Summary
ここでは、 ショウジョウバエのメラノガスター（melanogaster）における閉鎖頭部外傷性脳傷害を引き起こす新しいアプローチについて説明する。私たちの方法は、調整可能な強さで反復的な衝撃を直接ヘッドに伝えるという利点があります。無脊椎系のさらなる探索は、慢性外傷性脳症の病因を明らかにするのに役立つだろう。
Abstract
慢性外傷性脳症（CTE）は、繰り返し軽度の外傷性脳傷害（mTBI）への暴露と密接に関連する確立された神経変性疾患である。神経病理学的基準を定義するための最近のコンセンサスにもかかわらず、その複雑な病理学的変化の原因となっている機構は、依然として分かりにくいままである。ここでは、 ショウジョウバエメラノガスター （ ショウジョウバエ ）におけるCTEのモデルを開発して、特徴的な過剰リン酸化タウの蓄積および脳における神経細胞の死につながる重要な遺伝子および経路を同定するための新しい方法を説明する。軽度の閉鎖傷害を与えるための調整可能な衝撃は、ヘッドを急速な加減速にさらし、フライヘッドに直接供給されます。我々の方法は、他のショウジョウバエの mTBIモデルに内在する潜在的な問題を排除する（ 例えば、動物死は、身体の他の部分または内部器官）。労力とコストを重視する動物の手入れが少なく、寿命が短く、遺伝的ツールが豊富で、CTEの病因を研究し、ゲノム規模の大規模な遺伝的および薬理学的スクリーニングを行うことができます。我々は、モデルの進行中の特徴付けが、疾患の予防および治療アプローチに関する重要な機構的な洞察を生成すると予想する。
Introduction
慢性外傷性脳症（CTE）は、最近、アルツハイマー病などの他のタウオパシーとは別個の別個の神経変性障害として認識されている1 。アルツハイマー病や他の一般的なタウオパシーとは異なり、CTEはその名の通り、脳の外傷の病歴と密接に関連していると言えます。接触したスポーツアスリートでは、ボクサーやフットボールの選手、軍用退役軍人のようなもの2,3,4,5。それは頭に繰り返し震えと副交渉の打撃によって開始されると考えられています。患者は、アルツハイマー病、前頭側頭と重複する認知機能障害、気分および行動変化、および運動障害などの症状および徴候を示すことがある認知症、レヴィー小体認知症、およびパーキンソン病6 。対照的に、脳組織の死後検査は、皮質溝の深さにある小血管周囲の過剰リン酸化タウ蓄積の明確なパターンを示し、他の変性状態では見られない病理学的特徴である7 。しかしながら、これまでのところ、疾患発現につながる病因についてはほとんど知られていない。これは大部分が忠実な動物モデルが欠如していることに起因しており、最近ではげっ歯類モデルが作成されたばかりです5,8。これらのモデル生物は、費用重視のケアおよび比較的長い寿命の欠点を有し、神経変性疾患研究にはあまり適していない。
哺乳動物のそれと比較して、 ショウジョウバエなどの無脊椎動物は費用対効果の高いメンテナンスを備えた優れた代替品であり、遺伝的決定因子を解剖するための広範なツール、および比較的短い寿命9 。注目すべきことに、ハエとヒトの脳は、進化的に保存された分子および細胞経路、ならびに解剖学的類似点を共有している10,11,12。外傷性脳損傷を研究するための2つの巧妙なショウジョウバエモデルが以前に報告されている13,14 。 Katzenbergerらによって設計された最初の "High Impact Trauma"（HIT）装置は、金属ばね13,15の自由端に結合されたプラスチックバイアル内に自由に動く飛行機を含んでいた。プラスチック製のバイアルを直立させて離したときに、ポリウレタン製のパッドに当たって、バイアルの壁に跳ね返り、跳ね返りながら飛行機に外傷を与えました。対照的に、Barekatらは、異なる送達方法を設計したOmni Bead Ruptor-24ホモジナイザープラットフォーム14を用いて行った 。ハエはCO 2で不能化され、ホモジナイザーに固定された2mLスクリューキャップ管に入れられ、予めプログラムされた振盪条件に供された。組織ホモジナイザーシステムを使用することの1つの利点は、実験者が傷害の強度、傷害の持続時間、および傷害の回数を調節することができることである。しかし、両方のレジームにも同じ欠点があります。頭部への一次損傷は、インパクトの場所と強度に関してランダムに影響を受けます。さらに、両方の方法は、身体および内臓の他の部分への必然的な副次的損傷によって引き起こされる、かなりの死亡をもたらした。ここでは、ミバエのmTBIを誘導する新規な方法を説明する。私たちの装置は、ガス推進弾道衝撃子で構成されています。既存のショウジョウバエのモデル14,15と比較すると、本発明者らの方法は、meas自由に動くフライヘッドのみに向けることができるので、衝撃の重大性、衝撃の時間間隔、持続する衝撃の総数などの様々な要因を正確に制御することができます。
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Protocol
ストライク装置の組み立て（ 図1 ）
- プランジャーを1mLツベルクリンシリンジから取り出します。 1 mLのマークでバレルをカットします。
- 200μLのピペットチップからエアロゾルバリヤ（高さ3mm×直径4mm）を取り外し、インパクタとして使用する。インパクターをシリンジバレルの内側に置きます。ゆっくりとバレルをタップしてインパクターを先端に移動させ、平らな面がノズルの開口部を覆うようにします。
- ショウジョウバエ麻酔ステーションの二酸化炭素（CO 2 ）フローレギュレーターに接続されているプラスチックチューブにバレルの先端を取り付けます。
- バレルを垂直に持ち、インパクタがバレルの底にとどまるように標準のクランプホルダースタンドにクランプします。
- 200μlのピペットチップをフライホルダーに変更します。
- 先端から4 mmをカットして直径0.8 mmの開口部を作り、フライヘッドのみを露出させます。
注：thoレックスとフライボディーの他の部分はピペットチップの内側に留まります。
- 先端から4 mmをカットして直径0.8 mmの開口部を作り、フライヘッドのみを露出させます。
- 1000μLピペットチップと1 mLシリンジ針キャップを変更してコネクターを作成します。
- 先端の開口部から44mmの位置で切断します。 1ミリリットルシリンジ針キャップの長さを6 mmにして、1,000μLピペットチップの残りの部分にしっかりと押し込みます。
2.ストライク装置の動作
- フライパッドにCO 2を使用して、 2日齢の成人女性フライを麻酔する。
- 細かい筆を使って軽くフライホルダーに移してください。フライヘッドが先端の外側に見えるように、ホルダーを静かにタップします。フライ・プローブがチップの外側に露出している場合は、鈍い1mLシリンジ・ニードルでチップの内側に静かに戻します。
注：フライポイコスをホルダーの内側に入れてください。さもなければ、ハエは吸う胸部の傷害によって死ぬかもしれない。 - フライホーを締めなさいフライヘッドが下向きになるように、コネクターでシリンジバレルに接続してください。
- ガス圧を100 kPaに設定します。実験計画に従って流量を調整する。
- インパクタがフライヘッドを一度叩くように、フローレギュレータのトグルスイッチを素早くオン/オフします。
- フライホルダーを持ち上げ、フライパッドの上に移動します。フライホルダーを逆さまにして軽く飛ばして、フライを出す。空のバイアルにフライを入れて回復させる。
3.ビデオ支援移動追跡
- トラッキングアリーナを作るために、直径6cmのペトリ皿に透明なシリコンエラストマーを充填する。シリコンとフライパンの間に3mmのスペースを空けて、ハエが自由に歩いて飛行することができます。
- 毎回擬似群または治療群のいずれかから4匹のハエを麻酔し、それらをアリーナに入れる。フライを22℃で1時間放置する。
- アリーナの上に電荷結合素子（CCD）カメラを置き、5分間記録する。
- Ctraxソフトウェア（Caltechから自由に入手可能）を使用して、記録された移動軌跡を分析します。トラッキングされたデータをプログラミング言語（Matlabなど）互換の形式でエクスポートし、フレームあたりの移動距離に基づいてデータを分析します。各フライの平均歩行距離を計算し、それを他のすべての記録されたフライ/グループと組み合わせて、同じグループ内のファイルの集団が移動した平均累積距離を得る。
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Representative Results
成体ショウジョウバエを使用してCTEモデルを確立するために、私たちは単一の閉鎖頭傷害を与える際の装置の有効性を判断した。遺伝子型、性別、年齢に関するバリエーションを排除するために、我々は実験で2日齢のCanton-S WT雌ハエを使用した。 100kPaの一定のガス圧でCO 2の流量を調節することによって、インパクターの強度を容易に制御することができた。最も高い流速（15L /分）で単一のストライクにさらされたハエは、最小の外部欠陥を示した（ 図2 ）。外部の眼および口の部分の両方が損なわれていないように見えた。それにもかかわらず、15L /分の流速は致命的であり、24時間以内に10％未満の生存率をもたらすことがわかった（ 図3A ）。対照的に、10または7.5L /分のストライキに曝露すると、それぞれ61.1％および96.3％の生存率が得られたが、5.0および2.5L /分の流速では、すべてのハエは生き残った24時間（ 図3A ）。したがって、我々は、5.0 L / minのCO 2流量に対して将来の研究を標準化した。 5.0L /分で1回ストライクした後、ハエは徐々に4分以内にその移動性を回復した（ 図3B ）。次の2日にわたって、歩行能力によって測定されたそれらの機関車の機能は、ゆっくりと正常に回復した（ 図3C ）。予備的評価として、これらの表現型は、脳卒中または軽度の外傷を経験した人々が提示した表現型を思い起こさせる18 。外傷性脳損傷を患っている患者は、しばしば、筋肉運動の進行性の悪化および早期死亡を呈している。
複数の脳傷害の長期間の影響を評価するために、5.0L /分の流速で5回の連続したストライクのmTBIプロトコールを適用し、各ストライキ間に24時間の回復期間を設けた。調査する mTBIが運動機能に及ぼす影響、我々は、フライモーターの挙動を解析するためのビデオ支援運動追跡システムを使用した。処理後のハエ20日後に、mTBI処置群は、偽群と比較して減少した歩行活動および移動距離を示した（ 図 4A および B ;偽群：6.49±0.72、n = 28対処置群：4.3± 0.47、n = 32; p <0.05）。反復脳損傷が生存に何らかの慢性的影響を有するかどうかを調べるために、我々はmTBIプロトコルに耐えたハエの寿命を決定した。 図4Cに示すように、シャム群（n = 129）と比較して、処理されたハエ（n = 100）は平均寿命（36.9±2.7V、26.3±0.9d） 34.7±1.4d）。
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図1 。ストライクデバイスの図。この装置は、1）200μLのピペットチップ、2）1mLのツベルクリンシリンジ、3）インパクター、4） ショウジョウバエ麻酔ステーションに接続された連結チューブ、および5）先端を締めるためのコネクター注射器上に置く。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 軽度閉鎖頭部外傷最も高いガス流量での1回の打撃は、頭部、身体または付属器に明白な外的損傷を与えなかった。 （ A ＆B ）打撃を受けたフライ。 （ C ＆ D ）シャムフライ。偽ハエは、CO 2流を適用したときにインパクタがシリンジバレル内に配置されていないことを除いて、フライホルダーの上および下の移送を含む処置群と全く同じ手順を受けた。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3 単一のストライクの効果。 （ A ）ストライキ後24時間以内に生存したハエのパーセンテージで定義される24時間の生存指数（SI 24 ）をガス流量に対してグラフ化する。 5.0L /分のガス流で1回打たれたハエは、4分で（ B ）、それらの移動性は2日間（ C）にゆっくりと正常に回復した。エラーバー、平均の標準誤差（SEM）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4 ショウジョウバエ におけるmTBIモデルの開発 。 5日間にわたる繰り返しのストライキは、歩行活動（ A＆B ）が著しく損なわれ、寿命が短くなった（ C ）。 4つの擬似および処理されたハエに対して5分間にわたって記録された代表的な歩行軌道は、A.エラーバー、SEMに示されている。 * p <0.05、ボンフェローニ補正によるマンホイットニーU検定。総ハエ：処置群n = 100、擬似群n = 129 です。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
神経生理学的変化、神経病理学的特徴、および神経行動障害を含むCTEの特徴を忠実にモデル化する動物モデルは、疾患メカニズムの解明および診断および治療標的の開発に不可欠である。臨床的に関連するすべてのエンドポイントを模倣するのに、ヒト疾患の動物モデルは完全ではないことは理解できる。しかし、堅牢なCTEモデルは、次の3つの要件を満たす必要があると考えています。（1）頭皮に頭皮保護と頭蓋保護を施した頭部に直接的に衝撃を与えなければならない。 （2）衝突の際にヘッドを固定しないでください。急速な加減速や回転や直線的なヘッドの動きが許されます。 （3）実験デザインには、単回および反復レジメンの両方が含まれていなければならず、その影響は、組織浮腫、挫傷、または率直な出血などの目に見える損傷を与えることなく、本来軽度でなければならない。
ウーフルーツフライモデルは、ハエ13,14,15の外傷性脳損傷を引き起こす他の方法とは区別される。 Bead RuptorモデルとHIT装置の両方が、ランダムな衝撃位置と強度で怪我を負わせます。どちらの方法においても、標準的なプラスチック製バイアルまたは2mLスクリューキャップチューブに入っている可変数のハエが容器壁に接触し、各打撃または怪我の際に複数回リバウンドする。ハエはコンテナ内で自由に動くことができるので、身体および/または頭部の異なる部分が異なる力で傷ついているため、個々のハエの主な損傷はかなり異なる。したがって、これらのモデルを用いて、腸の障壁機能不全に悩まされたハエは驚くべきことではない。これは両レジメン13,14における死亡率と直接相関があり、n両系における外傷誘発死の原因となった。対照的に、本発明者らの方法は、直接頭部衝撃を同じ場所に繰り返し与えることができる。身体はあらゆる直接的な被ばくから保護されており、身体の他の部分や内臓の損傷によって死が引き起こされる可能性があるという警告を排除しています。さらに、重量を推進するために使用されるCO 2ガスの流量は、制御された、調整可能な強度を達成するように調整することができる。最も重要なことに、フライヘッドはストライキ時に制約を受けず、人口で発生するmTBIの最も一般的な形態を模倣する非常に速い加速 - 減速プロセスを可能にします19 。
CO 2流量調整器を制御するための自動オン/オフスイッチを設置することは理想的ですが、現在の手動スイッチはインパクタ力の再現性に影響を与えていないようですインパクタが頭部に当たるとすぐに力がかかります。
要約すると、私たちのシステムは、CTEをモデル化するための新しいプラットフォームを導入し、mTBIをよりよく模倣するための新しい体制を提供します。他のショウジョウバエのモデルと同様に、ヒト神経変性疾患の解読に価値があることが判明している9,20。ニューロンの喪失、タウリン高リン酸化、TDP-43タンパク質病、およびmTBIに罹患した神経炎症反応の観点からモデルの詳細な特性評価が行われることが予想されるCTEの病気のプロセスに重要な機械的な洞察をもたらし、この分野のいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。
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Disclosures
この研究は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部の教員スタートアップファンドであるLC
Acknowledgments
著者は何も開示することはない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
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