit signifikant überschneiden, frontotemporalDemenz, Lewy-Körper-Demenz und Parkinson-Krankheit 6 . Im Gegensatz dazu zeigen post-mortem-Untersuchungen des Hirngewebes ein deutliches Muster der hyperphosphorylierten Tau-Akkumulation, die kleine Blutgefäße in den Tiefen der kortikalen Sulci umgibt, ein pathognomonisches Merkmal, das bei den anderen degenerativen Zuständen nicht beobachtet wurde 7 . Allerdings ist bislang wenig über die Pathogenese bekannt, die zu einer Manifestation der Krankheit führt. Dies ist zum großen Teil auf das Fehlen eines treuen Tiermodells zurückzuführen - erst vor kurzem wurden Nagetiermodelle erzeugt 5 , 8 . Diese Modellorganismen haben die Nachteile einer kostenintensiven Versorgung und einer relativ langen Lebensdauer, die sich nicht für neurodegenerative Krankheitsstudien eignen.
Im Vergleich zu Säugetier-Pendants sind wirbellose Tiere wie Drosophila eine hervorragende Alternative mit ihrer kostengünstigen Instandhaltung,Umfangreiche Werkzeuge zum Sezieren von genetischen Determinanten und relativ kurzer Lebensdauer 9 . Bemerkenswert ist, dass fliege und menschliche Gehirne evolutionär konservierte molekulare und zelluläre Wege sowie anatomische Ähnlichkeiten 10 , 11 , 12 teilen. Zwei geniale Drosophila- Modelle zur Untersuchung traumatischen Hirnverletzungen wurden bisher 13 , 14 gemeldet. Das erste von Katzenberger und Kollegen entworfene "High Impact Trauma" (HIT) -Gerät enthielt frei bewegende Fliegen in einer Plastikfläschchen, die an das freie Ende einer Metallfeder 13 , 15 gebunden war. Als die Plastikfläschchen aufrecht und freigegeben wurde, schlug sie ein Polyurethan-Pad und verlieh den Fliegen ein Trauma, als sie auf die Fläschchenwand prallten und sich erholten. Im Gegensatz dazu haben Barekat und Kollegen eine andere Auslieferungsmethode entworfenDie Omni Perle Ruptor-24 Homogenisatorplattform 14 . Fliegen wurden mit CO 2 unfähig und in ein 2 mL Schraubverschlussrohr gegeben, das an dem Homogenisator befestigt war und vorprogrammierten Schüttelbedingungen unterworfen wurde. Ein Vorteil der Verwendung des Gewebe-Homogenisatorsystems ist, dass der Experimentator die Intensität der Verletzung, die Dauer der Verletzung und die Anzahl der Verletzungskämpfe modulieren könnte. Allerdings leiden beide Regime den gleichen Nachteil: Primäre Verletzungen des Kopfes werden zufällig in Bezug auf die Auswirkungen Lage und Stärke zugefügt. Darüber hinaus führten beide Methoden zu einer beträchtlichen Mortalität, die durch unvermeidliche Kollateralschäden an anderen Körperteilen und inneren Organen verursacht wurde. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, um mTBI in Fruchtfliegen zu induzieren. Unser Gerät besteht aus einem gasbetriebenen ballistischen Impaktor. Im Vergleich zu den bestehenden Drosophila Modellen 14 , 15 hat unsere Methode den einzigartigen Vorteil, Messungen zu liefernDie nur auf den frei beweglichen Fliegenkopf gerichtet ist, so dass die genaue Steuerung verschiedener Faktoren, wie zB Einflussschwere, das Zeitintervall zwischen den Auswirkungen und die Gesamtzahl der anhaltenden Auswirkungen ermöglicht wird.
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Protocol
1. Montage des Schlaggerätes ( Bild 1 )
- Den Kolben aus einer 1 ml Tuberkulinspritze entfernen. Schneiden Sie das Fass auf die 1-ml-Marke.
- Eine Aerosolbarriere (3 mm Höhe x 4 mm Durchmesser) von einer 200 μl Pipettenspitze entfernen und als Impaktor verwenden. Legen Sie den Impaktor in den Spritzenzylinder. Ziehen Sie vorsichtig den Fass, um den Schlagkörper zum Spitzenende zu bewegen, wobei die flache Seite die Düsenöffnung bedeckt.
- Befestigen Sie das Fassspitzenende an Kunststoffschlauch, das mit dem Kohlendioxid (CO 2 ) Durchflussregler einer Drosophila Anästhesiestation verbunden ist.
- Halten Sie den Fass senkrecht und klemmen Sie ihn an einen Standard-Klemmhalterständer, so dass der Impaktor am Boden des Fasses bleibt.
- Ändern Sie eine 200 μl Pipettenspitze, um den Fliegenhalter zu machen.
- Schneiden Sie 4 mm von der Spitze, um eine Öffnung von 0,8 mm Durchmesser zu machen, so dass nur der Fliegenkopf ausgesetzt werden kann.
HINWEIS: Das thoRax und alle anderen Teile des Fliegenkörpers bleiben in der Pipettenspitze.
- Schneiden Sie 4 mm von der Spitze, um eine Öffnung von 0,8 mm Durchmesser zu machen, so dass nur der Fliegenkopf ausgesetzt werden kann.
- Ändern Sie eine 1.000 μl Pipettenspitze und eine 1 mL Spritzen-Nadelkappe, um den Stecker herzustellen.
- 44 mm von der Spitze der Spitze abschneiden. Nehmen Sie eine 6 mm Länge einer 1 mL Spritzen-Nadelkappe und schieben Sie sie fest in das verbleibende Segment der 1.000 μl Pipettenspitze.
2. Bedienung des Schlaggerätes
- Anästhesieren Sie eine einzelne 2-tägige erwachsene weibliche Fliege mit CO 2 auf einem Fliegenkissen.
- Vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf den Fliegenhalter übertragen. Tippen Sie sanft auf den Halter, damit der Fliegenkopf außerhalb des Spitzenendes gesehen wird. Wenn der Fliegen-Rüssel außerhalb der Spitze ausgesetzt ist, stecken Sie ihn vorsichtig mit einer abgestumpelten 1-ml-Spritzenadel in die Spitze.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Fliegen-Rüssel in der Halterung zu halten. Andernfalls kann die Fliege an einer saugenden Rüsselverletzung sterben. - Ziehen Sie die Fliege hochMit dem Stecker auf den Spritzenzylinder auftragen, damit der Fliegenkopf nach unten zeigt.
- Den Gasdruck auf 100 kPa einstellen. Stellen Sie den Durchfluss entsprechend dem Experimentdesign ein.
- Schalten Sie den Durchflussregler schnell ein und aus, so dass der Impaktor einmal auf den Fliegenkopf schlägt.
- Heben Sie den Fliegenhalter an und bewegen Sie ihn über ein Fliegenkissen. Den Fliegenhalter umkehren und vorsichtig an die Seite klopfen Lassen Sie die Fliege in einer leeren Ampulle, um sich zu erholen.
3. Video-unterstützte Bewegungsverfolgung
- Füllen Sie eine Petrischale mit 6 cm Durchmesser mit transparentem Silikon-Elastomer, um die Tracking-Arena zu machen. Lassen Sie einen Abstand von 3 mm zwischen dem Silizium und dem Tellerdeckel, damit die Fliegen frei laufen können, aber nicht fliegen.
- Anästhesieren Sie vier Fliegen aus dem Schein oder der behandelten Gruppe jedes Mal und legen Sie sie in die Arena. Lassen Sie die Fliegen bei 22 ° C für 1 h.
- Positionieren Sie eine Charge-Coupled Device (CCD) Kamera über den Arenen und notieren Sie für 5 min.
- Analysieren Sie die aufgezeichneten Bewegungsbahnen mit Ctrax-Software (frei verfügbar bei Caltech) 16 . Exportieren Sie die verfolgten Daten in einer Programmiersprache (zB Matlab) -kompatibles Format und analysieren Sie die Daten auf der Grundlage der zurückgelegten Strecke pro Rahmen 17 . Berechnen Sie die mittlere Wanderung für jede Fliege und kombinieren Sie sie mit allen anderen aufgezeichneten Fliegen / Gruppe, um eine mittlere kumulative Distanz zu erhalten, die von der Population von Dateien in derselben Gruppe zurückgelegt wird.
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Representative Results
Um ein CTE-Modell mit erwachsenen Drosophila zu etablieren , haben wir die Wirksamkeit unseres Gerätes bei der Vermeidung einer einzigen geschlossenen Verletzung festgestellt. Um die Variationen in Bezug auf Genotyp, Geschlecht oder Alter zu beseitigen, haben wir im Experiment 2-tägige Canton-S WT weibliche Fliegen verwendet. Wir konnten die Festigkeit des Impaktors leicht kontrollieren, indem wir die Strömungsgeschwindigkeit von CO 2 bei einem konstanten Gasdruck von 100 kPa regulieren. Fliegen, die einem einzigen Schlag mit der höchsten Durchflussrate (15 L / min) ausgesetzt waren, zeigten minimale äußere Defekte ( Abbildung 2 ). Sowohl die äußeren Augen als auch der Mundstück schienen intakt zu sein. Trotzdem haben wir festgestellt, dass eine Durchflussrate von 15 l / min akut tödlich war, was zu weniger als 10% Überlebensrate innerhalb von 24 h führte ( Abbildung 3A ). Im Gegensatz dazu ergab die Exposition gegenüber einem 10 oder 7,5 L / min-Streik 61,1% bzw. 96,3% Überleben, während bei 5,0 und 2,5 L / min Fließraten alle Fliegen achtern überlebtenEr 24 h ( Abbildung 3A ). Deshalb haben wir unsere zukünftigen Studien auf die 5,0 l / min CO 2 Durchflussrate standardisiert. Nach einem Streik bei 5,0 l / min erholten sich die Fliegen allmählich innerhalb von 4 min ( Abbildung 3B ). Über die nächsten 2 d wurde ihre Lokomotivfunktion, gemessen durch Gehfähigkeit, langsam wieder normalisiert ( Abbildung 3C ). Als vorläufige Einschätzung erinnern diese Phänotypen an diejenigen, die von Leuten präsentiert wurden, die Gehirnerschütterungen oder leichte Traumata erlebt haben 18 . Patienten mit traumatischen Hirnverletzungen, die oft mit einer fortschreitenden Verschlechterung der Muskelbewegungen und des vorzeitigen Todes auftreten.
Um die Langzeitwirkungen von mehrfachen Hirnverletzungen zu bewerten, haben wir ein MTBI-Protokoll von fünf aufeinanderfolgenden Streiks bei der 5,0 l / min-Durchflussrate angewendet, wobei 24 h Erholungsperioden zwischen jedem Streik liegen. Zu untersuchen E die Auswirkungen von mTBI auf Bewegungsfunktion, haben wir ein Video-assisted Motion Tracking System verwendet, um das Fliegenmotor Verhalten zu analysieren. Nach der Alterung der Fliegen 20 d Nachbehandlung zeigte die mTBI-behandelte Gruppe eine verminderte Gehaktivität und eine zurückgelegte Strecke gegenüber der Scheingruppe ( Abbildung 4 A & B ; Scheingruppe: 6,49 ± 0,72, n = 28 gegenüber der behandelten Gruppe: 4,3 ± 0,47, n = 32; p <0,05). Um zu untersuchen, ob wiederholte Hirnverletzungen irgendwelche chronischen Auswirkungen auf das Überleben haben, haben wir die Lebensdauer der Fliegen bestimmt, die das mTBI-Protokoll ertragen. In der Abbildung 4C gezeigt , verglichen mit der Scheingruppe (n = 129) hatten die behandelten Fliegen (n = 100) eine wesentlich reduzierte mittlere Lebensdauer (36,9 ± 2,7 vs. 26,3 ± 0,9 d) und reduzierten die maximale Lebensdauer (49,3 ± 2,4) Vs. 34,7 ± 1,4 d).
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Abbildung 1 Diagramm des Strike-Gerätes. Das Gerät verwendete Materialien, die in einem Drosophila- Labor leicht zugänglich sind: 1) 200 μl Pipettenspitze, 2) 1 ml Tuberkulinspritze, 3) Impaktor, 4) Verbindungsrohr an eine Drosophila Anästhesiestation gehängt und 5) Verbinder zum Festziehen der Spitze Auf die Spritze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 Mild Closed-Head Traumatische Verletzung. Ein einziger Streik bei der höchsten Gasströmung zeigte keine offensichtliche äußere Beschädigung des Kopfes, des Körpers oder der Anhänge. ( A &B ) Strike-fliegende Fliege ( C & D ) Sham fliegen Die Scheinfliegen unterzogen sich genau den gleichen Vorgehensweisen wie die behandelte Gruppe, einschließlich der Transfers auf und weg vom Fliegenhalter, außer daß kein Impaktor in den Spritzenzylinder gelegt wurde, als der CO & sub2; -Fluß angewandt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 Die Wirkung eines Single Strike. ( A ) Der Überlebensindex bei 24 h (SI 24 ), der durch den Prozentsatz der Fliegen definiert ist, der innerhalb von 24 h nach einem Streik überlebte, wird gegenüber der Gasströmungsrate erfasst. Fliegen, die einmal mit dem 5,0 L / min Gasfluss getroffen wurden, erholten die Bewegungsaktivität mitIn 4 min ( B ), und ihre Beweglichkeit langsam wieder normal über einen Zeitraum von 2 d ( C) . Fehlerbalken, Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 Entwicklung des mTBI-Modells in Drosophila . Wiederholte Streiks über fünf Tage führten zu einer signifikant beeinträchtigten Bewegungsaktivität ( A & B ) und einer verminderten Lebensdauer ( C ). Repräsentative Wanderwege, die über 5 min für 4 Sham und bearbeitete Fliegen aufgezeichnet wurden, sind in A angezeigt. Fehlerbalken, SEM. * P <0,05, Mann-Whitney U-Test mit Bonferroni-Korrektur. Gesamtfliegen: behandelte Gruppe n = 100, ScheingruppeN = 129. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Tiermodelle, die CTE-Merkmale, wie neurophysiologische Veränderungen, neuropathologische Kennzeichen und neurobehaviorale Defizite, treu modellieren, sind für die Aufdeckung von Krankheitsmechanismen und für die Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Ziele unerlässlich. Es ist verständlich, dass kein Tiermodell einer menschlichen Erkrankung perfekt ist, um alle klinisch relevanten Endpunkte nachzuahmen. Allerdings glauben wir, dass ein robustes CTE-Modell die folgenden drei Anforderungen erfüllen sollte: (1) Die Auswirkungen müssen direkt auf einen Kopf angewendet werden, der eine intakte Kopf- und Schädelschutz hat; (2) Der Kopf sollte während der Stoßbelastung nicht immobilisiert werden, so dass schnelle Beschleunigungsverzögerung und Dreh- und Linearkopfbewegungen erlaubt sind; Und (3) Die experimentelle Gestaltung sollte sowohl einzelne als auch sich wiederholende Regime umfassen, und die Auswirkungenfolgen sollten mild in der Natur sein, ohne sichtbare Schäden wie Gewebeödem, Kontusion oder offene Blutung zu verursachen.
OuDas Fruchtfliegenmodell unterscheidet sich von anderen Methoden, die in den Fliegen 13 , 14 , 15 eine traumatische Hirnverletzung zufügen. Sowohl das Bead Ruptor-Modell als auch das HIT-Gerät verursachen Verletzungen mit zufälliger Auswirkung und Stärke. Bei beiden Methoden berühren sich die variablen Anzahl von Fliegen, die entweder in einer Standard-Kunststoff-Durchstechflasche oder einem 2-mL-Schraubverschluss-Schlauch enthalten sind, mit der Behälterwand in Berührung und treten bei jedem Schlag oder Verletzungsstoß mehrmals zurück. Da die Fliegen im Inneren des Behälters frei beweglich sind, sind die primären Verletzungen für einzelne Fliegen erheblich verschieden, da verschiedene Körperteile und / oder Köpfe mit unterschiedlichen Kräften verletzt werden. So ist es nicht verwunderlich, dass die Fliegen unter Verwendung dieser Modelle an Darmstörungen der Darmsperre litten. Dies war direkt mit der Sterblichkeitsrate in beiden Regimen 13 , 14 korreliert, was stark anzeigt, dass nOn-neuronale Veränderungen waren verantwortlich für trauma-induzierten Tod in beiden Systemen. Im Gegensatz dazu ist unsere Methode in der Lage, wiederholt direkte Kopfauswirkungen an denselben Standort zu liefern. Der Körper ist vor einer direkten Exposition geschützt, wodurch die potentiellen Vorbehalte beseitigt werden, die durch Schäden an anderen Körperteilen oder inneren Organen verursacht werden könnten. Zusätzlich kann die Strömungsrate des CO 2 -Gases, das verwendet wird, um das Gewicht zu treiben, reguliert werden, um eine kontrollierte, einstellbare Festigkeit zu erreichen. Am wichtigsten ist, dass der Fliegenkopf zum Zeitpunkt des Streiks nicht eingeschränkt ist, was einen sehr schnellen Beschleunigungsverzögerungsprozess ermöglicht, der die häufigste Form von mTBI imitiert, die in der menschlichen Bevölkerung auftritt.
Obwohl es ideal wäre, einen automatischen Ein- / Ausschalter zur Steuerung des CO 2 -Stromreglers zu installieren, scheint der aktuelle Handschalter die Reproduzierbarkeit der Impaktorkraft nicht zu beeinträchtigen, da der Aufbau unseres Gerätes alle istOws die Kraft schnell ausgeübt werden, sobald der Impaktor den Kopf schlägt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser System ein neuartiges Regime bietet, um mTBI besser nachzuahmen und eine neue Plattform für die Modellierung von CTE einzuführen. Wie andere Drosophila- Modelle, die sich bei der Entschlüsselung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen 9 , 20 als wertvoll erwiesen haben, wird davon ausgegangen, dass die fortlaufende detaillierte Charakterisierung des Modells in Bezug auf den neuronalen Verlust, die Tau-Hyperphosphorylierung, die TDP-43-Proteinopathie und die neuroinflammatorische Reaktion auf das zugefügte mTBI Generieren wichtige mechanistische Einblicke in CTE-Krankheitsprozesse und wird dazu beitragen, einige der kritischen Fragen auf dem Gebiet zu beantworten.
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Disclosures
Diese Arbeit wurde von der Johns Hopkins University School of Medicine Fakultät Startup Fund an LC unterstützt
Acknowledgments
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
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