Summary
Здесь мы описываем новый подход к травмированию черепно-мозговой травмы головного мозга у Drosophila melanogaster . Наш метод имеет то преимущество, что он обеспечивает непосредственную доставку повторяющихся ударов с регулируемой прочностью только на голову. Дальнейшее исследование беспозвоночной системы поможет осветить патогенез хронической травматической энцефалопатии.
Abstract
Хроническая травматическая энцефалопатия (CTE) представляет собой установленное нейродегенеративное заболевание, которое тесно связано с воздействием повторяющейся легкой травматической травмы головного мозга (mTBI). Механизмы, ответственные за его сложные патологические изменения, остаются в значительной степени неуловимыми, несмотря на недавний консенсус по определению невропатологических критериев. Здесь мы описываем новый метод разработки модели CTE у Drosophila melanogaster ( Drosophila ) в попытке идентифицировать ключевые гены и пути, которые приводят к характерному гиперфосфорилированному накоплению тау и гибели нейронов в головном мозге. Удары с регулируемой силой для нанесения мягкой закрытой травмы доставляются непосредственно на головку мухи, подвергая головку быстрое ускорение и замедление. Наш метод устраняет потенциальные проблемы, присущие другим моделям TROBI Drosophila ( например, смерть животных может быть вызвана повреждениемДругие части тела или внутренние органы). Менее трудоемкий и дорогостоящий уход за животными, короткая продолжительность жизни и обширные генетические инструменты делают плод идеальной для изучения патогенеза СТЭ и позволяют проводить крупномасштабные генетические и фармакологические экраны с геномом. Мы ожидаем, что текущая характеристика модели будет иметь важное механическое представление о профилактике заболеваний и терапевтических подходах.
Introduction
Хроническая травматическая энцефалопатия (КТР) недавно была признана явным нейродегенеративным расстройством, отделенным от других тауопатий, таких как болезнь Альцгеймера 1 . В отличие от болезни Альцгеймера и других распространенных тауопатий, наиболее важными факторами риска которых являются возраст возраста и семейная история деменции, CTE, как указано по его названию, подразумевает тесную связь с историей травм мозга, скорее всего, у спортсменов-контактных спортсменов, Таких как боксеры и футболисты, а также военные ветераны 2 , 3 , 4 , 5 . Считается, что он инициируется повторными ударными и сухожильными ударами по голове. Пациенты могут проявлять симптомы и признаки, такие как когнитивный дефицит, изменения настроения и поведения и дисфункция движения, которые значительно перекрываются с болезнью Альцгеймера,Деменция, деменция тела Льюи и болезнь Паркинсона 6 . Напротив, посмертные исследования ткани головного мозга выявляют четкую картину гиперфосфорилированного накопления тау, окружающего небольшие кровеносные сосуды на глубинах корковых сосудов, патогномоническую особенность, не наблюдаемую в других дегенеративных условиях 7 . Однако до сих пор очень мало известно о патогенезе, ведущем к проявлению болезни. Это во многом связано с отсутствием верной модели на животных - только недавно были созданы модели грызунов 5 , 8 . У этих модельных организмов есть недостатки дорогостоящего ухода и относительно длительный срок службы, которые не подходят для исследований нейродегенеративных заболеваний.
По сравнению с аналогами млекопитающих беспозвоночные животные, такие как Drosophila, являются отличной альтернативой, с их экономически эффективным обслуживанием,Обширные инструменты для рассечения генетических детерминант и относительно короткий срок службы 9 . Примечательно, что муха и человеческий мозг разделяют эволюционно сохраняющиеся молекулярные и клеточные пути, а также анатомические сходства 10 , 11 , 12 . Ранее сообщалось о двух гениальных моделях Drosophila для изучения травматической черепно-мозговой травмы 13 , 14 . Первое устройство «High Impact Trauma» (HIT), разработанное Катценбергером и коллегами, содержало свободно движущиеся мухи в пластиковом флаконе, который был привязан к свободному концу металлической пружины 13 , 15 . Когда пластиковый флакон был повернут вертикально и выпущен, он попал на полиуретановую подушечку и передал муравьям, когда они отскочили к стене флакона и отскочили. Напротив, Барекат и его коллеги разработали другой способ доставки насНа платформе гомогенизатора Omni Bead Ruptor-24 14 . Мухи были выведены из строя с CO 2 и помещены в 2-миллилитровую отвертку, которая была прикреплена к гомогенизатору и подвергнута предварительно запрограммированным условиям встряхивания. Одним из преимуществ использования системы тканевого гомогенизатора является то, что экспериментатор может модулировать интенсивность травм, продолжительность травмы и количество травм. Тем не менее, оба режима имеют такой же недостаток: первичные травмы головы случайным образом определяются с точки зрения местоположения и силы удара. Кроме того, оба метода привели к значительной смертности, вызванной неизбежным побочным повреждением других частей тела и внутренних органов. Здесь мы описываем новый метод индуцирования mTBI у плодовых мух. Наш аппарат состоит из газового баллистического ударника. По сравнению с существующими моделями 14 , 15 Drosophila , наш метод имеет уникальное преимущество -С уловимым воздействием, направленным только на свободно движущуюся головку летательного аппарата, что позволяет точно контролировать различные факторы, такие как тяжесть удара, временной интервал между воздействиями и общее количество ударов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сборка ударного устройства ( рисунок 1 )
- Удалите плунжер из 1 мл туберкулинового шприца. Отрежьте ствол с отметкой 1 мл.
- Удалите аэрозольный барьер (диаметр 3 мм х 4 мм) из наконечника пипетки 200 мкл и используйте его в качестве импактора. Поместите импактор внутрь ствола шприца. Аккуратно надавите на ствол, чтобы переместить ударный элемент на наконечник, при этом плоская сторона закрывает отверстие сопла.
- Прикрепите конец наконечника бочки к пластиковой трубке, которая подключена к регулятору потока двуокиси углерода (CO 2 ) станции анестезии Drosophila .
- Держите ствол вертикально и закрепите его до стандартной стойки держателя для фиксации, чтобы ударник находился на дне ствола.
- Измените наконечник пипетки 200 мкл, чтобы сделать держатель мух.
- Отрежьте 4 мм от наконечника, чтобы открыть отверстие диаметром 0,8 мм, позволяя открывать только головку мухи.
ПРИМЕЧАНИЕ.Rax и все остальные части тела мухи останутся внутри наконечника пипетки.
- Отрежьте 4 мм от наконечника, чтобы открыть отверстие диаметром 0,8 мм, позволяя открывать только головку мухи.
- Измените наконечник пипетки объемом 1000 мкл и 1 мл колпачка иглы для шприца, чтобы сделать разъем.
- Отрежьте 44 мм от отверстия наконечника. Возьмите 6-миллиметровую длину 1 мл колпачка иглы шприца и плотно вставьте его в оставшийся участок наконечника пипетки 1000 мкл.
2. Эксплуатация ударного устройства
- Анестезируйте одну 2-дневную взрослую взрослую женщину, используя CO 2 на подушке.
- Аккуратно передайте его держателю мух тонкой кистью. Аккуратно коснитесь держателя так, чтобы головка мух была видна вне кончика. Если хобот мухи обнажен снаружи наконечника, аккуратно засуньте его обратно внутрь наконечника с затупленной иглой шприца 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Обязательно держите хоботок мухи внутри держателя. В противном случае, муха может умереть от сосания хобота. - Затяните муху hoК шприцу с соединителем, чтобы головка мухи обращена вниз.
- Установите давление газа при 100 кПа. Отрегулируйте расход в соответствии с проектом эксперимента.
- Быстро включите и выключите переключатель тумблера регулятора расхода, чтобы ударный элемент ударил голову мухи один раз.
- Поднимите держатель мухи и переместите его над подушкой. Отрежьте держатель мух и аккуратно коснитесь стороны, чтобы вылететь. Оставьте муху в пустой флакон, чтобы восстановиться.
3. Отслеживание движения с помощью видео
- Заполните чашку Петри диаметром 6 см прозрачным силиконовым эластомером, чтобы сделать площадку для отслеживания. Оставьте 3-миллиметровое пространство между кремнием и крышкой чашки, чтобы позволить мухам свободно ходить, но не летать.
- Анестезируйте четырех мух из любой обманутой или обработанной группы каждый раз и поместите их на арену. Оставьте мухи при 22 ° C в течение 1 часа.
- Поместите камеру с зарядовой связью (CCD) над аренами и запишите в течение 5 минут.
- Проанализируйте записанные траектории движения с использованием программного обеспечения Ctrax (свободно доступно от Caltech) 16 . Экспортировать отслеживаемые данные на языке программирования (например, Matlab) и сопоставлять данные на основе пройденного расстояния на кадр 17 . Вычислите среднее расстояние ходьбы для каждой мухи и объедините его со всеми другими зарегистрированными мухами / группой, чтобы получить среднее кумулятивное расстояние, пройденное популяцией файлов в той же группе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы установить модель CTE с использованием взрослого дрозофилы , мы определили эффективность нашего устройства при нанесении одной травмы с закрытой головкой. Чтобы устранить вариации, связанные с генотипом, полом или возрастом, в эксперименте мы использовали 2-дневные мушки-женщины Canton-S WT. Мы могли бы легко контролировать прочность ударного элемента, регулируя расход CO 2 при постоянном давлении газа 100 кПа. Мухи, подвергшиеся воздействию одного удара при максимальной скорости потока (15 л / мин), проявили минимальные внешние дефекты ( рис. 2 ). И внешние глаза, и рот были неповрежденными. Тем не менее, мы обнаружили, что скорость потока 15 л / мин была очень смертельной, что привело к менее чем 10% выживаемости в течение 24 ч ( фиг.3А ). Напротив, воздействие удара 10 или 7,5 л / мин приводило к выживаемости 61,1% и 96,3%, соответственно, при скорости потока 5,0 и 2,5 л / мин, все мухи выживали на кормеEr 24 ч ( рисунок 3A ). Поэтому мы стандартизировали наши будущие исследования на скорость потока CO 2 5,0 л / мин. После одного удара со скоростью 5,0 л / мин мухи постепенно восстанавливали свою подвижность в течение 4 мин ( рис. 3В ). В течение следующих 2 дней их локомотивная функция, измеренная ходячей способностью, медленно восстанавливается до нормального уровня ( рис. 3C ). В качестве предварительной оценки эти фенотипы напоминают те, которые представлены людьми, которые испытали сотрясение мозга или умеренный уровень травмы 18 . Пациенты, страдающие черепно-мозговой травмой, часто проявляют прогрессирующее ухудшение мышечных движений и преждевременную смерть.
Чтобы оценить долгосрочные последствия множественных травм головного мозга, мы применили протокол mTBI с пятью последовательными ударами при скорости потока 5,0 л / мин, с 24-часовым периодом восстановления между каждым ударом. Расследовать E влияние mTBI на функцию движения, мы использовали систему отслеживания движения с помощью видеосигнала для анализа поведения двигателя мотора. После старения мухи 20 d после обработки группа, обработанная mTBI, продемонстрировала снижение активности ходьбе и пройденное расстояние по сравнению с группой фиктивных групп ( фиг. 4 A & B ; группа «sham»: 6,49 ± 0,72, n = 28 по сравнению с обработанной группой: 4,3 ± 0,47, n = 32, p <0,05). Чтобы исследовать, имеют ли повторяющиеся повреждения мозга какие-либо хронические эффекты на выживание, мы определили продолжительность жизни мух, которые переносили протокол mTBI. На рис. 4C , по сравнению с группой фиктивных (n = 129), обработанные мухи (n = 100) имели существенно уменьшенный средний срок службы (36,9 ± 2,7 против 26,3 ± 0,9 d) и значительно сократили максимальный срок службы (49,3 ± 2,4 Против 34,7 ± 1,4 д).
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55602 / 55602fig1.jpg "/>
Рисунок 1 . Схема ударного устройства. В устройстве использовались материалы, которые легко доступны в лаборатории Drosophila : 1) 200 мкл пипетки, 2) 1 мл туберкулиновый шприц, 3) импактор, 4) соединительная трубка, прикрепленная к станции анестезии Drosophila , и 5) разъем для затягивания наконечника На шприц. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 . Мягкая травма травмы головы. Один единственный удар при самом высоком потоке газа не повлек за собой очевидного внешнего повреждения головы, тела или придатков. ( A &B ) Удар, нанесенный ударом. ( C & D ) Sham fly. Лживые мухи подвергались точно таким же процедурам, как и обработанная группа, включая перенос на держатель мухи и за ее пределами, за исключением того, что в шприцевом шприце не было нанесено ударное воздействие, когда применялся поток CO 2 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 . Эффект одиночного удара. ( A ) Показатель выживаемости через 24 часа (SI 24 ), определяемый процентом мух, который выжил в течение 24 часов после удара, был составлен по сравнению с расходом газа. Мухи, которые были поражены один раз, с потоком газа 5,0 л / мин, восстановили локомоторную активность с помощьюВ течение 4 мин ( В ), и их подвижность медленно восстанавливалась до нормы в течение 2 дней ( С) . Ошибка, стандартная ошибка среднего (SEM). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 . Разработка модели mTBI у дрозофилы . Повторные удары в течение пяти дней приводили к значительному нарушению двигательной активности ( A & B ) и сокращению продолжительности жизни ( C ). Репрезентативные дорожки для ходьбы, записанные в течение 5 минут, для 4 обмана и обработанных мух показаны в A. Шкалы ошибок, SEM. * P <0,05, U-тест Манна-Уитни с коррекцией Бонферрони. Всего мух: обработанная группа n = 100, фиктивная группаN = 129. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модели животных, которые добросовестно моделируют функции CTE, включая нейрофизиологические изменения, невропатологические признаки и нейробиологические дефициты, необходимы для выявления механизмов заболевания и для разработки диагностических и терапевтических целей. Понятно, что ни одна животная модель болезни человека не идеальна для имитации всех клинически значимых конечных точек. Однако мы считаем, что надежная модель CTE должна удовлетворять трем трем требованиям: (1) воздействие должно быть непосредственно применено к голове, которая имеет неповрежденную защиту головы и черепа; (2) головку не следует фиксировать во время воздействия удара, чтобы допускалось быстрое ускорение-замедление и вращательные и линейные движения головы; И (3) экспериментальная конструкция должна включать как одиночные, так и повторяющиеся режимы, а последствия воздействия должны быть мягкими по своей природе, без нанесения видимых повреждений, таких как отек тканей, ушиб или откровенное кровоизлияние.
ОУR fruit fly отличается от других методов, которые приводят к травматической черепно-мозговой травме у мух 13 , 14 , 15 . Модель Bead Ruptor и устройство HIT наносят урон случайному удару и силе. В обоих методах переменное количество мух, содержащихся либо в стандартном пластиковом флаконе, либо в 2-миллилитровой винтовой трубке, соприкасается с стенкой контейнера и отскакивает несколько раз во время каждого удара или травмы. Поскольку мухи свободно перемещаются внутри контейнера, первичные травмы значительно различаются для отдельных мух, так как разные части их тел и / или головы повреждаются разными силами. Таким образом, неудивительно, что, используя эти модели, мухи страдали от дисфункции кишечного барьера. Это напрямую коррелировало со смертностью в обеих схемах 13 , 14 , что сильно указывает на то, что nНа-нейрональные изменения отвечали за смерть, вызванную травмой, в обеих системах. Напротив, наш метод способен неоднократно наносить прямые удары головы в одно и то же место. Тело защищено от любого прямого воздействия, устраняя потенциальные оговорки о том, что смерть может быть вызвана повреждением других частей тела или внутренних органов. Кроме того, скорость потока газа CO 2, используемого для перемещения веса, может регулироваться для достижения контролируемой регулируемой прочности. Самое главное, что голова мух не ограничена во время удара, что позволяет очень быстро ускорить процесс замедления, который имитирует наиболее распространенную форму mTBI, которая встречается в человеческой популяции 19 .
Хотя было бы идеальным установить автоматический переключатель включения / выключения для управления регулятором расхода CO 2 , текущий ручной переключатель, по-видимому, не влияет на воспроизводимость силы удара, поскольку дизайн нашего устройства всеЭто сила, которую нужно быстро приложить, как только ударный удар ударит по голове.
Таким образом, наша система обеспечивает новый режим для лучшей имитации mTBI, представляя новую платформу для моделирования CTE. Как и другие модели Drosophila , которые оказались полезными при расшифровке нейродегенеративных нарушений человека 9 , 20 , предполагается, что текущая подробная характеристика модели с точки зрения потери нейронов, гиперфосфорилирования тау, протеопатии TDP-43 и нейровоспалительного ответа на нанесенный mTBI будет Генерировать важную механистическую информацию о процессах болезни CTE и поможет ответить на некоторые критические вопросы в этой области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была поддержана фондом запуска факультета медицины Университета Джона Хопкинса в LC
Acknowledgments
Авторам нечего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerosol Barrier | USA Scientific | 1120-8810 | Used as an impactor |
| 200 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1111-0706 | Used as a fly head holder |
| 1000 μL Pipette Tip | USA Scientific | 1122-1830 | Used as a connector |
| 1 mL Tuberculin Syringe | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | Used as a tracking arenas |
| Flow Regulator | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standard Clamp Holder/stand | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Fine Brush | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATLAB | R2015b |
References
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
- Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
- Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
- Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
- Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407 (2013).
- McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
- Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
- Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
- Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252 (2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
- Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).
