Summary
Qui descriviamo un nuovo approccio per infliggere danni traumatici al cervello chiuso a Drosophila melanogaster . Il nostro metodo ha il vantaggio di trasmettere direttamente impatti ripetitivi con forza regolabile solo alla testa. Un'ulteriore esplorazione del sistema invertebrato contribuirà ad illuminare la patogenesi di encefalopatia traumatica cronica.
Abstract
L'encefalopatia traumatica cronica (CTE) è una malattia neurodegenerativa consolidata che è strettamente associata all'esposizione a un mite traumatico (TMT) ripetitivo. I meccanismi responsabili dei suoi complessi cambiamenti patologici rimangono in gran parte sfuggenti, nonostante un recente consenso per definire i criteri neuropatologici. Qui descriviamo un nuovo metodo per sviluppare un modello di CTE in Drosophila melanogaster ( Drosophila ) nel tentativo di identificare i geni chiave e le vie che portano al caratteristico accumulo tau iperfosforilato e alla morte neuronale nel cervello. Impatti di forza di regolazione per infliggere lesioni chiuse lievi vengono consegnati direttamente alla testa di mosca sottoponendo la testa ad accelerazione e decelerazione rapida. Il nostro metodo elimina i problemi potenziali inerenti ad altri modelli moto Drosophila ( ad esempio, la morte animale potrebbe essere indotta da danni aAltre parti del corpo o agli organi interni). La mancanza di manodopera a basso costo e a basso costo, una breve durata di vita e estesi strumenti genetici rendono la frutta ideale per studiare la patogenesi della CTE e rendere possibile la realizzazione di schermi genetici e farmacologici avanzati su vasta scala genomica. Prevediamo che la continua caratterizzazione del modello genera importanti conoscenze meccaniche sulla prevenzione delle malattie e sugli approcci terapeutici.
Introduction
L'encefalopatia traumatica cronica (CTE) è stata recentemente riconosciuta come un disturbo neurodegenerativo distinto, separato da altre tauopatie come la malattia di Alzheimer 1 . A differenza della malattia di Alzheimer e di altre tauopatie comuni, i cui fattori di rischio più importanti stanno avanzando l'età e una storia familiare di demenza, la CTE, come indicato dal suo nome, implica una stretta collaborazione con una storia di traumi cerebrali, probabilmente visto in atleti sportivi di contatto, Come pugili e calciatori, così come nei veterani militari 2 , 3 , 4 , 5 . Si pensa di essere iniziato da ripetuti colpi concussivi e subconcutici alla testa. I pazienti possono presentare sintomi e segni quali disordini cognitivi, cambiamenti di umore e comportamento e disfunzione di movimento, che si sovrappongono in modo significativo con la malattia di Alzheimer, frontotemporalDemenza, demenza del corpo di Lewy e malattia di Parkinson 6 . Al contrario, gli esami post-mortem del tessuto cerebrale rivelano un modello distinto di accumulo di tau per iperfosforilati che circonda i piccoli vasi sanguigni nelle profondità dei sulci corticali, caratteristica patognomonica non osservata nelle altre condizioni degenerative 7 . Tuttavia, finora poco si sa sulla patogenesi che conduce alla manifestazione delle malattie. Questo è in gran parte dovuto alla mancanza di un modello animale fedele - solo di recente sono stati generati modelli roditori 5 , 8 . Questi organismi di modello hanno gli svantaggi di una terapia intensiva e una durata di vita relativamente lunga, che non sono adatti per studi di malattia neurodegenerativa.
Rispetto alle omologhe di mammiferi, gli animali invertebrati come Drosophila sono un'ottima alternativa, con la loro manutenzione economica,Strumenti estensivi per la dissezione di determinanti genetici e durata relativamente breve 9 . Notevolmente, il cervello volante e umano condividono le vie molecolari e cellulari evolutamente conservate, nonché le somiglianze anatomiche 10 , 11 , 12 . Due geniali modelli Drosophila per studiare lesioni cerebrali traumatiche sono state riportate in precedenza 13 , 14 . Il primo dispositivo "High Impact Trauma" (HIT) progettato da Katzenberger e colleghi conteneva mosche in movimento in una flaconcina di plastica legata all'estremità libera di una molla metallica 13 , 15 . Quando il flaconcino di plastica è stato inclinato in verticale e rilasciato, ha colpito un tampone di poliuretano e impartito il trauma alle mosche quando si sono rimbalzati alla parete del flacone e rimbalzato. Al contrario, Barekat e colleghi hanno progettato un diverso metodo di consegnaLa piattaforma omogeneizzatrice Omni Bead Ruptor-24 14 . Le mosche sono state inabilitate con CO 2 e poste in un tubo a vite da 2 mL che è stato fissato all'omogenizzatore e sottoposto a condizioni di scossa preprogrammate. Un vantaggio di utilizzare il sistema di omogeneizzazione dei tessuti è che lo sperimentatore potrebbe modulare l'intensità della lesione, la durata della lesione e il numero di attacchi di lesioni. Tuttavia, entrambi i regimi subiscono lo stesso inconveniente: lesioni primarie alla testa vengono inflitte casualmente in termini di posizione e forza di impatto. Inoltre, entrambi i metodi hanno determinato una notevole mortalità, causata da inevitabili danneggiamenti collaterali ad altre parti del corpo e degli organi interni. Qui descriviamo un nuovo metodo per indurre mTBI nelle mosche di frutta. Il nostro apparecchio è costituito da un impatto balistico a propulsione a gas. Rispetto ai modelli Drosophila 14 , 15 , il nostro metodo ha il vantaggio unico di fornire measImpatto urra, diretto solo alla testa di mosca libera, consentendo così il controllo accurato di vari fattori, come la gravità dell'impatto, l'intervallo di tempo tra gli impatti e il numero totale di impatti sostenuti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montaggio del Dispositivo Strike ( Figura 1 )
- Rimuovere lo stantuffo da una siringa tubercolina da 1 ml. Tagliare la canna al punto di 1 ml.
- Rimuovere una barriera aerosol (3 mm di altezza x 4 mm di diametro) da una punta di pipetta da 200 μl e utilizzarla come impattatore. Posizionare l'impatto nell'interno della barra della siringa. Toccare delicatamente il cilindro per spostare l'impattatore all'estremità della punta, con il lato piatto che copre l'apertura dell'ugello.
- Fissare l'estremità della punta del tubo al tubo di plastica collegato al regolatore di flusso di anidride carbonica (CO 2 ) di una stazione di anestesia Drosophila .
- Tenere la barella verticalmente e fissarla a un supporto di supporto standard di bloccaggio in modo che il dispositivo di impatto rimanga in fondo alla canna.
- Modificare una punta pipetta da 200 μl per realizzare il supporto mosca.
- Tagliare 4 mm dalla punta per fare un'apertura di diametro di 0,8 mm, consentendo solo di esporre la testa a mosca.
NOTA: il thoRax e tutte le altre parti del corpo mosca rimarranno all'interno della punta pipetta.
- Tagliare 4 mm dalla punta per fare un'apertura di diametro di 0,8 mm, consentendo solo di esporre la testa a mosca.
- Modificare una punta pipetta da 1000 μL e un tappo ago da 1 ml di siringa per realizzare il connettore.
- Tagliare 44 mm dall'apertura della punta. Prendete una lunghezza di 6 mm di un capsula da 1 ml della siringa e spingetela strettamente nel segmento rimanente della punta della pipetta da 1000 μL.
2. Funzionamento del dispositivo Strike
- Anestetizza una singola femmina adulta di 2 giorni che vola usando CO 2 su un moscerino.
- Trasferitelo delicatamente sul supporto di mosca usando una spazzola fine. Toccare delicatamente il supporto in modo che la testa di mosca sia visibile all'esterno dell'estremità della punta. Se la proboscide di mosca è esposta al di fuori della punta, infilate leggermente dentro la punta con un ago sferico da 1 ml sbattuto.
NOTA: Assicurarsi di mantenere la proboscide di mosca all'interno del supporto. Altrimenti, la mosca può morire da un infortunio alla ventosa. - Serrare la moscaSulla barra della siringa con il connettore in modo che la testa di mosca sia rivolta verso il basso.
- Impostare la pressione del gas a 100 kPa. Regolare la portata secondo il disegno dell'esperimento.
- Spostare e spegnere rapidamente l'interruttore del regolatore di flusso in modo che l'urto di impatto raggiunga una volta la testa di mosca.
- Sollevare il supporto mosca e spostarlo su un rilievo di mosca. Invertire il supporto volante e toccare delicatamente il lato per far uscire il volo. Lasciare la mosca in un flacone vuoto per recuperare.
3. Monitoraggio del movimento assistito video
- Riempire un piatto di Petri da 6 cm con elastomero trasparente al silicio per realizzare l'arena di tracciamento. Lasciare uno spazio di 3 mm tra il silicone e il coperchio del piatto per consentire alle mosche di camminare liberamente ma non di volare.
- Anestetizzare quattro mosche dal gruppo o dal gruppo trattato ogni volta e piazzarli nell'arena. Lasciare le mosche a 22 ° C per 1 ora.
- Posizionare una telecamera con dispositivo di accoppiamento (CCD) sopra le arene e registrare per 5 minuti.
- Analizzare le traiettorie di movimento registrate usando il software Ctrax (liberamente disponibile da Caltech) 16 . Esportare i dati tracciati in un linguaggio di programmazione (ad esempio, Matlab) -compatibile e analizzare i dati in base alla distanza percorsa per fotogramma 17 . Calcolare la distanza percorsa media per ogni mosca e combinarla con tutte le altre mosche registrate / gruppo per ottenere una distanza cumulativa media percorsa dalla popolazione di file nello stesso gruppo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per stabilire un modello CTE con l'adulto Drosophila abbiamo determinato l'efficacia del nostro dispositivo per infliggere una singola lesione alla testa chiusa. Per eliminare le variazioni relative al genotipo, al sesso o all'età, abbiamo usato le mosche femminili Canton-S WT di due giorni nell'esperimento. Potremmo facilmente controllare la resistenza dell'impulso di impatto regolando la portata di CO 2 ad una pressione costante di 100 kPa. Le mosche esposte ad un singolo colpo alla massima portata (15 L / min) presentavano difetti esterni minimi ( Figura 2 ). Sia gli occhi e la bocca esterni apparivano intatti. Tuttavia, abbiamo riscontrato che una portata di 15 L / min era acutamente letale, con conseguente meno di un tasso di sopravvivenza del 10% entro 24 ore ( Figura 3A ). Al contrario, l'esposizione ad un colpo di 10 o 7,5 L / min ha determinato rispettivamente il 61,1% e il 96,3% di sopravvivenza, mentre a 5,0 e 2,5 L / min, tutte le mosche sopravvissero alla poppaEr 24 h ( Figura 3A ). Pertanto, abbiamo standardizzato i nostri studi futuri alla portata di CO 2 di 5,0 L / min. Dopo uno sciopero a 5,0 L / min, le mosche si ritrovano gradualmente recuperate la loro mobilità entro 4 minuti ( Figura 3B ). Nel corso dei successivi 2 giorni, la loro funzione locomotiva, misurata dalla capacità di camminare, si è ripristinata lentamente ( Figura 3C ). Come valutazione preliminare, questi fenotipi ricordano quelli presentati da persone che hanno avvertito un intorpidimento o un lieve livello di trauma 18 . I pazienti affetti da lesioni cerebrali traumatiche spesso presentano un progressivo deterioramento dei movimenti muscolari e della morte prematura.
Per valutare gli effetti a lungo termine di più lesioni cerebrali, abbiamo applicato un protocollo mTBI di cinque colpi consecutivi alla portata di 5,0 L / min, con 24 ore di recupero tra ogni sciopero. Per indagare E l'impatto di mTBI sulla funzione di movimento, abbiamo utilizzato un sistema di monitoraggio del movimento video assistito per analizzare il comportamento del motore mosca. Dopo l'invecchiamento delle mosche 20 d dopo il trattamento, il gruppo trattato con mTBI ha mostrato una ridotta attività a piedi e una distanza percorsa rispetto al gruppo di truffa ( Figura 4 A & B ; gruppo di sanguinamento: 6,49 ± 0,72, n = 28 rispetto al gruppo trattato: 4,3 ± 0,47, n = 32, p <0,05). Per studiare se le lesioni cerebrali ripetute hanno effetti cronici sulla sopravvivenza, abbiamo determinato la durata della vita delle mosche che hanno subito il protocollo mTBI. Nelle figure 4C , rispetto al gruppo sham (n = 129), le mosche trattate (n = 100) hanno una durata mediana sostanzialmente ridotta (36,9 ± 2,7 V 26,3 ± 0,9 d) e riducono notevolmente la durata massima (49,3 ± 2,4 34,7 ± 1,4 d).
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55602 / 55602fig1.jpg "/>
Figura 1 . Diagramma del dispositivo Strike. Il dispositivo ha utilizzato materiali facilmente disponibili in un laboratorio di Drosophila : 1) punta pipetta da 200 μL, 2) 1 ml tubercolina, 3) impatto, 4) tubo di collegamento agganciato ad una stazione di anestesia Drosophila e 5) connettore per serrare la punta Sulla siringa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Lesione traumatica lieve a testa chiusa. Un singolo colpo al massimo flusso di gas non ha subito danni esterni evidenti alla testa, al corpo o alle appendici. ( A &B ) Mosca inflitta da scioperi. ( C & D ) Sham fly. Le mosche vergini subirono esattamente le stesse procedure del gruppo trattato, compresi i trasferimenti su e fuori dal porta fly, tranne che nessun impatto è stato inserito nel barile della siringa quando è stato applicato il flusso di CO 2 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . L'effetto di un singolo sciopero. ( A ) L'indice di sopravvivenza a 24 h (SI 24 ), definito dalla percentuale di mosche che è sopravvissuto entro 24 ore dopo uno sciopero, viene graffeggiato rispetto alla portata del gas. Le mosche che sono state colpite una volta con il gas di 5,0 L / min hanno recuperato l'attività del locomotore conIn 4 min ( B ), e la loro mobilità è stata lentamente ristabilita in normalità per un periodo di 2 d ( C) . Barra di errore, errore standard del mezzo (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Sviluppo del modello mTBI in Drosophila . Gli scioperi ripetuti in cinque giorni hanno determinato un'attività di locomotore ( A & B ) significativamente compromessa e una ridotta durata di vita ( C ). Le tracce a piedi rappresentative registrate su 5 min per 4 mosche e le mosche trattate sono mostrate in A. Barre di errore, SEM. * P <0.05, Mann-Whitney U-test con una correzione Bonferroni. Totale mosche: gruppo trattato n = 100, gruppo shamN = 129. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I modelli animali che modellano fedelmente le caratteristiche del CTE, comprese le alterazioni neurofisiologiche, i segni neuropatologici e i disordini neurobehaviorali, sono essenziali per scoprire i meccanismi della malattia e per sviluppare obiettivi diagnostici e terapeutici. È comprensibile che nessun modello animale di una malattia umana sia perfetto a imitare tutti gli endpoint clinicamente rilevanti. Tuttavia, riteniamo che un robusto modello CTE dovrebbe soddisfare i seguenti tre requisiti: (1) l'impatto deve essere direttamente applicato a una testa che ha una protezione intatta del cuoio capelluto e del cranio; (2) la testa non deve essere immobilizzata durante l'esposizione di impatto in modo da consentire rapidi accelerazioni-decelerazioni e movimenti della testa rotativa e lineare; E 3) il progetto sperimentale dovrebbe includere regimi singoli e ripetitivi e le conseguenze di impatto dovrebbero essere di natura lieve, senza causare danni visibili, quali edema tessuto, contusione o emorragia franca.
ouIl modello di moschea frutta è distinto da altri metodi che infliggono lesioni traumatiche al cervello nelle mosche 13 , 14 e 15 . Sia il modello di Ruptor Bead che il dispositivo HIT infliggono lesioni con posizione e forza di impatto casuale. In entrambi i metodi, i numeri variabili delle mosche contenute in una flaconcina di plastica standard o di un tubo a vite da 2 mL avvicinano la parete del contenitore e rimbalzano più volte durante ogni attacco di lesioni o lesioni. Poiché le mosche sono liberamente mobili all'interno del contenitore, le lesioni primarie inflitte sono notevolmente diverse per le singole mosche, poiché diverse parti dei loro corpi e / o teste sono feriti con forze diverse. Quindi, non sorprende che, usando questi modelli, le mosche subirono una disfunzione della barriera intestinale. Questo era direttamente correlato con il tasso di mortalità in entrambi i regimi 13 , 14 , indicando fortemente che nLe alterazioni neuronali erano responsabili della morte indotta da traumi in entrambi i sistemi. Al contrario, il nostro metodo è in grado di ripetutamente distribuire impatti diretti della testa nella stessa posizione. Il corpo è protetto da qualsiasi esposizione diretta, eliminando i possibili avvertimenti che la morte potrebbe essere causata da danni ad altre parti del corpo o agli organi interni. Inoltre, la portata del gas CO 2 utilizzato per spingere il peso può essere regolata per ottenere una forza regolabile e regolabile. La cosa più importante è che la testa di mosca non è vincolata al momento dello sciopero, consentendo un processo di accelerazione-decelerazione molto rapido che imita la forma più comune di mTBI che si verifica nella popolazione umana 19 .
Anche se sarebbe ideale installare un interruttore automatico on / off per controllare il regolatore di flusso del CO 2 , l'interruttore manuale corrente non sembra influenzare la riproducibilità della forza dell'impulso perché la progettazione del nostro dispositivo tuttiRegola la forza per essere esercitata rapidamente una volta che l'urto di impatto colpisce la testa.
In sintesi, il nostro sistema fornisce un nuovo regime per meglio imitare mTBI, introducendo una nuova piattaforma per modellare CTE. Come altri modelli Drosophila che si sono dimostrati utili per decifrare i disturbi neurodegenerativi umani 9 , 20 , si prevede che la continua caratterizzazione dettagliata del modello in termini di perdita neuronale, iu iperforosforilazione, la proteopatia TDP-43 e la risposta neuroinfiammatoria al mTBI inflitto Generano importanti intuizioni meccaniche nei processi della malattia di CTE e contribuiranno a rispondere a alcune delle domande critiche del settore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Facoltà di Johns Hopkins University School of Medicine di startup fund a LC
Acknowledgments
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
References
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
- Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
- Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
- Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
- Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407 (2013).
- McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
- Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
- Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
- Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252 (2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
- Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).
